Zastosowanie technologii komórkowych do poprawy wyglądu blizn

Współczesną naukę charakteryzuje szybki rozwój szeregu pokrewnych dyscyplin, zjednoczonych pod ogólną nazwą „biotechnologia”. Ten dział nauki, oparty na najnowszych osiągnięciach w dziedzinie biologii, cytologii, genetyki molekularnej, inżynierii genetycznej, transplantologii, ma na celu wykorzystanie ogromnego potencjału tkwiącego w komórkach roślinnych i zwierzęcych – podstawowych jednostkach strukturalnych wszystkich żywych istot. „Żywa komórka to gotowy reaktor biotechnologiczny, w którym realizowane są nie tylko procesy prowadzące do powstania produktu końcowego, ale także szereg innych, które pomagają utrzymać aktywność katalityczną układu na wysokim poziomie” – John Woodward, 1992. Początek nauki o komórkach został położony w 1665 roku, kiedy angielski fizyk R. Hooke stworzył pierwszy mikroskop i odkrył komórki – cellulae („komórki”) w korku. W 1829 roku M. Schleiden i T. Schwann uzasadnili „teorię komórkową”, która dowodziła, że wszystkie żywe istoty składają się z komórek. W 1858 roku R. Virchow udowodnił, że wszystkie choroby opierają się na naruszeniu organizacji strukturalnej i metabolizmu komórek. Został założycielem „patologii komórkowej”. Zasadniczy wkład w naukę o komórce wnieśli w latach 1907–1911 R. Harrison i A. A. Maksimow, którzy udowodnili możliwość hodowli komórek poza organizmem. Ich praca wykazała, że w celu hodowli komórek tkanki zwierzęce i części roślin muszą być mechanicznie rozdzielone na małe kawałki. Aby wyizolować komórki, tkanki są cięte ostrym nożem lub mikrotomem na cienkie plasterki, około 0,5–1,0 mm. Fizyczne rozdzielenie komórek nazywa się immobilizacją. Izolowane komórki uzyskuje się przez enzymatyczną dyspersję kawałków roślin lub tkanek. Po zmieleniu ostrymi nożyczkami kawałki są traktowane trypsyną lub kolagenazą w celu uzyskania zawiesiny – zawiesiny pojedynczych komórek lub ich mikroagregatów w specjalnym medium. Żele alginianowe (alginian wapnia) są szeroko stosowane do immobilizacji komórek roślinnych. Udowodniono, że unieruchomione komórki roślinne i zwierzęce zachowują zdolność do biosyntezy. Produkty biosyntezy komórkowej gromadzą się w komórkach, ich ekspresja zachodzi albo spontanicznie, albo za pomocą specjalnych substancji, które promują zwiększoną przepuszczalność błon komórkowych.

Hodowla komórek zwierzęcych jest procesem znacznie bardziej złożonym niż hodowla komórek roślinnych, wymagającym specjalistycznego nowoczesnego sprzętu, wysokiej technologii, obecności różnych mediów, czynników wzrostu zaprojektowanych w celu zachowania żywotności komórek i utrzymania ich w stanie wysokiej aktywności funkcjonalnej. Stwierdzono, że większość komórek tkanek stałych, takich jak tkanki nerek, wątroby i skóry, jest zależna od powierzchni, więc można je hodować in vitro tylko w postaci cienkich arkuszy lub monowarstw bezpośrednio związanych z powierzchnią podłoża. Długość życia, proliferacja i stabilność funkcjonalna komórek uzyskanych przez enzymatyczną dyspersję tkanek w dużej mierze zależą od podłoża, na którym są hodowane. Wiadomo, że wszystkie komórki uzyskane z tkanek kręgowców mają ujemny ładunek powierzchniowy, więc dodatnio naładowane podłoża nadają się do ich unieruchomienia. Izolowane komórki uzyskane bezpośrednio z całych tkanek można utrzymywać w hodowli pierwotnej w stanie unieruchomionym, zachowując jednocześnie wysoką specyficzność i czułość przez 10-14 dni. Unieruchomione, zależne od powierzchni komórki odgrywają obecnie ważną rolę w biologii, zwłaszcza w badaniach klinicznych. Służą do badania cykli rozwojowych komórek, regulacji ich wzrostu i różnicowania, różnic funkcjonalnych i morfologicznych między komórkami normalnymi i nowotworowymi. Unieruchomione monowarstwy komórkowe są wykorzystywane w biotestach, do ilościowego oznaczania substancji biologicznie czynnych, a także do badania wpływu różnych leków i toksyn na nie. Lekarze wszystkich specjalności od dziesięcioleci wykazują duże zainteresowanie komórką jako środkiem terapeutycznym. Technologie komórkowe obecnie szybko rozwijają się w tym kierunku.

Początek terapii tkankowej i komórkowej wiąże się z nazwiskiem słynnego rosyjskiego naukowca W.P. Filatowa, który w 1913 r. położył podwaliny pod doktrynę terapii tkankowej, badając wyniki przeszczepów rogówki od zdrowych dawców pacjentom z zaćmą. W procesie pracy z przeszczepami rogówki odkrył, że rogówka przechowywana na zimnie przez 1-3 dni w temperaturze -2-4 stopni C lepiej się zakorzenia niż świeża. W ten sposób odkryto właściwość komórek do wydzielania niektórych substancji w niekorzystnych warunkach, które pobudzają procesy życiowe w przeszczepionych tkankach i regeneracyjne w tkankach biorcy. Tkanki i komórki oddzielone od organizmu znajdują się w stanie stresu, czyli powolnej aktywności życiowej. Krążenie krwi w nich zatrzymuje się, a zatem odżywianie. Oddychanie tkanek jest niezwykle utrudnione, unerwienie i trofizm są zaburzone. Będąc w nowym stanie jakościowym, dostosowując się do nowych warunków bytu, komórki wytwarzają specjalne substancje o właściwościach leczniczych. Te substancje o charakterze niebiałkowym zostały nazwane przez VP Filatova stymulantami biogennymi. Ustalił on wspólnie z VV Skorodinską, że materiał pochodzący od zwierząt i roślin może być swobodnie autoklawowany w temperaturze t 120 stopni C przez godzinę po przetrzymaniu w niekorzystnych warunkach, a one nie tylko nie tracą aktywności, ale wręcz przeciwnie, zwiększają ją, co zostało wyjaśnione uwalnianiem stymulantów biologicznych z konserwowanych tkanek. Ponadto tracą właściwości antygenowe, co znacznie zmniejsza możliwość odrzucenia. Konserwowany sterylny materiał wprowadzano do organizmu poprzez implantację (plantację) pod skórę lub w postaci zastrzyków ekstraktów, z odpowiednimi wynikami. Odkryto również, że tkanki płodowe zawierają znacznie większą liczbę substancji biologicznie czynnych niż tkanki osobników dorosłych, a niektóre czynniki występują tylko w zarodkach. Zaszczepione tkanki płodowe nie są postrzegane przez organizm biorcy jako obce ze względu na brak białek odpowiedzialnych za specyficzność gatunkową, tkankową i indywidualną (białka głównego kompleksu zgodności tkankowej) w błonach cytoplazmatycznych. W rezultacie zaszczepienie zwierzęcych tkanek płodowych do organizmu ludzkiego nie uruchamia mechanizmów ochrony immunologicznej i reakcji niezgodności i odrzucenia. VP Filatov szeroko stosował ludzkie łożysko i skórę w swojej praktyce lekarskiej. Kursy leczenia składały się z 30-45 zastrzyków ekstraktów tkankowych i 1-2 implantacji autoklawowanych tkanek.

Rozpocząwszy badania od tkanek i komórek ludzkich i zwierzęcych, przeniósł swoje uogólnienia do świata roślin. Prowadząc eksperymenty z żywymi częściami roślin (aloes, babka, agawa, boćwina, dziurawiec itp.), stworzył im niekorzystne warunki, umieszczając ścięte liście w ciemnym miejscu, ponieważ roślina potrzebuje światła do swoich funkcji życiowych. Wyizolował również stymulatory biogeniczne z mułu i torfu estuariów, z uwagi na fakt, że muł i torf powstają przy udziale mikroflory i mikrofauny.

Terapia tkankowa otrzymała nową rundę rozwoju pod koniec lat 70., kiedy wiedza i doświadczenie gromadzone przez dziesięciolecia pozwoliły na wykorzystanie tkanek i komórek zwierzęcych i roślinnych na jakościowo nowym poziomie do leczenia ludzi i przedłużania ich aktywnej długowieczności. Tak więc w niektórych klinikach krajowych i szeregu zagranicznych kobiety w fizjologicznej menopauzie z zespołem klimakteryjnym lub na tle owariektomii zaczęły poddawać się terapii tkankowej tkankami płodowymi łożyska, podwzgórza, wątroby, jajników, grasicy i tarczycy, aby spowolnić proces starzenia, rozwój miażdżycy, osteoporozy, dysfunkcji układu odpornościowego, endokrynologicznego i nerwowego. W jednej z najbardziej prestiżowych klinik gerontokosmetologii w Europie Zachodniej od kilku dziesięcioleci w tych samych celach stosuje się zastrzyki z ekstraktów uzyskanych z tkanek płodowych gonad baranów.

W naszym kraju biostymulujące leczenie znalazło również szerokie zastosowanie. Do niedawna pacjentom z różnymi chorobami aktywnie przepisywano zastrzyki z wyciągów z łożyska, aloesu, kalanchoe, sedum major (biosed), FiBS, destylatu borowinowego, peloidyny, torfu, humisolu, przygotowywanych według metody V.P. Filatova. Obecnie prawie niemożliwe jest kupienie w aptekach tych wysoce skutecznych i niedrogich domowych preparatów tkankowych pochodzenia zwierzęcego, roślinnego i mineralnego.

Podstawą pozyskiwania różnych preparatów biogennych z ludzkich tkanek i narządów produkcji importowanej, takich jak rumalon (z tkanki chrzęstnej i szpiku kostnego), actovegin (z krwi cielęcej), solcoseryl (ekstrakt z krwi bydlęcej), a także preparatów krajowych - ciało szkliste (z ciała szklistego oka bydła), kerakol (z rogówki bydła), splenin (ze śledziony bydła), epithalamin (z okolicy nawzgórzowo-nasadowej) są również badania VP Filatova. Wspólną cechą wszystkich preparatów tkankowych jest ogólny wpływ na cały organizm jako całość. Tak więc „Terapia tkankowa” akademika VP Filatova stała się podstawą większości nowoczesnych osiągnięć i kierunków w chirurgii, immunologii, położnictwie i ginekologii, gerontologii, combustiologii, dermatologii i kosmetologii związanych z komórką i produktami jej biosyntezy.

Problem przeszczepu tkanek niepokoi ludzkość od czasów starożytnych. Tak więc w papirusie Ebersa, datowanym na 8000 r. p.n.e., znajduje się już wzmianka o stosowaniu przeszczepu tkanek w celu kompensacji defektów w poszczególnych obszarach ciała. W „Księdze życia” indyjskiego naukowca Sushruty, który żył 1000 lat p.n.e., znajduje się szczegółowy opis odtworzenia nosa ze skóry policzków i czoła.

Zapotrzebowanie na skórę dawcy rosło proporcjonalnie do wzrostu liczby operacji plastycznych i rekonstrukcyjnych. W tym zakresie zaczęto wykorzystywać skórę zwłok i płodów. Istniała potrzeba zachowania zasobów dawców i znalezienia sposobów na zastąpienie skóry ludzkiej tkankami zwierzęcymi oraz różnych opcji modelowania skóry. I to właśnie w tym kierunku pracowali naukowcy, gdy w 1941 r. P. Medovar po raz pierwszy zademonstrował fundamentalną możliwość wzrostu keratynocytów in vitro. Kolejnym ważnym etapem w rozwoju technologii komórkowych była praca Karaska M. i Charltona M., którzy w 1971 r. przeprowadzili pierwszą udaną transplantację autologicznych keratynocytów z hodowli pierwotnej na rany królika, wykorzystując żel kolagenowy jako podłoże do hodowli CC, co poprawiło proliferację komórek w hodowli. J. Rheinvvald. H Green. opracował technologię seryjnej hodowli dużych ilości ludzkich keratynocytów. W 1979 roku Green i jego współautorzy odkryli perspektywy terapeutycznego wykorzystania hodowli komórek keratynocytów w regeneracji skóry w przypadkach rozległych oparzeń, po czym tę technikę, stale udoskonalaną, zaczęli stosować chirurdzy w ośrodkach leczenia oparzeń za granicą i w naszym kraju.

W procesie badania żywych komórek stwierdzono, że komórki produkują nie tylko stymulatory biogenne pochodzenia niebiałkowego, ale także szereg cytokin, mediatorów, czynników wzrostu, polipeptydów, które odgrywają ważną rolę w regulacji homeostazy całego organizmu. Stwierdzono, że różne komórki i tkanki zawierają peptydowe bioregulatory, które mają szeroki zakres działania biologicznego i koordynują procesy rozwoju i funkcjonowania układów wielokomórkowych. Rozpoczęła się era stosowania hodowli komórkowej jako środka terapeutycznego. W naszym kraju w ostatnich dziesięcioleciach w combustiologii przyjęto przeszczepianie zawiesiny fibroblastów i wielowarstwowych warstw komórek keratynocytów. Tak aktywne zainteresowanie przeszczepianiem komórek skóry pacjentom poparzonym tłumaczy się potrzebą szybkiego zamknięcia dużych powierzchni oparzeń i niedoborem skóry dawcy. Możliwość wyizolowania komórek z małego kawałka skóry, zdolnego pokryć powierzchnię rany 1000, a nawet 10 000 razy większą niż powierzchnia skóry dawcy, okazała się bardzo atrakcyjna i ważna dla combustiologii i pacjentów z oparzeniami. Odsetek wszczepienia warstwy keratynocytów waha się w zależności od obszaru oparzenia, wieku i stanu zdrowia pacjenta od 71,5 do 93,6%. Zainteresowanie przeszczepem keratynocytów i fibroblastów wiąże się nie tylko z możliwością szybkiego zamknięcia ubytku skóry, ale również z faktem, że przeszczepy te mają silny potencjał biologicznie czynny w zakresie poprawy wyglądu tkanek uzyskanych w wyniku przeszczepu. Tworzenie nowych naczyń, łagodzenie niedotlenienia, poprawa trofizmu, przyspieszone dojrzewanie niedojrzałej tkanki - to morfo-funkcjonalna podstawa tych pozytywnych zmian zachodzących dzięki uwalnianiu czynników wzrostu i cytokin przez przeszczepione komórki. W ten sposób, dzięki wprowadzeniu do praktyki medycznej postępowych technologii komórkowych do transplantacji wielokomórkowych warstw autologicznych i allogenicznych keratynocytów i fibroblastów na duże powierzchnie ran, spalacze byli w stanie nie tylko zmniejszyć śmiertelność ofiar oparzeń z wysokim odsetkiem zmian skórnych, ale także jakościowo poprawić tkankę bliznowatą, która nieuchronnie pojawia się w miejscu oparzeń stopnia IIb, IIIa i b. Doświadczenie spalaczy zdobyte w leczeniu powierzchni ran u pacjentów z oparzeniami zasugerowało pomysł wykorzystania już zmodyfikowanej metody Greena w praktyce dermatochirurgicznej w przypadku różnych patologii skóry i kosmetycznych (owrzodzenia troficzne, bielactwo, znamiona, pęcherzowe oddzielanie się naskórka, usuwanie tatuaży, zmiany skórne związane z wiekiem oraz poprawa wyglądu blizn).

Zastosowanie allogenicznych keratynocytów w chirurgii, combustiologii i dermatokosmetologii ma szereg zalet w porównaniu z zastosowaniem autologicznych keratynocytów, ponieważ materiał komórkowy można przygotować wcześniej w nieograniczonych ilościach, zakonserwować i wykorzystać w razie potrzeby. Wiadomo również, że allogeniczne CC mają zmniejszoną aktywność antygenową, ponieważ podczas hodowli in vitro tracą komórki Langerhansa, które są nośnikami antygenów kompleksu HLA. Za zastosowaniem allogenicznych CC przemawia również fakt, że są one zastępowane autologicznymi po przeszczepie, według różnych autorów, w ciągu 10 dni do 3 miesięcy. W związku z tym w wielu krajach powstały dziś banki komórek, dzięki którym możliwe jest uzyskanie przeszczepów komórek w wymaganej ilości i we właściwym czasie. Takie banki istnieją w Niemczech, USA i Japonii.

Zainteresowanie wykorzystaniem technologii komórkowych w dermatokosmetologii wynika z faktu, że „kompozycje komórkowe” niosą w sobie potężny potencjał bioenergetyczny i informacyjny, dzięki czemu możliwe jest uzyskanie jakościowo nowych wyników leczenia. Autokiny wydzielane przez przeszczepione komórki (czynniki wzrostu, cytokiny, tlenek azotu itp.) działają przede wszystkim na własne fibroblasty organizmu, zwiększając ich aktywność syntetyczną i proliferacyjną. Fakt ten jest szczególnie atrakcyjny dla badaczy, ponieważ fibroblast jest kluczową komórką skóry właściwej, której aktywność funkcjonalna determinuje stan wszystkich warstw skóry. Wiadomo również, że po uszkodzeniu skóry za pomocą koagulacji, lasera, igły i innych instrumentów, skóra zostaje uzupełniona świeżymi prekursorami macierzystymi fibroblastów ze szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej i perycytów naczyń włosowatych, co przyczynia się do „odmłodzenia” puli komórek ciała. Aktywnie rozpoczynają syntezę kolagenu, elastyny, enzymów, glikozaminoglikanów, czynników wzrostu i innych biologicznie aktywnych cząsteczek, co prowadzi do zwiększonego nawilżenia i unaczynienia skóry właściwej, poprawiając jej wytrzymałość,