Niewirusowa terapia genowa daje nadzieję na leczenie przewlekłego bólu pleców

W niedawnym badaniu opublikowanym w czasopiśmie Biomaterials naukowcy opracowali nowatorską, niewirusową terapię genową, mającą na celu leczenie dyskogennego bólu pleców (DBP) poprzez podanie czynnika transkrypcyjnego Forkhead Box F1 (FOXF1) za pomocą zmodyfikowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (eEV) do zwyrodnieniowych krążków międzykręgowych (IVD) in vivo.

Przewlekły ból dolnej części pleców (LBP) to rosnący globalny problem ze względu na starzenie się populacji i pogarszające się problemy z opioidami. Obecne metody leczenia obejmują krótkotrwałą ulgę lub drogie operacje, co podkreśla potrzebę nieuzależniających i mniej inwazyjnych terapii.

Obecne podejścia biologiczne, w tym podawanie czynników wzrostu, terapia komórkowa i wirusowa terapia genowa, mogą zmniejszyć degenerację w modelach zwierzęcych i ludzkich. Jednak kwestie takie jak krótkotrwałe skutki, słaba długoterminowa skuteczność oraz niepotrzebna immunogenność i onkogenność mogą utrudniać bezpośrednie zastosowanie tych podejść.

W tym badaniu naukowcy opracowali niewirusową terapię genową dla zwyrodnienia krążka międzykręgowego (IVD) przy użyciu FOXF1-eEV.

Naukowcy dokonali transfekcji pierwotnych mysich fibroblastów zarodkowych (PMEF) plazmidami zawierającymi FOXF1 lub pCMV6 jako kontrolę i scharakteryzowali próbki eEV przy użyciu testu śledzenia nanocząstek (NTA).

Ocenili oni efektywne ładowanie ładunku molekularnego do eEV przy użyciu ilościowej odwrotnej transkrypcji-łańcuchowej reakcji polimerazy (qRT-PCR) i konwencjonalnej PCR. Analiza Western blot zidentyfikowała białka specyficzne dla FOXF1 i EV w formacjach eEV. Zespół użył plazmidów, które wzmacniają górne i dolne regiony polilinkera, aby określić obecność DNA plazmidu FOXF1 w komórkach dawcy i wygenerował eEV.

Przebadali pełnowymiarowe mRNA wytworzone z DNA plazmidowego w eEV i komórkach dawcy.

Naukowcy stworzyli pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z czynnikami transkrypcyjnymi, aby przywrócić funkcję tkanek i zmienić reakcje bólowe w zwierzęcym modelu DBP.

Zidentyfikowano pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) służące do transportu i dystrybucji FOXF1 do uszkodzonych krążków międzykręgowych w mysim modelu bólu pleców pochodzenia dyskogenicznego, aby określić hamowanie zwyrodnienia krążków międzykręgowych przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) FOXF1.

Zespół połączył badania biomechaniczne krążków międzykręgowych u myszy z obrazowaniem, zmianami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz reakcjami bólowymi ocenianymi po 12 tygodniach, aby potwierdzić zmiany w strukturze i funkcji, a także ból wywołany interwencją terapeutyczną.

Ocena bólu przedoperacyjnego i pooperacyjnego obejmowała mikrotomografię komputerową (mikro-CT), obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), testy mechaniczne, barwienie błękitem Alcian (AB) i czerwienią pikrosiriusową (PSR), test błękitem dimetylometylenowym oraz immunohistochemię (IHC).

W badaniu zastosowano technikę chirurgiczną, w ramach której naukowcy podawali myszom buprenorfinę ER podskórnie w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.

Zespół przeprowadził ocenę zachowania przed operacją oraz co dwa tygodnie od czterech do dwunastu tygodni po operacji, stosując różne metody, w tym test otwartego pola, zimną płytę, zawieszenie za ogon i zawieszenie na drucie.

Test w otwartym polu oceniał spontaniczną aktywność myszy; testy z zimną płytą mierzyły hiperalgezję termiczną; testy podwieszania za ogon mierzyły ból osiowy; a testy podwieszania za drutem mierzyły siłę.

Dwanaście tygodni po operacji zespół dokonał sekcji kręgosłupa lędźwiowego zwierząt, wykorzystując śledzenie nerwu udowego i tętnicy, aby zidentyfikować krążki międzykręgowe między L4 i L5, L5 i L6 oraz L6 i S1 IVD. Użyli L5/L6 IVD, aby ocenić histologię i określić zawartość glikozaminoglikanów (GAG).

W przypadku krążków międzykręgowych eEV firmy FOXF1 nastąpiło znaczące zmniejszenie reakcji bólowych oraz przywrócenie struktury i funkcji krążka międzykręgowego, w tym poprawa wysokości dysku, nawodnienia tkanek, zawartości proteoglikanów i właściwości mechanicznych.

Badanie skupiło się na uwalnianiu eEV obciążonych FOXF1 z pierwotnych fibroblastów transfekowanych czynnikiem transkrypcyjnym FOXF1. Ilościowa RT PCR wykazała istotny wzrost poziomów transkryptów mRNA FOXF1 i poziomów pełnej długości transkrybowanego mRNA FOXF1 w porównaniu z komórkami transfekowanymi pCMV6.

Terapia FOXF1 eEV może zmniejszyć reakcje bólowe w modelu nakłucia dysku lędźwiowego u myszy przez okres do 12 tygodni. Samice myszy wykazywały dłuższy czas trwania napadów w grupie leczonej FOXF1 niż w grupie z urazem, który trwał co najmniej 12 tygodni po leczeniu.

Terapia FOXF1 eEV poprawiła nawodnienie tkanek dysku międzykręgowego oraz wysokość u zwierząt z urazami i zwyrodnieniami in vivo, przy jednoczesnym utrzymaniu poziomu nawodnienia oraz intensywności obrazu T2-zależnego dysku międzykręgowego.

Jednakże zespół zaobserwował zmniejszenie wysokości dysku u zwierząt z urazami i zwierząt leczonych pCMV6 eEV. Myszy leczone FOXF1 eEV nie miały zmniejszenia wysokości dysku 12 tygodni po leczeniu. Płeć nie miała wpływu na wyniki funkcjonalne.

FOXF1 eEV przywróciły funkcję mechaniczną uszkodzonych i zdegenerowanych IVD in vivo. Pod wpływem naprężenia osiowego, IVD leczone FOXF1 eEV wykazały wyższą znormalizowaną sztywność NZ w porównaniu do uszkodzonych IVD.

W warunkach pełzania uszkodzone krążki międzykręgowe wykazywały zwiększone znormalizowane przemieszczenia pełzania, co wskazuje na zmniejszenie znormalizowanej sprężystości pełzania.

Wyniki pokazują, że obniżenie zawartości GAG w uszkodzonych krążkach międzykręgowych zwiększa elastyczność mechaniczną, a terapia eEV zapobiega utracie glikozaminoglikanów i późniejszym zmianom funkcji mechanicznej.

Wirusy eEV FOXF1 wywołały zmiany strukturalne i funkcjonalne w dysku międzykręgowym poprzez zwiększenie poziomu proteoglikanu i GAG.

Wyniki badania wykazały, że eEV zawierające czynniki transkrypcyjne wspomagające rozwój mogą leczyć bolesne choroby stawów, takie jak DBP, poprzez dostarczanie tych czynników transkrypcyjnych do stawów zwyrodnieniowych i bolesnych za pomocą wszczepu do kości.

Strategia ta może pomóc w zmniejszeniu strukturalnych i funkcjonalnych nieprawidłowości wywołanych przez chorobę oraz w regulacji reakcji bólowych w sposób zależny od płci.

Naukowcy zalecili również stosowanie czynników transkrypcji rozwojowej, takich jak FOXF1, aby przesunąć degeneracyjne komórki NP w stan proanaboliczny in vivo. Potrzebne są dalsze badania, aby określić jego skuteczność terapeutyczną.