Prace eksperymentalne nad przeszczepianiem allogenicznych keratynocytów na sztucznie utworzone blizny białych szczurów

Chęć wykorzystania potencjału komórkowego i potrzeba znalezienia nowych, skutecznych metod poprawy wyglądu estetycznego blizn skłoniły do podjęcia próby zbadania możliwości przeszczepienia keratynocytów na powierzchnię blizny.

Aby udowodnić prawdopodobieństwo wykorzystania hodowli keratynocytów do poprawy wyglądu blizn, przeprowadzono badanie eksperymentalne na białych szczurach laboratoryjnych, na których stworzono powierzchnie blizn. Model blizny szczura uzyskano w wyniku gojenia się sztucznie zadanych ran na plecach, wzdłuż kręgosłupa. Szczurom wycięto identyczne kawałki skóry o wymiarach 2x3 cm. 2,5 miesiąca po zabiegu „modelowania blizny” szczury poddano dermabrazji (usunięcie górnych warstw blizny za pomocą termokaustyki) i przeszczepiono allogeniczne keratynocyty, wyizolowane ze skóry szczeniąt szczurów 2-4 dni po urodzeniu.

Izolację i hodowlę komórek naskórka szczura przeprowadzono w laboratorium technologii komórkowych Instytutu Cytologii Rosyjskiej Akademii Nauk, stosując następującą technologię.

Skórę myto w roztworze soli fizjologicznej Hanka zawierającym 200 U/ml gentamycyny i krojono na małe kawałki o powierzchni 0,2-0,5 cm2 ^. Kawałki skóry inkubowano w 0,5% roztworze dyspazy w zrównoważonym roztworze buforowanym fosforanem soli w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Następnie kawałki przenoszono do buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej Dulbecco, a naskórek oddzielano od skóry właściwej. Naskórek inkubowano w 0,125% roztworze trypsyny przez 10-15 minut, mieszając przy 50 obr./min, po czym działanie enzymu zatrzymywano, dodając 5% surowicy płodowej bydlęcej. Jedną trzecią otrzymanej zawiesiny komórek wykorzystano w czystej postaci do jednej z opcji przeszczepu na blizny, drugą trzecią hodowano na biokompatybilnych domowych powłokach filmowych „Polypor”, a trzecią - na płytkach Petriego bez podłoża. Zabieg dermabrazji powstałych blizn u szczurów z późniejszym przeszczepieniem komórek naskórka szczura przeprowadzono w znieczuleniu eterowym przy użyciu termicznej kauteryzacji.

W pierwszej grupie szczurów, po dermabrazji, na wypolerowaną, umytą roztworem fizjologicznym i osuszoną powierzchnię blizny położono sterylne kawałki batystu, na które nałożono wstrząśniętą zawiesinę allogenicznych epidermocytów szczura w stężeniu 1,5 mln komórek na 1 ml (wg Instytutu Cytologii). Kawałki batystu położono na wypolerowaną bliznę tak, aby komórki leżały na powierzchni blizny. Na wierzch położono bandaż z kilku warstw gazy, który przyszyto do brzegów blizny.

Część uzyskanej zawiesiny komórek wysiewano na szalki Petriego na sterylne folie Polypore przycięte do kształtu szalki, pozostałą część - na szalki Petriego bez folii. Hodowlę prowadzono w podłożu FAD, składającym się z mieszaniny podłoża DMEM i F12 w stosunku 3:1. z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej, 5 μg/ml insuliny (Sigma), 0,5 μg/ml hemisukcynianu hydrokortyzonu (Sigma). 10 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostu EGF (Instytut Cytologii RAS, Sankt Petersburg). Drugą i trzecią grupę szczurów, po 7 osobników, operowano 6 dni po pierwszej. W tym czasie z zawiesiny wysianych keratynocytów na szalkach Petriego uformowały się wielowarstwowe warstwy, które przeszczepiono szczurom. Drugą grupę przeszczepiono epidermocytami na folii, trzecią - warstwą wielowarstwową bez podłoża. Po 7 dniach otrzymane warstwy wielowarstwowe allogenicznych keratynocytów (MPALK), zasiane na foliach „Polypore”, przeszczepiono jako hodowlę bezpośrednio na powierzchnię rany. Na wierzch folię, aby uniknąć jej oderwania, utrwalono wielowarstwowym bandażem gazowym i przyszyto do skóry szczurów.

Przed przeszczepieniem keratynocytów do trzeciej grupy szczurów hodowanych bez podłoża, PAC oddzielono od dna szalki Petriego poprzez potraktowanie go dyspazą, która ma zdolność selektywnego rozrywania wiązań skórno-naskórkowych. Działając na warstwę wielowarstwową, dyspaza rozrywa połączenie komórek warstwy podstawnej z dnem szalki Petriego i ma znacznie mniejszy wpływ na połączenia międzykomórkowe, co umożliwia „usunięcie” warstwy w całości. Oderwanie warstwy wielowarstwowej za pomocą dyspazy przeprowadzono w następujący sposób. Medium transportowe odsączono z szalek Petriego, warstwy komórek przemyto trzykrotnie pożywką zawierającą antybiotyki, w szczególności gentamycynę (0,2 mg/ml). Warstwy wielowarstwowe wypełniono 0,125% roztworem dyspazy („Sigma”) i umieszczono w termostacie, gdzie inkubowano je w temperaturze t=37°C przez 20-30 minut. Pojawienie się białego obrzeża odchodzącego wzdłuż obwodu warstwy jest wskaźnikiem rozpoczęcia procesu jej oddzielania od brzegów i dna szalki Petriego. Kilka minut po rozpoczęciu procesu oddzielania roztwór dyspazy został odsączony, warstwy nabłonkowe przemyto medium 2-3 razy. Na powierzchnię warstwy naskórka nałożono kawałek jałowego opatrunku na ranę „Lita-color” przycięty do wielkości kubeczka, do którego przyklejono warstwę oddzieloną dyspazą, dodatkowo odklejoną od dna kubeczka szpatułką. Za pomocą pęsety do oczu warstwę wraz z powłoką serwetki „Lita-color” (Rosja) oderwano od dna szalki Petriego i ostrożnie przeniesiono na przygotowaną powierzchnię blizny. Serwetki „Lita-color” zawierają gentamycynę i eksolinę (ekstrakt kolagenowy), które po zwilżeniu resztkami pożywki, a następnie roztworem fizjologicznym, pęcznieją i stają się nowoczesnym opatrunkiem na rany, zapewniającym dobrą ochronę przed zakażeniem zewnętrznym i szybkie gojenie dzięki strukturze absorbującej wilgoć.

Na folie Polypore i serwetki Lita-color nałożono wielowarstwowe bandaże z gazy i przyszyto je do skóry szczurów w celu silniejszego utrwalenia. Każdego szczura umieszczono w oddzielnej klatce, aby stworzyć optymalne warunki do jego utrzymania i wszczepienia przeszczepionych keratynocytów. Bandaże szczurów, do których przeszczepiono zawiesinę i wielowarstwową warstwę epidermocytów pobranych metodą dyspazy, zwilżano sterylnym roztworem soli fizjologicznej kilka razy dziennie, aby stworzyć najbardziej sprzyjające warunki do wszczepienia komórek. Biorąc pod uwagę, że folia Polypore była nieprzepuszczalna dla wody, bandaże szczurów z drugiej grupy nie były zwilżane, co stanowiło jedną z zalet w porównaniu z przeszczepami bez folii. Bandaże usunięto po 10 dniach. Obraz kliniczny blizn po przeszczepie komórek niewiele różnił się od blizn bez przeszczepu, z wyjątkiem ich bardziej różowego koloru (spowodowanego dermabrazją) i większego złuszczania. Fakt ten sugeruje, że. że bezpośrednio po odpadnięciu opatrunków wraz z MPC nie zaszły żadne zmiany w bliznach.

Pobieranie materiału biopsyjnego od szczurów.

Po 1, 2, 5 i 9 miesiącach od przeszczepu allogenicznych keratynocytów szczura na wypolerowane blizny białych szczurów pobrano materiał do badania histologicznego, cytomorfologicznego i mikroskopowego elektronowego. Próbki normalnej skóry szczura i blizny bez przeszczepu komórek pobrano jako kontrolę. Znieczulenie szczurów wykonano za pomocą znieczulenia eterowego.

Po znieczuleniu pobrano fragmenty tkanki bliznowatej z zaznaczonych obszarów, do których przeszczepiono keratynocyty za pomocą 2 mm średnicy dziurkacza biopsyjnego i umieszczono w 2,5% roztworze glutaraldehydu, aby przygotować materiał do badania mikroskopem elektronowym. Fragmenty tkanki pobrane do badania histologicznego umieszczono w 10% obojętnym roztworze formaliny, a następnie przepuszczono przez alkohole i zatopiono w parafinie, a następnie pocięto na ultracienkie skrawki i obejrzano je w mikroskopie optycznym.

Kontrola I. Normalna skóra szczura.

Aby zobaczyć różnicę między mikroskopowym obrazem zdrowej skóry szczura ze zmienionymi bliznami a bliznami w pewnych okresach po przeszczepie MPC, na każdym etapie badania pokazano ich fotografie i opisy.

Naskórek normalnej skóry składa się z 7-9 warstw komórek. Warstwa rogowa jest średniej grubości. W niektórych miejscach składa się z 6-8 warstw rogowych łusek. Warstwa podstawna jest reprezentowana przez cylindryczne komórki z dużymi, lekkimi, regularnymi jądrami i kilkoma jąderkami. Połączenia desmosomalne między komórkami i z błoną podstawną są wyraźnie wyrażone. Pod dobrze zdefiniowaną błoną podstawną, która ma małe wyrostki w warstwie podnaskórkowej, równolegle do niej leżą delikatne wiązki włókien kolagenu i elastyny, wśród których są wydłużone fibroblasty, małe naczynia. W głębszych warstwach wiązki włókien kolagenu i elastyny leżą w różnych kierunkach. Wśród nich jest wiele naczyń o cienkich ścianach tego samego kalibru, elementy komórkowe (fibroblasty, komórki tuczne, leukocyty). Duża liczba mieszków włosowych, gruczołów łojowych.

Kontrola 2. Blizna po szczurze, 2 miesiące.

Obraz kliniczny. Blizny są bladoróżowe, złuszczające się, miejscami pozostają strupy. Ich powierzchnia zmniejszyła się wskutek kurczenia się włókien kolagenowych i wynosi około 3,0-3,5 cm ^:. Przydatki skóry są nieobecne.

Obraz mikroskopowy. Naskórek składa się z 3-5 warstw komórek, pofałdowanych, reprezentowanych przez zaokrąglone komórki podstawne, jeden rząd szydlastych, 1-2 rzędy ziarnistych z ziarnami keratohialiny w warstwie górnej, występują obszary obrzęku wewnątrzkomórkowego. Warstwa rogowa jest nierównomiernie zmieniona z bardzo cienkiej na pogrubioną. Obserwuje się fałdowanie bliznowate z powodu (kurczenia się) tkanki bliznowatej. Fałdy przenikają do warstwy brodawkowatej i tworzą wrażenie brodawek. Granica między naskórkiem a skórą właściwą jest linią prostą. Błona podstawna nie jest wszędzie wyśledzona. W dolnej części warstwy podnaskórkowej i głębszej znajdują się naczynia o grubej, rozluźnionej ścianie, wiele jest opuszczonych, ze zastojem. Wokół naczyń występuje nagromadzenie makrofagów, fibroblastów. Makrofagi otaczają erytrocyty uwolnione z naczyń włosowatych i fagocytują je. W bardziej powierzchownych warstwach znajdują się małe naczynia włosowate. Pod naskórkiem włókna kolagenowe są luźno ułożone. W głębszej warstwie blizny znajdują się grube wiązki włókien kolagenowych, wśród których jest wiele fibroblastów.

Blizna u szczura miesiąc po przeszczepie keratynocytów szczura.

Obraz kliniczny. Blizny są różowe, ich powierzchnia zmniejszyła się, szczególnie średnica, i wynosi średnio 2,5-3 cm2 ^. Włosy i gruczoły łojowe są nieobecne.

Dane z mikroskopowego badania materiału uzyskanego od szczurów z przeszczepem MPaLK na filmie i MPaLK bez podłoża są praktycznie identyczne. Jednak czysto technicznie praca z MPaLK bez podłoża jest znacznie bardziej skomplikowana i żmudna niż podczas hodowli MPaLK na podłożu, dlatego też, w dalszym badaniu zagadnienia przeszczepu keratynocytów do blizn, wykorzystaliśmy wielowarstwowy kambryk jako podstawę do hodowli („podłoża”).

Obraz mikroskopowy. Obserwuje się pogrubienie naskórka do 15-20 warstw, z których prawie do połowy keratynocyty mają wąski, wydłużony, pionowy kształt i zwarty układ. Komórki podstawne ułożone są w nierównej linii. Ich jądra są jasne, duże, zaokrąglone z jednym lub dwoma jąderkami, co wskazuje na ich wysoką aktywność syntetyczną i proliferacyjną. Granica między naskórkiem a skórą właściwą jest linią prostą. Warstwa kolczysta jest dobrze rozwinięta, składa się z 3-5 warstw zaokrąglonych komórek, występują komórki 2-jąderkowe.

Bezpośrednio pod błoną podstawną znajdują się gęsto ułożone cienkie wiązki włókien kolagenowych, równolegle do nich znajduje się duża liczba opuszczonych naczyń, głębiej włókna kolagenowe są grubsze, zebrane w gęste wiązki. Wiele dużych fibroblastów, komórek tucznych (2-3 w polu widzenia), makrofagów, leukocytów i opuszczonych naczyń, których ściany są rozluźnione, wokół nich znajdują się luźno ułożone włókna kolagenowe. W niektórych naczyniach występuje zastój, diapedeza uformowanych elementów. Wokół naczyń znajdują się fibroblasty, pojedyncze limfocyty. Przydatki skórne są nieobecne.

Podczas przeszczepiania zawiesiny keratynocytów na oszlifowaną bliznę obraz mikroskopowy różni się od poprzedniego. U większości zwierząt naskórek jest cienki i składa się z 5-6 warstw komórek. Dolna warstwa składa się z komórek o nieregularnym, wielokątnym kształcie z jądrami o kształcie okrągło-nieregularnym. Stan warstwy podnaskórkowej jest podobny do stanu w grupie zwierząt bez przeszczepu MPALK.

W tym przypadku możemy mówić albo o opóźnieniu procesów towarzyszących przeszczepowi komórek, albo o dużej utracie komórek przeszczepionych w formie zawiesiny. Stąd wniosek o niecelowości korekty blizny poprzez przeszczep keratynocytów w formie zawiesiny.

Blizna u szczura 2 miesiące po przeszczepie keratynocytów szczura.

Obraz kliniczny. Blizna wygląda na cienką i delikatną. Miejscami obserwuje się łuszczenie i łuszczenie.

Obraz mikroskopowy. Warstwa rogowa jest pogrubiona, miejscami - hiperkeratoza. Naskórek jest pogrubiony, składa się z 12-20 rzędów komórek. Granica między naskórkiem a skórą właściwą jest linią prostą. Delikatne włókna kolagenowe pod naskórkiem leżą dość gęsto. W głębszych warstwach blizny są one zbierane w duże grube wiązki. W warstwie podnaskórkowej pojawia się nowa formacja naczyniowa. W dolnych warstwach tkanki bliznowatej występuje wiele opuszczonych naczyń, położonych równolegle do powierzchni naskórka. Duże fibroblasty są równomiernie rozmieszczone w grubości blizny, występują olbrzymie, wielorozgałęzione, wiele makrofagów.

Blizna u szczura 5 miesięcy po przeszczepie komórek naskórka szczura.

Obraz kliniczny. Blizna wygląda równo, gładko, bez łuszczenia, występują pojedyncze włosy, ich gęstość jest większa na obwodzie blizny, co wskazuje na marginalny wrost mieszków włosowych w bliznę i powstawanie nowych mieszków włosowych. Powierzchnia blizn nadal się zmniejsza.

Obraz mikroskopowy. Naskórek jest nadal gruby (15-20 warstw, miejscami nawet 30), w górnych warstwach wypełniony ziarnami keratohialiny. Błona podstawna jest wyraźnie widoczna. Pod nią włókna kolagenowe leżą luźno. W dolnych warstwach kolagen jest mocniejszy i ściślej upakowany. Pomiędzy wiązkami kolagenu jest wiele naczyń włosowatych. W górnych warstwach liczba opuszczonych naczyń zmniejszyła się. Połączenie naskórka ze skórą właściwą jest lekko faliste. W niektórych miejscach w tkance bliznowatej widoczne są głębokie wyrostki naskórka. Pomiędzy włóknami kolagenowymi widoczne są nowo powstałe naczynia. Pojawiają się pojedyncze mieszki włosowe i gruczoły łojowe.

Blizna u szczura 9 miesięcy po przeszczepie komórek MPA naskórka szczura.

Obraz kliniczny. Blizny stały się znacznie mniejsze w porównaniu do wcześniejszych okresów, ich powierzchnia wynosi średnio około 1,5-2,0 cm ². Blizny są nierównomiernie pokryte drobnymi włoskami, szczególnie na obwodzie. Pozostaje niewielki, drobnopłytkowy peeling.

Obraz mikroskopowy.

Naskórek stał się cieńszy, jest reprezentowany przez 6-8 rzędów komórek, strukturą przypomina naskórek normalnej skóry szczura, tylko gęstość komórek jest o 1 mm wyższa i są one mniejsze. Warstwa podstawna składa się z małych okrągło-cylindrycznych komórek. Błona podstawna jest dobrze wyrażona, hemidesmosomy są wyraźnie widoczne. Zauważono obecność narośli naskórkowych w warstwie podnaskórkowej. Warstwa brodawkowata jest wyrażona na całej długości blizny. Fakty te wskazują, że w tym czasie przyczepność przeszczepionych keratynocytów stała się znacznie silniejsza z leżącymi pod nią tkankami bliznowatymi. Dlatego pielęgnacja blizn u osób z przeszczepem MPALK 9 miesięcy po przeszczepie MPC może być tradycyjna. Pod naskórkiem włókna kolagenowe są delikatniejsze niż w warstwach głębokich. Pojawiło się wiele naczyń, zwłaszcza powierzchownych. Ściany większych naczyń są pogrubione. Mieszki włosowe i gruczoły łojowe występują w dużych ilościach. Obraz mikroskopowy przypomina tkankę podobną do skóry właściwej.

Wyniki prac eksperymentalnych i ich dyskusja.

W ramach tej pracy keratynocyty w różnych formach przeszczepiano na sztucznie utworzone blizny skóry szczura po zabiegu dermabrazji - na pokrycia ran, jako zawiesinę na kambryku i jako warstwę wielowarstwową bez podłoża. Praca została przeprowadzona w celu uzyskania danych morfologicznych na temat wpływu przeszczepionych allogenicznych keratynocytów na blizny, a także określenia optymalnych opcji przeszczepu.

Stwierdzono, że wszystkie trzy metody transplantacji są wykonalne, ale transplantacja MPAC bez podłoża jest bardzo pracochłonną procedurą, podczas której MPAC może zostać uszkodzony, co wpływa na wyniki transplantacji. Ponadto ta metoda transplantacji wyklucza pracę na dużych powierzchniach.

Przeszczepienie zawiesiny keratynocytów jest znacznie bardziej opłacalną metodą, nie wymaga długotrwałej hodowli komórek i jest proste w proponowanej przez nas wersji z wykorzystaniem sterylnych półfabrykatów kambryjskich, których rozmiary odpowiadają rozmiarom blizn. Opóźnienie w efekcie terapeutycznym przy przeszczepieniu zawiesiny komórek o około miesiąc w porównaniu z MPC na powłoce rany nie jest znaczącym punktem przy czasie trwania leczenia wynoszącym wiele miesięcy. Wiadomo, że przy przeszczepianiu MPC pacjentom z oparzeniami transformacja struktury skóry zachodzi stopniowo i przez kilka lat. Przeszczepienie hodowli keratynocytów na powłoce rany jest najwygodniejszą i najbardziej obiecującą metodą, ale również znacznie droższą. Ponadto obecnie wymaga poszukiwania bardziej zaawansowanych opcji powłok, które powinny być elastyczne, higroskopijne, mieć właściwości bakteriostatyczne lub bakteriobójcze i być biologicznie neutralne dla komórek. Folia „Polypor” – wersja pośrednia krajowej folii do pokrywania ran, mimo pewnych niedoskonałości, pozwoliła nam zbadać w eksperymencie przeszczep keratynocytów szczura na blizny i wyciągnąć wnioski na temat skuteczności tego kierunku leczenia blizn.

Autorzy, którzy przeszczepiali MPC na rany pooparzeniowe, zauważyli, że w pierwszym tygodniu po przeszczepieniu wielowarstwowej warstwy keratynocytów na zdezynfekowane rany naskórek pogrubiał się i rozwarstwiał. Wszystkie warstwy naskórka były wyraźnie widoczne. Co ciekawe, liczba warstw komórek w przeszczepach była o 10-30% większa niż w biopsjach skóry. Autorzy zauważyli pojawienie się granulek keratohialiny 5. dnia po przeszczepie MPC, a błony podstawnej i hemidesmosomów – już 3. dnia.

J.Rives i in. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM i in. (1998) stwierdzili, że we wczesnych stadiach po przeszczepie MPC u pacjentów z pełnogrubymi ubytkami skóry po oparzeniach połączenie między skórą właściwą a naskórkiem jest bardzo słabe i ma kształt linii prostej, warstwa brodawkowata jest nieobecna. Pod koniec 2. miesiąca zaczynają tworzyć się płytkie brodawki i przydatki skóry, połączenie między skórą właściwą a naskórkiem staje się silniejsze. Dane z literatury wskazują, że przeszczepienie allogenicznych keratynocytów na rany u pacjentów z oparzeniami jest obiecującą metodą. Pomimo faktu, że odrzucenie allogenicznych keratynocytów następuje, według różnych autorów, w ciągu 10 dni do 3 miesięcy, niemniej jednak odgrywają one swoją rolę w gojeniu powierzchni rany, wydzielając czynniki wzrostu i mechanicznie zamykając ubytek. Uważa się, że MPALC mają obniżoną aktywność antygenową, ponieważ podczas hodowli in vitro tracą komórki Langerhansa, co pozwala im na długi czas istnienia w ciele biorcy. Ponadto hodowla allogeniczna uzyskana ze skóry młodych zdrowych osób ma nieporównywalnie większy potencjał biologiczny niż hodowla autologiczna pacjentów po urazie.

Głównym celem naszych badań było sprawdzenie, czy allogeniczne keratynocyty zakorzenią się w bliznach i jakie zmiany zajdą w tkance bliznowatej pod wpływem takiej biologicznie aktywnej „powłoki rany”. W przypadku pozytywnego wyniku, opracowanie najskuteczniejszej i najmniej pracochłonnej technologii dla tej dziedziny medycyny rehabilitacyjnej.

Uzyskane przez nas dane były pod wieloma względami podobne do danych z literatury na temat zmian morfologicznych zachodzących w naskórku ludzkim po przeszczepieniu allogenicznych keratynocytów do ran oparzeniowych. Istnieją jednak również istotne różnice, zarówno pod względem podłoża morfologicznego, na którym następuje przeszczep, jak i pod względem technologii. Tak więc proces formowania błony podstawnej i połączeń skórno-naskórkowych (hemidesmosomy, brodawki) zachodzi na późniejszym etapie w porównaniu z przeszczepieniem keratynocytów na powierzchnie ran bez zmian bliznowatych. Najwyraźniej dzieje się tak z powodu gorszego odżywienia tkanki bliznowatej w porównaniu ze skórą właściwą lub powięzią mięśniową. Blizna, zwłaszcza stara, jest gęstą tkanką łączną z bardzo małą liczbą naczyń, podczas gdy dno rany oparzeniowej jest tkanką ziarninową bogatą w naczynia. Tak więc oczywiste jest, że warunki, w których zachodzi przeszczep i wszczepienie keratynocytów, są zupełnie inne. Im bardziej unaczyniony jest obszar przeszczepu komórek, tym łatwiejszy jest proces ich wszczepienia. Z tego postulatu wynika wniosek o preferowaniu pracy z młodymi bliznami, w których tkanka łączna jest jeszcze dość luźna i bogata w naczynia.

W wyniku tej pracy eksperymentalnej udowodniono, że:

1. Możliwy jest przeszczep MPALK w miejsce blizn.
2. Optymalną metodą przeszczepu jest przeszczep keratynocytów na pokrycie rany.
3. Powierzchnię blizny należy wygładzić za pomocą chirurgicznej dermabrazji laserowej lub frezu Schumanna.
4. Pod wpływem MPALK następuje szybka epitelizacja wypolerowanej powierzchni blizny.
5. Im lepiej unaczyniona jest tkanka bliznowata, czyli im młodsza blizna, tym lepsze są efekty przeszczepu keratynocytów.
6. Pod wpływem przeszczepionych keratynocytów tkanka bliznowata stopniowo przekształca się i przybiera postać przypominającą skórę właściwą (luźniejsza tkanka bliznowata z przydatkami skóry).
7. Stopniowe rozluźnienie tkanki bliznowatej, zaczynając od warstwy podnaskórkowej. Poprawia się jej unaczynienie, wiązki włókien kolagenowych w górnej i dolnej części blizny przyjmują luźniejszy układ niż w tkance bliznowatej bez przeszczepu komórek. Pojawiają się mieszki włosowe i gruczoły łojowe. Naskórek, po przejściu fazy przerostu, zbliża się swoją strukturą do naskórka skóry normalnej.
8. Obserwowane zmiany są związane z czynnikami wzrostu i cytokinami wydzielanymi przez keratynocyty, które poprzez poprawę trofizmu tkanki bliznowatej wspomagają jej przekształcanie się z grubej tkanki włóknistej w tkankę luźniejszą, co prowadzi do poprawy wyglądu blizny.

Zatem na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że przeszczepione keratynocyty mają korzystny wpływ na tkankę bliznowatą, co może mieć praktyczne zastosowanie w rehabilitacji pacjentów z różnego rodzaju bliznami.

Badania na szczurach pozwoliły nam również na sformułowanie wymagań dotyczących pokrycia ran, na którym hodowane są keratynocyty.

Opatrunki na rany powinny być:

• biokompatybilny z komórkami,
• oddychający,
• mają elastyczną, formującą podstawę,
• być hydrofilowym,
• ponieważ dodatki lecznicze zawierają leki przeciwbakteryjne i przeciwutleniacze, które nie są toksyczne dla hodowanych komórek.

Wyniki kliniczne biotechnologicznego leczenia blizn.

Wcześniej N. Carver i in. (1993) stwierdzili, że opatrunki okluzyjne najlepiej sprzyjają przyleganiu do rany i przeżywalności keratynocytów, ale nie pozwalają na tworzenie się warstwowego (dojrzałego) naskórka. Do tworzenia warstwowego naskórka niezbędne jest środowisko powietrzne. Dlatego po przytwierdzeniu warstwy wielowarstwowej zaproponowano usunięcie opatrunku okluzyjnego po 7-10 dniach i leczenie ran suchymi opatrunkami lub rozpuszczalnymi w wodzie maściami. Można powiedzieć, że jakość i właściwości „podłoża”, na którym hodowane są komórki, są bardzo ważnym punktem dla skuteczności przeszczepu materiału komórkowego, a zatem dla wyników pracy lekarzy. Jednak nie ma dziś idealnego opatrunku na ranę, pomimo mnogości proponowanych opcji (sztuczna skóra, włóknina z karboksymetylocelulozy, powłoki fibrynowe, półprzepuszczalne folie poliuretanowe). Ważnym punktem w tej kwestii jest koszt „podłoży” (specjalnych opatrunków na rany), gdyż ich wysoki koszt podnosi ogólny koszt leczenia biotechnologicznego.

Skuteczność technologii komórkowych została udowodniona do tej pory, ale niestety technologie te są bardzo drogie, szczególnie w krajach, w których nie ustanowiono przemysłowej produkcji kompozycji komórkowych. Jednak kraje takie jak Stany Zjednoczone od dawna ustanowiły przemysł produkcji materiału komórkowego do przeszczepów oparzeń. W szczególności firma BioSurface Technology Inc. od 1989 r. wyhodowała 37 000 wielowarstwowych warstw keratynocytów, które wykorzystano do leczenia 240 pacjentów w 79 krajach na całym świecie (R. Odessey, 1992), podczas gdy 1 cm 2 hodowli ^komórkowej kosztuje około 7-8 dolarów amerykańskich.

Technologia leczenia różnych chorób i problemów skórnych różni się w zależności od okoliczności, jednak podstawą każdego leczenia komórkowego jest uzyskanie wysokiej jakości materiału komórkowego i jego przeszczep.

Proces ten składa się z następujących kroków:

• pobieranie skóry od ofiar (lub od dawców),
• transportowanie płatów skóry do ośrodka biotechnologicznego,
• izolacja komórek warstwy podstawnej i ich proliferacja,
• wzrost wielowarstwowych warstw keratynocytów (MLK).
• przeszczep kultur komórkowych.

Głównym problemem w przeprowadzaniu leczenia z wykorzystaniem transplantacji wielowarstwowych arkuszy keratynocytów jest potrzeba żywych komórek na wszystkich etapach transplantacji komórek. Fragmenty skóry do izolowania autologicznych lub allogenicznych komórek powinny być jak najcieńsze, ponieważ w tym przypadku łatwiej je rozdzielić metodami mechanicznymi i enzymatycznymi i uzyskać zawiesinę żywych komórek do hodowli. Można je uzyskać poprzez cięcie dermatomem lub wykorzystując skórę powiek, napletka i wewnętrzną powierzchnię barku. Biorąc pod uwagę, że komórki są wrażliwe na halogeny (chlor, jod), nadtlenek wodoru, nie można ich stosować podczas obróbki skóry podczas pobierania materiału.

Ilościowa i jakościowa wydajność komórek z przeszczepów skóry oraz efektywność ich hodowli zależą również od stanu zdrowia i wieku dawcy. Ponadto biopsje skóry muszą być dostarczane tak szybko, jak to możliwe i w odpowiednich warunkach (środowisko, temperatura) do laboratorium certyfikowanego i akredytowanego do tych celów.

Do przechowywania i transportu płatów skóry można stosować podłoże Eagle'a lub podłoże 199 z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej, podłoże DMEM z dodatkiem 5% surowicy płodowej bydlęcej i antybiotyków.

W laboratorium cytologicznym wycinek skóry jest najpierw dzielony mechanicznie na małe fragmenty, a następnie fragmenty skóry poddawane są obróbce za pomocą enzymów: trypsyny, kolagenazy, dyspazy itp.

Pod wpływem enzymów desmosomy ulegają zniszczeniu, a keratynocyty uwalniają się do podłoża w postaci pojedynczych komórek lub agregatów składających się z różnej liczby komórek. Do hodowli wykorzystuje się wyłącznie keratynocyty bazalne, które hoduje się na specjalnych podłożach w termostatach zawierających 5% CO2, w szalkach Petriego lub w kolbach w temperaturze t = 37 °C. Już po 48 godzinach obserwuje się powstawanie kolonii keratynocytów, które stopniowo łączą się, tworząc monowarstwę. Po otrzymaniu wystarczającej liczby komórek, otrzymaną zawiesinę wysiewa się na przygotowane w tym celu opatrunki na rany i umieszcza w szalkach Petriego. Z zawiesiny najpierw tworzy się monowarstwa, a następnie wielowarstwowa warstwa keratynocytów. Etapy procesu hodowli keratynocytów przedstawiono schematycznie na ryc. 12 (33,43,54,65).

Utworzenie wielowarstwowej warstwy keratynocytów nadających się do przeszczepu trwa zazwyczaj 7-10 dni. Czasami okres ten jest dłuższy, co zależy od jakości materiału źródłowego (wiek, stan zdrowia dawcy, prawidłowość pobrania materiału, jakość użytego podłoża itp.). Jeśli warstwa wielowarstwowa przerośnie, na jej powierzchni mogą pojawić się komórki ze zjawiskami apoptozy nienadające się do przeszczepu. Płytki Petriego z wielowarstwowymi warstwami keratynocytów (MLK) hodowanymi w nich na pokryciach ran są dostarczane do kliniki w specjalnych pojemnikach w temperaturze co najmniej +15° C.

Zmodyfikowana metoda Greena do uprawy MPC

W naszej pracy użyliśmy wielowarstwowego kambryku jako pokrycia rany, porzucając folie „Polypor”, z którymi zaczynaliśmy pracę w eksperymencie ze szczurami. W ten sposób hodowaliśmy wielowarstwowe warstwy keratynocytów na wstępnie odtłuszczonym i sterylnym kambryku, chociaż nie jest to również optymalne pokrycie rany.

Badania kliniczne przeprowadzono na ochotnikach, przestrzegając niezbędnych norm etycznych: podpisania umowy i uzyskania świadomej zgody.

1. Do badań wykorzystano hodowlę własnych (autologicznych) i bankowanych (allogenicznych) keratynocytów pacjenta.
2. Keratynocyty pacjentów pobrano z kawałka skóry wyciętego z wewnętrznej strony górnej części ramienia.
3. Zabieg dermabrazji blizn wykonano przy użyciu termokauteryzacji, dysków obrotowych i lasera erbowego.
4. Wybrano grupy pacjentów z bliznami normotroficznymi, hipotroficznymi i przerostowymi.

Proces technologiczny zastosowania technologii komórkowej w celu poprawy wyglądu blizn skórnych składał się z następujących etapów:

1. Wybór pacjenta.
2. Wyjaśnienie istoty zabiegu, terminu uzyskania oczekiwanych efektów, podpisanie umowy i wyrażenie świadomej zgody.
3. Pacjentom przepisuje się 2-3 tygodnie przed operacją selmevit 1 tabletkę 3 razy dziennie, zinctheral 1 tabletkę 3 razy dziennie.
4. Pobranie fragmentu skóry o długości 2,0 cm i szerokości 0,7-1,0 cm z wewnętrznej powierzchni barku, wysoko, niemal w dolnej części okolicy pachowej, w celu uzyskania autologicznych keratynocytów.
5. W przypadkach, gdy pacjenci odmawiali wyizolowania własnych keratynocytów z powodu ryzyka powstania liniowej blizny na wewnętrznej powierzchni barku, materiał komórkowy pobierano z banku komórek (keratynocyty allogeniczne).
6. Keratynocyty izolowano i hodowano w laboratorium posiadającym certyfikat uprawniający do tego typu prac.
7. Po pobraniu odpowiedniej ilości MPC do przeszczepu na blizny, wyznaczono dzień operacji w klinice, gdzie materiał umieszczono w specjalnych pojemnikach na szalkach Petriego.
8. Wykonano zabieg dermabrazji blizny, hemostazę, polerowaną powierzchnię przemyto sterylnym roztworem soli fizjologicznej, wysuszono, po czym przeszczepiono na nią MPC na sterylnym kambryku „komórki w dół”. Oznacza to, że komórki, które były na górze w MPC, okazały się być na dole, przylegając do polerowanej powierzchni.
9. Na wierzch nałożono sterylną folię, którą przymocowano do skóry elastycznym bandażem lub elastycznym plastrem Omnifix. Zamiast folii można stosować obojętne opatrunki na rany zawierające silikon, na przykład Mepitel, Mepiform, silikonowe arkusze żelowe.

Po 5-7 dniach folia lub powłoka silikonowa są usuwane. Do tego czasu wszystkie keratynocyty powinny wpełznąć na wypolerowaną bliznę i przytwierdzić się do jej powierzchni.

10. Wilgotne środowisko wytworzone pod powłoką filmu i silikonu aktywnie się do tego przyczynia. Pozostały na bliznach batyst od tego momentu można nasączyć curiosinem lub żelem chitozanowym. W rezultacie drugiego dnia tworzy się gęsta strup, który dla wygody pacjenta najlepiej jest utrwalić elastycznym, oddychającym plastrem, takim jak Omnifix. Oddychający strup pozwala uformowanemu naskórkowi różnicować się i przekształcać w dojrzały.

W zależności od rodzaju blizny i głębokości szlifowania, bandaż jest odrzucany po 8-10 dniach. W tym czasie naskórek ma o 30-40% więcej warstw komórek niż w normalnej skórze. Błona podstawna nie jest utworzona. Keratynocyty zgrubiałego naskórka wydzielają wiele biologicznie aktywnych cząsteczek do tkanki bliznowatej.

Sukces biotechnologicznego leczenia blizn w dużej mierze zależy od metody opieki w okresie pooperacyjnym. Hodowle komórkowe są „delikatnym” rodzajem pokrycia rany, a na wczesnych etapach po przeszczepie IPC można łatwo odkleić od tkanek podskórnych. Dlatego pacjentom zaleca się ostrożne obchodzenie się z blizną po operacji. Przez 8-9 miesięcy nie pocieraj i delikatnie polewaj zimną przegotowaną wodą, aby uniknąć zerwania cienkiego, nowo utworzonego naskórka, który nie ma ścisłego połączenia z tkankami podskórnymi.

Notatka.

Przed zabiegiem i w trakcie dermabrazji dopuszczalne jest stosowanie halogenowanych środków antyseptycznych i utleniaczy (jodopironu, suliodopironu, jodinolu, jodanu, chlorheksydyny, nadtlenku wodoru), przed przeszczepem komórek - jest surowo przeciwwskazane ze względu na ich działanie cytotoksyczne. Toksyczne dla komórek są również błękit metylenowy i zieleń brylantowa.

Aby uniknąć infekcji, zwłaszcza podczas pracy z bliznami przerostowymi, pole operacyjne można leczyć siarczanem neomycyny, polimyksyną lub gentamycyną. Nie mają one cytotoksycznego wpływu na keratynocyty.

W wyniku takiego leczenia uzyskuje się potrójny efekt.

1. Wyrównanie powierzchni blizny.
2. Tworzy się ponad nią warstwa nowego naskórka o normalnej grubości.
3. Przekształcenie tkanki bliznowatej w tkankę podobną do skóry właściwej na skutek działania cytokin, czynników wzrostu i innych biologicznie aktywnych cząsteczek wydzielanych przez przeszczepione komórki i stymulowanych przez nie keratynocyty, fibroblasty i makrofagi.

Blizna staje się mniej widoczna, bardziej elastyczna, pojawiają się na niej pory i włoski meszkowe, a pigmentacja może zostać przywrócona dzięki obecności melanocytów w IPC.

Jednak wszystkie te pozytywne aspekty blizny nie występują natychmiast. W związku z tym należy ostrzec pacjentów, że proces przekształcania się tkanki bliznowatej w tkankę skórną zachodzi powoli i optymalnego wyniku takiego leczenia można oczekiwać nie wcześniej niż po 10-14 miesiącach. Bezpośrednio po odrzuceniu opatrunków polerowane powierzchnie mają wyraźną polichromię, im jaśniejsza, tym głębsze polerowanie zostało wykonane. Najmniejsze uszkodzenia skóry odnotowuje się podczas polerowania blizn normotroficznych laserem erbowym. Kolor blizn i otaczającej je skóry został przywrócony w ciągu 3 do 8 tygodni. Pomimo takich środków ostrożności czasami występuje pooperacyjna hiperpigmentacja, która może zniknąć samoistnie w ciągu kilku miesięcy.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]