Niewirusowa terapia genowa daje nadzieję na przewlekły ból krzyża

W niedawnym badaniu opublikowanym w czasopiśmie Biomaterials naukowcy opracowali nową, niewirusową terapię genową do leczenia dyskogennego bólu pleców (DBP) poprzez dostarczanie czynnika transkrypcyjnego Forkhead Pudełko F1 (FOXF1) wykorzystujące zmodyfikowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (eEV) w zwyrodnieniowe krążki międzykręgowe (IVD) in vivo.

Przewlekły ból krzyża (LBP) to rosnący problem globalny ze względu na starzenie się społeczeństwa i pogłębiające się problemy z opioidami. Obecne metody leczenia obejmują krótkotrwałą ulgę lub kosztowne operacje, co podkreśla potrzebę stosowania terapii nieuzależniających i mniej inwazyjnych.

Obecne terapie biologiczne, w tym podawanie czynników wzrostu, terapia komórkowa i wirusowe terapie genowe, mogą zmniejszyć zwyrodnienie w modelach zwierzęcych i ludzkich. Jednakże obawy, takie jak skutki krótkoterminowe, słaba skuteczność długoterminowa oraz niepotrzebna immunogenność i rakotwórczość, mogą uniemożliwić bezpośrednie zastosowanie tych metod.

W tym badaniu naukowcy opracowali niewirusową terapię genową w leczeniu zwyrodnienia krążka międzykręgowego (IVD) przy użyciu FOXF1-eEV.

Naukowcy transfekowali pierwotne embrionalne fibroblasty myszy (PMEF) plazmidem zawierającym FOXF1 lub pCMV6 jako kontrolę i scharakteryzowali próbki eEV za pomocą testu śledzenia nanocząstek (NTA).

Ocenili efektywne ładowanie ładunku molekularnego do pojazdów elektrycznych za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) i konwencjonalnej PCR. Analiza Western blot zidentyfikowała FOXF1 i specyficzne białka EV w formacjach eEV. Zespół wykorzystał plazmidy wzmacniające regiony polilinkera powyżej i poniżej, aby określić obecność plazmidowego DNA FOXF1 w komórkach dawcy i wygenerować eEV.

Zbadali pełnej długości mRNA wytwarzane z plazmidowego DNA w eEV i komórkach dawcy.

Naukowcy stworzyli pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zawierające czynniki transkrypcyjne w celu przywracania funkcji tkanek i modyfikowania reakcji na ból w zwierzęcym modelu DBP.

Zidentyfikowali białka EV służące do transportu i dystrybucji FOXF1 do uszkodzonych krążków międzykręgowych w mysim modelu dyskogennego bólu pleców, aby określić hamowanie zwyrodnienia krążka międzykręgowego przez FOXF1 eEV.

Zespół połączył badania biomechaniczne krążków międzykręgowych myszy z obrazowaniem, zmianami w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i reakcjami na ból ocenianymi po 12 tygodniach, aby potwierdzić zmiany w strukturze i funkcji, a także ból wywołany interwencją terapeutyczną.

Ocena bólu przedoperacyjnego i pooperacyjnego obejmowała tomografię mikrokomputerową (mikro-CT), rezonans magnetyczny (MRI), testy mechaniczne, barwienie błękitem Alcian (AB) i czerwienią pikrozyriusza (PSR), test błękitu dimetylometylenowego i immunohistochemię (IHC ) ).

Badanie obejmowało technikę chirurgiczną, polegającą na wstrzykiwaniu myszom Buprenorfiny ER podskórnie w celu opanowania bólu pooperacyjnego.

Zespół przeprowadził ocenę zachowania przed operacją i co dwa tygodnie od czterech do dwunastu tygodni po operacji, stosując różne techniki, takie jak test otwartego pola, zimna płyta, zawieszenie ogonowe i zawieszenie drutowe.

W teście otwartego pola oceniono spontaniczną aktywność myszy; w testach zimnej płyty zmierzono przeczulicę cieplną; W testach zawieszenia ogonowego zmierzono ból osiowy; i testy zawieszenia drutu zmierzyły wytrzymałość.

Dwanaście tygodni po operacji zespół dokonał sekcji kręgosłupa lędźwiowego zwierząt, korzystając ze śledzenia nerwu udowego i tętnic, aby zidentyfikować krążki międzykręgowe między L4 i L5, L5 i L6 oraz L6 i S1 IVD. Wykorzystali IVD L5/L6 do oceny histologii i określenia zawartości glikozaminoglikanów (GAG).

EV FOXF1 znacznie zmniejszały reakcje bólowe, przywracając strukturę i funkcję IVD, w tym poprawę wysokości krążka, nawodnienia tkanki, zawartości proteoglikanów i właściwości mechanicznych.

Badanie skupiało się na uwalnianiu eEV obciążonych FOXF1 z pierwotnych fibroblastów transfekowanych czynnikiem transkrypcyjnym FOXF1. Ilościowa metoda RT PCR wykazała znaczny wzrost poziomów transkryptu mRNA FOXF1 i poziomów transkrypcji mRNA FOXF1 pełnej długości w porównaniu z komórkami transfekowanymi pCMV6.

Terapia FOXF1 eEV może zmniejszyć reakcję bólową w mysim modelu punkcji krążka lędźwiowego przez okres do 12 tygodni. Samice myszy wykazywały dłuższy czas akwizycji w grupie leczonej FOXF1 niż w grupie uszkodzonej, który utrzymywał się przez co najmniej 12 tygodni po leczeniu.

Terapia FOXF1 eEV poprawiła nawodnienie i wysokość tkanki IVD u rannych i zwyrodnieniowych zwierząt in vivo, przy jednoczesnym utrzymaniu poziomu nawodnienia i intensywności obrazu IVD zależnego od T2.

Zespół zaobserwował jednak spadek wysokości krążka międzykręgowego u rannych zwierząt i zwierząt leczonych pCMV6 eEV. U myszy leczonych FOXF1 eEV nie zaobserwowano zmniejszenia wysokości krążka międzykręgowego 12 tygodni po leczeniu. Płeć nie miała wpływu na wyniki funkcjonalne.

FOXF1 eEV przywracają funkcję mechaniczną uszkodzonych i zdegenerowanych wyrobów IVD in vivo. Pod wpływem naprężenia osiowego wyroby IVD traktowane FOXF1 eEV wykazywały wyższą znormalizowaną sztywność NZ w porównaniu z uszkodzonymi IVD.

W warunkach pełzania uszkodzone wyroby IVD wykazywały zwiększone znormalizowane przemieszczenia w wyniku pełzania, co wskazuje na spadek znormalizowanej sztywności sprężystej przy pełzaniu.

Wyniki pokazują, że zmniejszenie zawartości GAG w uszkodzonych IVD zwiększa elastyczność mechaniczną, ale terapia eEV zapobiega utracie glikozaminoglikanów i późniejszym zmianom funkcji mechanicznych.

FOXF1 eEV spowodowały zmiany strukturalne i funkcjonalne w IVD poprzez zwiększenie poziomu proteoglikanów i GAG.

Wyniki badania wykazały, że eEV obciążone rozwojowymi czynnikami transkrypcyjnymi mogą leczyć bolesne choroby stawów, takie jak DBP, dostarczając te czynniki transkrypcyjne do zwyrodnieniowych i bolesnych stawów IVD.

Ta strategia może pomóc w ograniczeniu nieprawidłowości strukturalnych i funkcjonalnych spowodowanych chorobą, a także regulować reakcję bólową specyficzną dla płci.

Naukowcy zalecili także wykorzystanie rozwojowych czynników transkrypcyjnych, takich jak FOXF1, do przekształcenia zwyrodnieniowych komórek NP w stan proanaboliczny in vivo. Konieczne są dalsze badania, aby określić jego skuteczność terapeutyczną.