Prace eksperymentalne nad transplantacją allogenicznych keratynocytów na sztucznie wytworzone blizny szczurów białych

Pragnienie wykorzystania potencjału komórkowego i potrzeba poszukiwania nowych skutecznych metod poprawy estetycznego wyglądu blizn spowodowały, że próbowano zbadać możliwość przeszczepu keratynocytów na bliznowacenie powierzchni.

W celu udowodnienia prawdopodobieństwa wykorzystania kultury keratynocytów do poprawy typu blizn, wykonano prace eksperymentalne na białych szczurach laboratoryjnych, które stworzyły powierzchnie bliznowate. Model żwacza szczurów uzyskano w wyniku gojenia sztucznie zadanych ran na grzbiecie, wzdłuż kręgosłupa. Szczurom wycięto kawałki samą skórą, wielkości 2x3 cm. Po 2,5 miesiąca po operacji „blizn symulacji” szczurów przeprowadzono operację dermabrasion (usuwanie górnych warstw poprzez ignioperation żwaczu) i przeszczepionych allogenicznych keratynocyty, izolowane ze skóry młodych szczurów 2-4 dni po urodzeniu.

Izolacja i wzrost epidermocytów szczura przeprowadzono w laboratorium technologii komórkowych Instytutu Cytologii RAS następującej technologii.

Skórę przemywano roztworem soli Hanka, zawierającej 200 jednostek / ml gentamycyny, pociętych na małe kawałki o powierzchni 0,2-0,5 cm ². Kostki skóry inkubowano w 0,5% roztworze disaspazy w zbalansowanym roztworze buforowanym fosforanem sodu w 37 ° C przez godzinę. Kawałki przeniesiono następnie do soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco i oddzielono naskórek od skóry właściwej. Naskórek inkubowano z 0,125% roztworze trypsyny w ciągu 10-15 minut, w trakcie mieszania z szybkością 50 obr / min, po czym enzym przerwano przez dodanie 5% płodowej surowicy bydlęcej. Jedną trzecią uzyskanej zawiesiny komórek stosowany w czystej postaci jednego z wariantów przeszczep blizny, drugi trzeci hodowano na wewnętrznym biokompatybilnego powlekanie „Polipor”, trzeci - na płytce Petriego bez podłoża. Operację dermabrazji uzyskanych blizn u szczurów z późniejszym przeszczepem na nich epidermocytów szczurzych przeprowadzono w znieczuleniu eterowym stosując kauteryzację cieplną.

Pierwsza grupa szczurów po dermabrazja na polerowane, przemyto solanką i osuszono powierzchniowo sterylne żwacza nałożone elementy trawnika, który został zdeponowany kodowany zawiesiny Allogeniczne szczura epidermotsitov w stężeniu 1,5 miliona komórek na 1 ml (w zależności od Instytutu Cytologia). Kawałki batistovye pasują do wypolerowanej blizny tak, że komórki leżą na powierzchni blizny. Na wierzchu przyszyto bandaż z kilku warstw gazy, który został przyszytym do brzegów blizny.

Część powstałej zawiesiny komórkowej została umieszczona na szalkach Petriego na sterylnych foliach Polypore wyciętych w kształcie kubków, a druga na szalkach Petriego bez folii. Hodowlę prowadzono w pożywce FAD składającej się z mieszaniny DMEM i F12 w stosunku 3: 1. Z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5 μg / ml insuliny (Sigma), 0,5 μg / ml hemibursztynianu hydrokortyzonu (Sigma). 10 μg / ml naskórkowego czynnika wzrostu EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Druga i trzecia grupa szczurów z 7 osobnikami była operowana 6 dni po pierwszej. W tym czasie warstwy wielowarstwowe powstały z zawiesiny wysianych keratynocytów na płytkach Petriego, które zostały przeszczepione szczurom. Druga grupa została przeszczepiona na błonę epidermocytową, trzecia grupa - z warstwą wielowarstwową bez podłoża. Po 7 dniach wielowarstwowe warstwy keratynocytów alogenicznych (MPALK), wysiane na foliach Polypore, przeszczepiono przez hodowlę bezpośrednio na powierzchnię rany. Powyżej, film, w celu uniknięcia jego zrywania, został unieruchomiony wielowarstwowym opatrunkiem z gazy i przyszytym do skóry szczura.

Przed przesadzeniem keratynocyty trzeciej grupie szczury hodowano bez podłoża, tworząc oddzielenie PAC z dna naczynia do obróbki dyspazy Petriego, posiadające zdolność do wybiórczego przerwania komunikacji skórno-naskórkowych. Pod działaniem wielowarstwowej zbiornika dispasy niszczy połączenia komórek warstwy podstawnej do dna szalki Petriego oraz w znacznie mniejszym stopniu wpływa na komunikacji międzykomórkowej, co sprawia, że możliwe jest „usuń” całą warstwę. Oddzielenie wielowarstwowej warstwy komórek przez dyspozycję przeprowadzono w następujący sposób. Płytki Petriego z mieszane medium przesyłowego, arkusze komórki przemyto trzy razy pożywką zawierających antybiotyki, w szczególności: - gentamycyny (0,2 mg / ml). Wielowarstwowe warstwy wlano 0,125% roztwór dyspazy ( «Sigma») i umieszczono w inkubatorze, gdzie były inkubowane w temperaturze T = 37 ° C przez 20-30 minut. Wygląd białych korony, obieranie na obwodzie zbiornika, - wskaźnik początku procesu oddzielania go od brzegów i dna szalki Petriego. W kilka minut po rozpoczęciu procesu rozdzielania, roztwór disaspazy połączył się, warstwy nabłonka przemyto 2-3 razy pożywką. Na zastosowano powierzchni warstwy naskórkowej, cięte na wymiar kubek kawałek sterylny opatrunek na rany „Leith kolor, który jest cięty oddzielone dyspazy formacji, delaminacji dna kubka z łopatką. Stosując okulistycznych pęsety warstwy razem z powłoką podpaski” Leith kolorze „(rosyjski ) oderwała się od dna szalki Petriego ostrożnie przeniesiono na przygotowaną powierzchnię blizny. Chusteczki „Lita kolor” zawiera w swoim składzie, a gentamycyny eksolin (wyciąg kolagen), które w stanie wilgotnym środowisku pozostaje główką w przyszłości roztwór soli szem i spęcznia się nowoczesne powłoki na ranę, który zapewnia dobrą ochronę przed zakażeniem zewnętrznym i szybkiego gojenia powodu początkowej wilgotności, przy użyciu konstrukcji.

Folie polipropylenowe i serwetki Lita barwione były bandażami z gazy, które były przyszyte na skórę szczurów dla bardziej trwałego utrwalenia. Każdy szczur zasadzono w oddzielnej klatce, aby stworzyć optymalne warunki dla jego utrzymania i przeszczepienia przeszczepionych keratynocytów. Bandaże Szczury codziennie przeszczepione zawiesiny i strzał wielowarstwowego zbiornika epidermotsitov dyspazy, kilka razy dziennie, zwilżonej jałowej soli fizjologicznej, aby utworzyć najbardziej korzystne warunki do zasiedlania komórek. Biorąc pod uwagę, że film "Polypor" był nieprzepuszczalny dla wody, szczury z drugiej grupy nie nawilżały opatrunków, co było jedną z przewag nad przeszczepami bez filmów. Po 10 dniach bandaże zostały usunięte. Obraz kliniczny blizn po przeszczepie komórek różni się nieznacznie od blizn bez przeszczepu, z wyjątkiem bardziej różowego zabarwienia (z powodu dermabrazji) i większego złuszczania. Fakt ten sugeruje, że. że zaraz po zniknięciu rany z IPC nie nastąpiły zmiany w żwaczu.

Pobieranie materiału do biopsji u szczurów.

Po 1, 2, 5 i 9 miesiącach po przeniesieniu szczurzych keratynocytów alogenicznych na podłoże blizn białych szczurów, materiał pobrano do badania histologicznego, cytomorfologicznego i mikroskopu elektronowego. Jako próbki kontrolne normalnej skóry szczura i blizny pobrano bez przeszczepiania komórek. Znieczulenie szczurów przeprowadzono w znieczuleniu eterem.

Po znieczuleniu, z zaznaczonych obszarów, do których przeszczepiono keratynocyty, przebijający biopsję o średnicy 2 mm. Kawałki tkanki bliznowej pobrano i umieszczono w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego w celu przygotowania materiału do mikroskopii elektronowej. Kawałki tkanki pobrane do badania histologicznego umieszczano w 10% roztworze obojętnej formaliny, a następnie drutowano przez spirytusy i wlewano do parafiny, a następnie wycinano ultracienkie sekcje i oglądano je w mikroskopach optycznych.

Kontrola I. Normalna skóra szczura.

Aby zobaczyć różnicę między mikroskopijnym obrazem normalnej, bliznowaconej skóry szczurów i blizn po pewnym czasie od przeszczepienia IPC, pokazano zdjęcia i opisy do nich na wszystkich etapach tego badania.

Naskórek normalnej skóry składa się z 7-9 warstw komórek. Warstwa rogowa o umiarkowanej grubości. Miejscami składa się z 6-8 warstw rogowej łuski. Warstwa podstawowa jest reprezentowana przez komórki o cylindrycznym kształcie z dużym światłem, regularnymi jądrami i kilkoma jąderkami. Desmosomalne połączenia pomiędzy komórkami i błony podstawnej są wyraźnie wyrażone. Pod dobrze zaznaczoną błoną podstawną, która ma małe wyrostki w warstwie podnaskórkowej, równolegle znajdują się delikatne wiązki włókien kolagenu i elastyny, w tym wydłużona forma fibroblastów, małe naczynia. W głębszych warstwach wiązki włókien kolagenu i elastyny znajdują się w różnych kierunkach. Wśród nich jest wiele naczyń o cienkich ścianach tego samego kalibru, elementy komórkowe (fibroblasty, komórki tuczne, leukocyty). W dużej liczbie mieszków włosowych, gruczoły łojowe.

Kontrola 2. Blizna szczura w wieku 2 miesięcy.

Obraz kliniczny. Blizny jasnoróżowe, z łuszczącą się, miejscami resztki pozostają. Ich powierzchnia zmniejsza się wskutek skurczu włókien kolagenowych się około 3,0-3,5 cm ^:. Załączniki do skóry są nieobecne.

Obraz mikroskopowy. Naskórek złożony z 3-5 warstw komórek, plisowanych, reprezentowanej przez zaokrąglonych komórek podstawnych jeden rząd szydłowaty 1-2 rzędy keratohyalin granulat ziarna w górnej warstwie, nie są częściami obrzęku wewnątrzkomórkowego. Warstwa rogówki jest heterogenicznie zmieniona z bardzo cienkiej na zagęszczoną. Istnieje zwijanie żwacza z powodu (skurczenia) blizny. Fałdy wnikają do brodawkowej warstwy i sprawiają wrażenie brodawek. Granica między naskórkiem a skórą właściwą jest linią prostą. Błony podstawnej nie można odnaleźć wszędzie. W dolnej części warstw podnaskórkowych i głębszych - naczynia z grubą, rozluźnioną ścianą, wiele opuszczonych, ze zjawiskami zastoju. Wokół naczyń - skupisko makrofagów, fibroblasty. Makrofagi otaczają erytrocyty wyłaniające się z naczyń włosowatych i fagocytują je. W bardziej powierzchownych warstwach - małe naczynia włosowate. Pod naskórkiem włókna kolagenowe są luźne. W głębszej warstwie żwacza - gruboziarniste wiązki włókien kolagenowych, wśród których jest wiele fibroblastów.

Bliznawstwo szczura w miesiąc po przeszczepie keratynocytów szczurzych szczura MPA1.

Obraz kliniczny. Blizny różowy, ich powierzchnia zmniejsza się, w szczególności średnicę, średnio 2,5-3 cm ². Brak włosów i gruczołów łojowych.

Dane z badania mikroskopowego materiału uzyskanego od szczurów z przeszczepem MPALK na folii i MPALK bez podłoża są praktycznie identyczne. Jednak technicznie, praca z MPAlK nieobsługiwanym znacznie trudniejsze i bardziej pracochłonne niż gdy rośnie MPAlK na podłożu, więc dalsze badania emisji na przeszczep kertainotsitov blizny użyliśmy jako podstawa do uprawy ( „podłoża”) warstwowa trawnika.

Obraz mikroskopowy. Pogrubienie naskórka wynosi 15-20 warstw, prawie do połowy których keratynocyty mają wąski, wydłużony, pionowy kształt i zwarty układ. Komórki podstawne są ułożone w nierówną linię. Ich jądra są lekkie, duże, okrągłe z jednym lub dwoma jąderkami, co wskazuje na ich wysoką syntezę i aktywność proliferacyjną. Granica między naskórkiem a skórą właściwą jest linią prostą. Ciernista warstwa jest dobrze rozwinięta, składa się z 3-5 warstw komórek o okrągłym kształcie, są 2 komórki jąderka.

Natychmiast pod podstawową membraną - gęsto rozmieszczone cienkie wiązki włókien kolagenowych, równolegle do nich duża ilość pustych naczyń, głębsze włókna kolagenu są grubsze, zebrane w gęste wiązki. Wiele dużych fibroblastów, komórek tucznych (2-3 w polu widzenia), makrofagów, leukocytów i pustych naczyń, których ściany są rozluźnione, wokół nich są luźno umieszczone włókna kolagenowe. W niektórych naczyniach - zastój, diapedeza jednolitych elementów. Wokół naczyń - fibroblasty, pojedyncze limfocyty. Załączniki do skóry są nieobecne.

Kiedy zawiesina keratynocytów zostanie przeszczepiona do wypolerowanej blizny, obraz mikroskopowy różni się od poprzedniej. U większości zwierząt - naskórek jest cienki, składa się z 5-6 warstw komórek. Dolna warstwa składa się z komórek o nieregularnym, wielokątnym kształcie z zaokrąglonymi nieregularnie ukształtowanymi jądrami. Stan warstwy podnabłonkowej jest podobny do stanu w grupie zwierząt bez przeszczepu.

W takim przypadku można mówić o opóźnieniu w procesach towarzyszących transplantacji komórek lub o dużej utracie komórek przeszczepionych w postaci zawiesiny. W związku z tym wysunięto wniosek, że korekcja blizn po transplantacji keratynocytów w postaci zawiesiny jest niewłaściwa.

Bliznawstwo szczura w 2 miesiące po przeszczepie keratynocytów szczura szczura MPA1.

Obraz kliniczny. Blizna wygląda na szczupłą, delikatną. W miejscach jest ekdysis, łuski.

Zdjęcia mikroskopowe. Warstwa rogowa jest pogrubiona, miejscami - hiperkeratoza. Naskórek jest pogrubiony, składa się z 12-20 rzędów komórek. Granica między naskórkiem a skórą właściwą jest linią prostą. Delikatne włókna kolagenowe pod naskórkiem leżą dość mocno. W głębszych warstwach żwacza zbiera się je w grubych dużych plikach. W warstwie podnaskórkowej pojawia się nowa formacja naczyń krwionośnych. W dolnych warstwach blizny - wiele pustych naczyń, umieszczonych równolegle do powierzchni naskórka. Duże fibroblasty są równomiernie rozmieszczone w grubości żwacza, istnieją olbrzymie, wielopłaszczyznowe, liczne makrofagi.

Blizna szczura po 5 miesiącach od transplantacji MP szczurzych spermocytów.

Obraz kliniczny. Blizna wygląda gładko, gładko, bez łuszczenia się, są pojedyncze włosy, ich gęstość jest większa na obwodzie blizn, co wskazuje na wrastanie brzegowe mieszków włosowych w bliznę i tworzenie mieszków włosowych. Obszar blizn nadal się zmniejsza.

Obraz mikroskopowy. Naskórek jest nadal gruby (15-20 warstw, czasami nawet do 30) w górnych warstwach jest wypełniony ziarnami keratogialiny. Błona podstawna jest wyraźnie widoczna. Pod jej kolagenem włókna są luźne. W niższych warstwach kolagen jest mocniejszy i gęsto upakowany. Wśród wiązań kolagenu znajduje się wiele naczyń włosowatych. W górnych warstwach zmniejszyła się liczba pustych naczyń. Naskórek i skóra właściwa są lekko falujące. W tkance bliznowatej dochodzi do głębokiego przerostu naskórka. Wśród włókien kolagenowych widoczne są nowo utworzone naczynia. Pojawiają się pojedyncze mieszki włosowe i gruczoły łojowe.

Bliznawstwo szczura 9 miesięcy po transplantacji epidermocytów szczurzych IPA szczura.

Obraz kliniczny. Blizny są znacznie mniejsze w porównaniu do poprzednich okresów, a ich powierzchnia średnio około 1,5-2,0 cm ². Blizny są nierówno pokryte cienkimi włosami, szczególnie wokół obwodu. Drobne skalowanie małej płytki zostaje zachowane.

Obraz mikroskopowy.

Naskórek stał się cieńszy, reprezentowany przez 6-8 rzędów komórek, przypominając strukturę naskórka normalnej skóry szczurów, a jedynie gęstość komórek o 1 mm. Wyższe i są mniejsze. Warstwa podstawowa składa się z małych komórek o okrągłym cylindrycznym kształcie. Błona podstawna jest dobrze zdefiniowana, hemidesmosomy są wyraźnie widoczne. Obserwuje się obecność przerostu naskórkowego w warstwie podnabłonkowej. Warstwa brodawkowa jest wyrażana na całej długości blizny. Fakty te pokazują, że w tym okresie adhezja przeszczepionych keratynocytów stała się znacznie silniejsza w tkankach leżących u podstaw żwacza. W związku z tym opieka nad bliznami osób po transplantacji MALC 9 miesięcy po transplantacji IPC może być tradycyjna. Pod epidermą są bardziej delikatne włókna kolagenowe niż w głębokich warstwach. Było wiele statków, szczególnie powierzchownie położonych. W większych naczyniach ściany są pogrubione. Mieszki włosowe i gruczoły łojowe w dużych ilościach. Mikroskopowy wzór przypomina tkankę skórną.

Wyniki pracy eksperymentalnej i ich dyskusja.

Podczas pracy sztucznych blizn skóry u szczurów po operacji dermabrazja przeszczepione keratynocytów w różnych formah- nawiniętych na powierzchni, w postaci zawiesiny w batystu i tworzenie warstwowego bez podłoża. Prace wykonano w celu uzyskania danych morfologicznych dotyczących wpływu przeszczepionych allogenicznych keratynocytów na blizny, a także określenia optymalnych wariantów przeszczepów.

Stwierdzono, że wszystkie trzy metody transplantacji są prawdziwe, ale transplantacja IPAA bez substratu jest bardzo pracochłonną procedurą, podczas której IPAC może ulec uszkodzeniu, co wpływa na wyniki przeszczepu. Co więcej, ta metoda transplantacji wyklucza pracę na dużych powierzchniach.

Transplantacja zawiesiny keratynocytów jest znacznie bardziej ekonomiczna, nie wymaga długiej hodowli komórkowej i jest prosta w naszej proponowanej wersji przy użyciu jałowych prętów karkasowych, których wymiary odpowiadają rozmiarowi blizn. Opóźnienie efektu terapeutycznego podczas przeszczepiania zawiesiny komórkowej przez około miesiąc w porównaniu z MIC na powłoce rany nie jest znaczącym momentem z czasem trwania leczenia, liczonym w wielu miesiącach. Wiadomo, że podczas przeszczepiania IPC w celu wypalenia pacjentów transformacja stanu struktury skóry następowała stopniowo i przez kilka lat. Transplantacja hodowli keratynocytów na pokryciach ran jest najdogodniejszą i najbardziej obiecującą metodą, jednak jest również znacznie droższa. Ponadto, wymagające na dzisiaj poszukiwania bardziej wyrafinowanych powłok, które muszą być plastyczne, higroskopijne, mieć właściwości bakteriostatyczne lub bakteriobójcze i być biologicznie neutralne dla komórek. Film „Polipor” - pośrednia wersja krajowego pokrycia filmu rany, mimo pewnych niedociągnięć, pozwoliło nam badać doświadczalnie keratynocytów szczury transplantacyjnych na blizny i wyciągnąć wnioski na temat skuteczności tego kierunku przyciągania blizn.

Autorzy, którzy wykonali transplantację IPC na poparzonych ranach, zauważyli, że w pierwszym tygodniu po przeszczepie wielowarstwowej warstwy keratynocytów na oczyszczonych ranach, naskórek pogrubiał i uwarstwił się. Wszystkie warstwy naskórka były dobrze zdefiniowane. Interesujące jest to, że liczba warstw komórek w przeszczepach jest 10-30% większa niż w przypadku próbek z biopsji skóry. Autorzy odnotowali pojawienie się granulek keratogialiny w 5. Dobie po przeszczepie MPA, błony podstawnej i hemidesmosomów - już trzeciego dnia.

J. Rives i wsp. (L994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM i wsp. (1998) stwierdzili, że na początku okresu po transplantacji pacjentów BMD z polnosloynymi defektów skóry po oparzeniach, komunikacja między skóry właściwej i naskórka jest bardzo słaba i jest prosta, brodawkowatego warstwa jest nieobecny. Pod koniec drugiego miesiąca rozpoczyna się tworzenie płytkich brodawek i przydatków skóry, połączenie między skórą właściwą a naskórkiem staje się trwalsze. Dane literaturowe mówią o transplantacji allogenicznych keratynocytów na ranach chorych, co jest obiecującą metodą. Pomimo faktu, że odrzucenie allogenicznych keratynocytów występuje u różnych autorów w okresie od 10 dni do 3 miesięcy, to jednak spełniają swoją rolę w gojeniu powierzchni rany, izolacji czynników wzrostu i mechanicznym zamykaniu wady. Uważa się, że MPALK ma zmniejszoną aktywność antygenową, ponieważ podczas hodowli in vitro komórki Langerhansa tracą, co pozwala im przez dłuższy czas istnieć w organizmie biorcy. Ponadto, alogeniczna kultura uzyskana ze skóry młodych zdrowych ludzi ma nieporównywalnie większy potencjał biologiczny niż autologiczna kultura pacjentów po urazie.

Głównym celem naszych badań było sprawdzenie, czy allogeniczne keratynocyty przetrwają na bliznach i jakie będą zmiany w tkance bliznowatej pod wpływem takiej biologicznie czynnej "powłoki rany". W przypadku pozytywnego rezultatu opracuj najbardziej efektywną i najmniej pracochłonną technologię w tej dziedzinie medycyny rehabilitacyjnej.

Uzyskane przez nas dane pod wieloma względami okazały się podobne do danych literaturowych dotyczących zmian morfologicznych zachodzących w ludzkim naskórku po przeniesieniu allogenicznych keratynocytów do oparzeń. Istnieją jednak znaczne różnice, zarówno jeśli chodzi o podłoże morfologiczne, które zostało przeszczepione, jak i pod względem technologicznym. So. Proces tworzenia się błony podstawnej i połączenia dermo-naskórkowego (hemidesmosomy, brodawki) występuje w późniejszym terminie niż w transplantacji keratynocytów na powierzchni rany bez zmiany blizn. Wydaje się, że jest to spowodowane złym odżywianiem tkanek żwacza w porównaniu do skóry właściwej lub powięzi mięśniowej. Blizna, szczególnie stara, jest gęstą tkanką łączną z bardzo małą liczbą naczyń, dno rany oparzeniowej jest tkanką ziarninową bogatą w naczynia krwionośne. Zatem oczywiste jest, że warunki, w których następuje przeszczepianie i wszczepianie keratynocytów są całkowicie różne. Im bardziej unaczyniony obszar przeszczepiania komórek, tym łatwiej je przetwarzać. Z tego postulatu wynika wniosek dotyczący preferencji do pracy z młodymi bliznami, w których tkanka łączna jest wciąż wystarczająco luźna i bogata w naczynia krwionośne.

W wyniku tych prac eksperymentalnych udowodniono, że:

1. Możliwa jest transplantacja MALK-u na blizny. 
2. Optymalną metodą przeszczepu jest przeszczepienie keratynocytów na pokrywie rany.
3. Powierzchnię blizny należy szlifować za pomocą dermabrazji operacyjnej za pomocą lasera lub noża Schumanna.
4. Pod wpływem MPALK dochodzi do szybkiej epitelializacji powierzchni gruntu żwacza.
5. Im lepiej unaczyniona blizna, czyli im blizna blizna, tym lepsze wyniki przeszczepu keratynocytów.
6. Tkanka bliznowata pod wpływem przeszczepionych keratynocytów jest stopniowo przekształcana i zmienia się w skórną (bardziej krucha blizna z przydatkami skóry).
7. Stopniowe rozluźnienie tkanki bliznowatej rozpoczyna się od warstwy podnabłonkowej. Poprawia unaczynienie, wiązki włókien kolagenowych w górnej i dolnej części żwacza przyjmują bardziej kruchy punkt, niż w tkance bliznowatej bez przeszczepiania komórek. Są mieszki włosowe i gruczoły łojowe. Naskórek w swojej strukturze, po przejściu fazy hipertrofii, zbliża się do naskórka normalnej skóry.
8. Obserwowane zmiany związane z keratynocytów wydzielane czynniki wzrostu, cytokiny, że poprawa trofizm blizny przyczyniają się do jego transformacji na sztywno tkanki włóknistej w szerszą, co prowadzi do poprawy blizny.

Tak więc, na podstawie tego badania, można wywnioskować, że korzystne działanie przeszczepionych keratynocytów na tkankę bliznowatą, które mogą mieć praktyczne znaczenie dla rehabilitacji pacjentów z różnymi typami blizn.

Ta praca na szczurach pozwoliła również sformułować wymagania. Do opatrunków na rany, na których uprawia się keratynocyty.

Pokrycia rany powinny być:

• biokompatybilny z komórkami,
• oddychający,
• mieć elastyczną podstawę do formowania,
• być hydrofilowy,
• ponieważ dodatki lecznicze zawierają leki przeciwbakteryjne, a antyoksydanty nie są toksyczne dla hodowanych komórek.

Wyniki kliniczne biotechnologicznego leczenia blizn.

Wcześniej N. Carver i in. (1993) stwierdzili, że okluzyjne opatrunki najlepiej nadają się do mocowania do rany i przeżycia keratynocytów, ale nie pozwalają na tworzenie rozwarstwionego (dojrzałego) naskórka. Aby utworzyć warstwowy naskórek, konieczne jest środowisko powietrza. Dlatego po nałożeniu warstwy wielowarstwowej po 7-10 zalecono zasłonięcie rany okluzyjnej w celu usunięcia i przeprowadzenia ran w suchych bandażach lub maściach rozpuszczalnych w wodzie. Można powiedzieć, że jakość i właściwości "podłoża", na którym hodowane są komórki, są bardzo ważne dla skuteczności transplantacji materiału komórkowego, a w konsekwencji dla wyników pracy lekarzy. Ale dzisiaj nie ma idealnego opatrywania ran, pomimo obfitości proponowanych opcji (sztuczna skóra, włóknina karboksymetylocelulozy, powłoki fibrynowe, półprzepuszczalne folie poliuretanowe). Nieistotnym momentem w tej sprawie jest koszt "podłoży" (specjalnych powłok rany), ponieważ ich wysoki koszt zwiększa całkowity koszt leczenia biotechnologicznego.

Skuteczność technologii komórkowych została udowodniona do tej pory, ale, niestety, technologie te są bardzo drogie, szczególnie w krajach, w których nie ma ustalonej przemysłowej produkcji kompozycji komórkowych. Niemniej jednak, kraje takie jak Stany Zjednoczone od dawna zakładają przemysł do produkcji materiału komórkowego do transplantacji wypalonych. W szczególności, firma BioSurface Technology Inc od 1989 podniesiony 37.000 laminowanych warstw keratynocytów, które zostały użyte do leczenia 240 pacjentów w 79 krajach na całym świecie (R.Odessey, 1992), z 1 cm ² hodowli komórek kosztuje około 7-8 $ US.

Technologia leczenia różnych chorób i problemów skórnych ma wiele różnic, ale w sercu każdego leczenia komórkami jest wytwarzanie dobrej jakości materiału komórkowego i jego przeszczepianie.

Ten proces składa się z następujących kroków:

• wybór skóry od chorego (lub od dawcy),
• transport klapek skórnych do centrum biotechnologicznego,
• izolacja komórek warstwy podstawowej i ich namnażanie,
• gromadzenie wielowarstwowych warstw keratynocytów (IPC).
• transplantacja kultur komórkowych.

Głównym problemem w leczeniu transplantacyjnym wielowarstwowych warstw keratynocytów jest zapotrzebowanie na żywe komórki we wszystkich stadiach przeszczepiania komórek. Kawałki skóry do izolowania autologicznych lub allogenicznych komórek powinny być tak cienkie, jak to tylko możliwe, ponieważ w tym przypadku łatwiej je rozdzielać metodami mechanicznymi i enzymatycznymi oraz w celu uzyskania zawiesiny żywych komórek do wzrostu. Można je uzyskać poprzez odcięcie dermatomu lub użycie skóry powiek, napletka, wewnętrzną powierzchnię barku. Biorąc pod uwagę, że komórki są wrażliwe na chlorowce (chlor, jod), nadtlenek wodoru, nie można ich stosować w leczeniu skóry w momencie pobierania materiału.

Ilościowa i jakościowa wydajność komórek pochodzących z przeszczepów skóry oraz skuteczność ich uprawy zależy również od stanu zdrowia i wieku dawcy. Ponadto próbki biopsji skóry powinny być dostarczone do laboratorium tak szybko, jak to możliwe i w odpowiednich warunkach (środowisko, temperatura) dostarczone do certyfikowanego i akredytowanego laboratorium.

Średnia lub średnia orła 199 z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej, pożywka DMEM uzupełniona 5% płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami może być używana do przechowywania i transportu płatów skóry.

W laboratorium cytologicznym biopsję skórną najpierw dzielimy mechanicznie na małe kawałki, następnie przetwarzanie fragmentów skóry przeprowadza się za pomocą enzymów: trypsyny, kolagenazy, dyspazy itp.

Pod wpływem enzymów dochodzi do destrukcji przez desmosomy, a keratynocyty są uwalniane do podłoża jako oddzielne komórki lub agregaty składające się z różnej liczby komórek. Do hodowli stosuje się tylko podstawowe keratynocyty, które są hodowane na specjalnych pożywkach w inkubatorach zawierających 5% CO., Na płytkach Petriego lub w fiolkach wt = 37 ° C. W ciągu 48 godzin obserwuje się powstawanie kolonii keratynocytów, które stopniowo zbiegają się w monowarstwę. Po uzyskaniu dostatecznej liczby komórek uzyskaną zawiesinę rozprowadza się na przygotowanych w tym celu osłonach ran i umieszcza na płytkach Petriego. Z zawiesiny tworzy się najpierw monowarstwę, a następnie wielowarstwową warstwę keratynocytów. Schematycznie etapy procesu hodowli keratynocytów pokazano na ryc. 12 (33,43 54.65).

Tworzenie wielowarstwowego tworzenia keratynocytów odpowiedniego do przeszczepu trwa zwykle 7-10 dni. Czasami ten okres jest dłuższy, co zależy od jakości materiału źródłowego (wiek, zdrowie dawcy, poprawność materiału, jakość użytych nośników itp.). Jeśli wielowarstwowa warstwa zarasta, wówczas na jej powierzchni mogą znajdować się komórki z objawami apoptozy, które nie nadają się do przeszczepu. Szalki Petriego, wyhodowane w nich na ranach przez wielowarstwowe warstwy keratynocytów (IPC), są dostarczane do kliniki w specjalnych pojemnikach w temperaturze nie niższej niż + 15 ° C.

Zmodyfikowana metoda Greena dla rozwoju IPC

W naszej pracy jako powłoka rany użyliśmy wielowarstwowego prążkowania, porzucając folie z polipami, z którymi zaczęliśmy pracować w eksperymencie ze szczurami. Tak więc wielowarstwowe warstwy keratynocytów były przez nas hodowane na prefat i sterylnym batystu, chociaż nie jest to również optymalne pokrycie rany.

Przeprowadzono badania kliniczne na ochotnikach z zachowaniem niezbędnych norm etycznych: podpisanie traktatu i świadomej zgody.

1. Zastosowano hodowlę własnych (autologicznych) i pobranych z keratynocytów komórek banku (allogenicznych).
2. Własne keratynocyty uzyskano z kawałka skóry wyciętego od wewnętrznej strony barku pacjentów.
3. Operację dermabrazji blizn przeprowadzono za pomocą termoprzewodzącego, obrotowego dysku i lasera erbowego.
4. Przeprowadzono grupy pacjentów z bliznami normotroficznymi, hypotroficznymi i hipertroficznymi.

Proces technologiczny zastosowania technologii komórkowej do poprawy rodzaju blizn skórnych składał się z następujących etapów:

1. Wybór pacjentów.
2. Wyjaśnij istotę leczenia, czas uzyskania oczekiwanych rezultatów, podpisanie traktatu i świadomą zgodę.
3. Mianowanie pacjentów na 2-3 tygodnie przed operacją selmevit o 1t. 3 razy dziennie, zinkteral na 1t. 3 razy dziennie.
4. Biorąc kawałek skóry o długości 2,0 cm i szerokości 0,7-1,0 cm od wewnętrznej powierzchni barku, wysoki, prawie w dolnej części regionu pachowego, w celu uzyskania autologicznych keratynocytów.
5. W przypadku, gdy pacjenci odmówili wyizolowania własnych keratynocytów z powodu możliwości uzyskania liniowej blizny na wewnętrznej powierzchni barku, materiał komórkowy pobrano z banku komórek (allogeniczne keratynocyty).
6. Keratynocyty wyizolowano i hodowano w warunkach laboratorium certyfikowanego do tego rodzaju pracy.
7. Po otrzymaniu IPC wystarczającej do przeszczepienia, dzień operacji został podany na blizny w klinice, gdzie materiał został przyniesiony w specjalnych pojemnikach na płytkach Petriego.
8. Przeprowadzono operację dermabrazji żwacza, hemostazę, powierzchnię ziemi przemyto sterylnym roztworem soli fizjologicznej, wysuszono, po czym IPC przesadzono na sterylne komórki batystu "w dół". Oznacza to, że komórki, które były górne w MIC, były niższe, w sąsiedztwie wypolerowanej powierzchni.
9. Na wierzch nałożono sterylny film, który przymocowano do skóry za pomocą elastycznego bandaża lub elastycznego opaski Omnibix. Zamiast folii można również stosować obojętne powłoki z rany zawierające silikon, na przykład Mepitel, Mepiform, płytki z żelem silikonowym.

Po 5-7 dniach usuwa się folię lub powłokę silikonową. W tym czasie wszystkie keratynocyty muszą się czołgać na wypolerowanej blizny i przyczepiać się do jej powierzchni.

10. Mokre środowisko utworzone pod folią i silikonową powłoką aktywnie przyczynia się do tego. Baptysta pozostający na bliznie od tego miejsca może być nasycony kuriozą lub żelem chitozanowym. W rezultacie w drugim dniu powstaje gęsta skorupa, która dla wygody pacjenta lepiej jest zamocować za pomocą elastycznego, przepuszczalnego dla powietrza tynku, na przykład Omnifix. Oddychająca skorupa pozwala na różnicowanie nowo powstałego naskórka i przekształcenie go w dojrzały.

W zależności od rodzaju blizny i głębokości szlifowania opatrunek zostaje odrzucony po 8-10 dniach. Naskórek w tym czasie ma o 30-40% więcej warstw komórkowych niż w normalnej skórze. Błona podstawna nie jest utworzona. Keratynocyty zagęszczonego naskórka uwalniają masę biologicznie aktywnych cząsteczek do tkanki bliznowatej.

Sukces biotechnologicznego leczenia blizn zależy w dużym stopniu od sposobu, w jaki się nimi opiekują w okresie pooperacyjnym. Hodowle komórkowe są "czułym" rodzajem pokrycia rany, a we wczesnych okresach po transplantacji BMD można łatwo oddzielić od leżących pod nią tkanek. Dlatego pacjenci powinni zadbać o bliznę po operacji. Przez 8-9 miesięcy nie trzeć i łatwo pracować z zimną przegotowaną wodą, aby uniknąć zerwania cienkiego, nowo powstałego naskórka, który nie ma ścisłego kontaktu z leżącymi pod nim tkankami.

Uwaga:

Przed operacją oraz w trakcie użytkowania dermabrazji chlorowcowanych oraz środkami konserwującymi (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, chlorheksydynę, nadtlenek wodoru) jest dopuszczalny przed przesadzeniem kletok- całkowicie przeciwwskazane ze względu na ich działanie cytotoksyczne. Toksyczne dla komórek są również błękitu metylenowego. Genialny zielony.

Aby uniknąć infekcji, szczególnie podczas pracy z przerosłymi bliznami, można leczyć pole operacyjne siarczanem neomycyny, polimyksyną lub gentamycyną. Nie wywierają działania cytotoksycznego na keratynocyty.

W wyniku tego leczenia uzyskuje się potrójny efekt.

1. Wyrównanie powierzchni żwacza.
2. Stwórz nad nim warstwę nowego naskórka o normalnej grubości.
3. Konwersja tkanki bliznowatej w dermopodobnuyu przez działanie cytokiny, czynniki wzrostu i inne biologicznie, cząsteczek wydzielanych przez przeszczepionych komórek i stymulowane keratynocyty nimi, fibroblasty i makrofagi.

Blizna staje się mniej zauważalna, bardziej elastyczna, pojawiają się w niej pory, włosy obciągające, pigmentacja może zostać przywrócona z powodu obecności melanocytów w MPC.

Jednak wszystkie te pozytywne momenty w bliznicy nie przychodzą natychmiast. W związku z tym konieczne jest ostrzeżenie pacjentów. że proces transformacji tkanki bliznowatej do skóry właściwej jest powolny, a optymalnego wyniku takiego leczenia można się spodziewać nie wcześniej niż 10-14 miesięcy. Natychmiast po odrzuceniu opatrunku polerowane powierzchnie mają wyraźną polichromię, a jaśniejszy proces szlifowania. Najmniejsze uszkodzenie skóry występuje podczas szlifowania blizn normotroficznych za pomocą lasera erbowego. Kolor blizn i otaczającej skóry został przywrócony w okresie od 3 do 8 tygodni. Pomimo takich środków ostrożności, czasami występuje pooperacyjne przebarwienie, które może trwać przez kilka miesięcy niezależnie.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]