Hematopoetyczne komórki macierzyste

Komórki macierzyste układu krwiotwórczego (HSC), podobnie jak komórki progenitorowe układu mezenchymalnego, charakteryzują się multipotencjalnością i dają początek liniom komórkowym, których elementy końcowe tworzą elementy krwi, a także szereg wyspecjalizowanych komórek tkankowych układu odpornościowego.

Hipoteza istnienia wspólnego prekursora wszystkich komórek krwi, jak i samo określenie „komórka macierzysta”, należy do A. Maksimowa (1909). Potencjał tworzenia masy komórkowej w HSC jest ogromny – komórki macierzyste szpiku kostnego produkują dziennie 10 komórek, które stanowią elementy uformowane krwi obwodowej. Sam fakt istnienia komórek macierzystych hematopoezy został ustalony w 1961 roku w eksperymentach nad przywróceniem hematopoezy u myszy, które otrzymały śmiertelną dawkę promieniowania radioaktywnego niszczącego komórki macierzyste szpiku kostnego. Po przeszczepieniu syngenicznych komórek szpiku kostnego takim śmiertelnie napromieniowanym zwierzętom, w śledzionie biorców znaleziono dyskretne ogniska hematopoezy, których źródłem były pojedyncze klonogeniczne komórki prekursorowe.

Następnie udowodniono zdolność komórek macierzystych układu krwiotwórczego do samoutrzymywania się, zapewniając funkcję hematopoezy w procesie ontogenezy. W procesie rozwoju embrionalnego komórki macierzyste układu krwiotwórczego (HSC) wyróżniają się wysoką aktywnością migracyjną, niezbędną do ich przemieszczania się do stref formowania narządów krwiotwórczych. Ta właściwość komórek HSC jest zachowana również w ontogenezie - dzięki ich ciągłej migracji następuje stałe odnawianie puli komórek immunokompetentnych. Zdolność komórek HSC do migracji, przenikania przez bariery histohematyczne, implantacji w tkankach i wzrostu klonogennego stała się podstawą przeszczepiania komórek szpiku kostnego w szeregu chorób związanych z patologią układu krwiotwórczego.

Podobnie jak wszystkie zasoby komórek macierzystych, komórki macierzyste układu krwiotwórczego występują w swojej niszy (szpiku kostnym) w bardzo małych ilościach, co powoduje pewne trudności w ich izolacji. Immunofenotypowo ludzkie komórki macierzyste HSC charakteryzują się jako komórki NK CD34+ zdolne do migracji do krwiobiegu i zasiedlania narządów układu odpornościowego lub ponownego zasiedlania podścieliska szpiku kostnego. Należy jasno zrozumieć, że komórki HSC nie są najbardziej niedojrzałymi komórkami szpiku kostnego, ale pochodzą z prekursorów, do których należą uśpione fibroblastopodobne komórki CD34-ujemne. Ustalono, że komórki o fenotypie CD34 są zdolne do przedostania się do ogólnego krwiobiegu, gdzie zmieniają swój fenotyp na CD34+, ale po odwrotnej migracji do szpiku kostnego, pod wpływem mikrośrodowiska, ponownie stają się elementami komórek macierzystych CD34-ujemnych. W stanie spoczynku komórki CD34~ nie reagują na parakrynowe sygnały regulacyjne podścieliska (czynniki wzrostu, cytokiny). Jednak w sytuacjach wymagających zwiększonej intensywności hematopoezy komórki macierzyste o fenotypie CD34 reagują na sygnały różnicowania, tworząc zarówno komórki progenitorowe hematopoetyczne, jak i mezenchymalne. Hematopoeza zachodzi poprzez bezpośredni kontakt komórek HSC z elementami komórkowymi podścieliska szpiku kostnego, reprezentowanymi przez złożoną sieć makrofagów, komórek śródbłonka siateczkowatego, osteoblastów, fibroblastów podścieliska i macierzy zewnątrzkomórkowej. Podścielisko szpiku kostnego nie jest tylko macierzą lub „szkieletem” dla tkanki hematopoetycznej; przeprowadza ono precyzyjną regulację hematopoezy dzięki parakrynowym sygnałom regulacyjnym czynników wzrostu, cytokin i chemokin, a także zapewnia interakcje adhezyjne niezbędne do tworzenia komórek krwi.

Tak więc stale odnawiający się system hematopoezy opiera się na polipotencjalnej (z punktu widzenia hematopoezy) hematopoetycznej komórce macierzystej zdolnej do długotrwałego samoutrzymywania. W procesie zaangażowania HSC przechodzą pierwotne różnicowanie i tworzą klony komórek różniących się cechami cytomorfologicznymi i immunofenotypowymi. Sekwencyjne formowanie pierwotnych i zaangażowanych komórek progenitorowych kończy się formowaniem morfologicznie identyfikowalnych komórek progenitorowych różnych linii hematopoetycznych. Rezultatem kolejnych etapów złożonego wieloetapowego procesu hematopoezy jest dojrzewanie komórek i uwalnianie dojrzałych elementów uformowanych do krwi obwodowej - erytrocytów, leukocytów, limfocytów i trombocytów.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Źródła komórek macierzystych układu krwiotwórczego

Komórki macierzyste układu krwiotwórczego są uważane za najlepiej zbadane źródło komórek macierzystych, co w dużej mierze wynika z ich klinicznego zastosowania w przeszczepach szpiku kostnego. Na pierwszy rzut oka wiadomo o tych komórkach całkiem sporo. W pewnym stopniu jest to prawdą, ponieważ pośrednie i dojrzałe potomstwo komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) jest najbardziej dostępnym elementem komórkowym, z którego każdy (erytrocyty, leukocyty, limfocyty, monocyty/makrofagi i płytki krwi) został dokładnie zbadany na wszystkich poziomach - od mikroskopii świetlnej do elektronowej, od cech biochemicznych i immunofenotypowych po identyfikację metodami analizy PCR. Jednak monitorowanie parametrów morfologicznych, ultrastrukturalnych, biochemicznych, immunofenotypowych, biofizycznych i genomicznych komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) nie dostarczyło odpowiedzi na wiele problematycznych kwestii, których rozwiązanie jest niezbędne do rozwoju transplantologii komórkowej. Mechanizmy stabilizacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego w stanie uśpienia, ich aktywacji, wejścia w fazę podziału symetrycznego lub asymetrycznego i, co najważniejsze, zaangażowania w tworzenie tak odmiennych funkcjonalnie elementów krwi, jak erytrocyty, leukocyty, limfocyty i płytki krwi, nie zostały dotychczas poznane.

Obecność w szpiku kostnym komórek o fenotypie CD34, które są prekursorami zarówno komórek macierzystych mezenchymalnych, jak i hematopoetycznych, podniosła kwestię istnienia najwcześniejszych prekursorów różnicowania komórkowego w linie podścieliskowe i hematopoetyczne, bliskich komórkom CD34-ujemnym. Tak zwana komórka inicjująca długoterminową hodowlę (LTC-IC) została uzyskana przy użyciu metody hodowli długoterminowej. Czas życia takich komórek prekursorowych o aktywności tworzącej kolonie na podłożu podścieliskowym szpiku kostnego przy określonej kombinacji czynników wzrostu przekracza 5 tygodni, podczas gdy żywotność zaangażowanych jednostek tworzących kolonie (CFU) w hodowli wynosi zaledwie 3 tygodnie. Obecnie LTC-IC jest uważany za funkcjonalny analog HSC, ponieważ przy wysokim potencjale repopulacyjnym około 20% LTC-IC charakteryzuje się fenotypem CD34+CD38- i wykazuje wysoką zdolność do samoodnawiania. Takie komórki występują w ludzkim szpiku kostnym z częstością 1:50 000. Jednak komórki mieloidalno-limfoidalne inicjujące, które są uzyskiwane w długoterminowych (15 tygodni) warunkach hodowli, należy uznać za najbliższe HSC. Takie komórki, określane jako LTC, należą do komórek szpiku kostnego ludzkiego mózgu, występują 10 razy rzadziej niż LTC-IC i tworzą linie komórkowe zarówno linii mieloidalnych, jak i limfoidalnych linii hematopoetycznych.

Chociaż znakowanie komórek macierzystych układu krwiotwórczego przeciwciałami monoklonalnymi, a następnie identyfikacja immunofenotypowa jest główną metodą rozpoznawania i selektywnego sortowania komórek hematopoetycznych o potencjale macierzystym, kliniczne zastosowanie tak wyizolowanych komórek HSC jest ograniczone. Blokowanie receptora CD34 lub innych antygenów markerowych przeciwciałami podczas immunopozytywnego sortowania nieuchronnie zmienia właściwości komórki wyizolowanej za jego pomocą. Za bardziej preferowaną uważa się immunonegatywną izolację komórek HSC na kolumnach magnetycznych. Jednak w tym przypadku do sortowania zwykle stosuje się przeciwciała monoklonalne utrwalone na nośniku metalowym. Ponadto, co ważne, obie metody izolacji komórek HSC opierają się na cechach fenotypowych, a nie funkcjonalnych. Dlatego wielu badaczy woli stosować analizę parametrów klonogenicznych komórek HSC, co pozwala określić stopień dojrzałości i kierunek różnicowania komórek progenitorowych na podstawie wielkości i składu kolonii. Wiadomo, że w trakcie procesu angażowania liczba komórek i ich typy w kolonii maleją. Hematopoetyczna komórka macierzysta i jej wczesna komórka potomna, nazywana „jednostką tworzącą kolonie granulocytów-erytrocytów-monocytów-megakariocytów” (CFU-GEMM), tworzą duże kolonie wieloliniowe w hodowli zawierające odpowiednio granulocyty, erytrocyty, monocyty i megakariocyty. Jednostka tworząca kolonie granulocytów-monocytów (CFU-GM), zlokalizowana w dół wzdłuż linii zobowiązania, tworzy kolonie granulocytów i makrofagów, a jednostka tworząca kolonie granulocytów (CFU-G) tworzy tylko małą kolonię dojrzałych granulocytów. Wczesny prekursor erytrocytów, jednostka tworząca wybuch erytrocytów (CFU-E), jest źródłem dużych kolonii erytrocytów, a bardziej dojrzała jednostka tworząca kolonie erytrocytów (CFU-E) jest źródłem małych kolonii erytrocytów. Ogólnie rzecz biorąc, gdy komórki rosną na podłożu półstałym, można zidentyfikować komórki tworzące sześć typów kolonii mieloidalnych: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E i CFU-E).

Jednak oprócz pochodnych hematopoetycznych, każdy materiał źródłowy do izolowania HSC zawiera znaczną liczbę towarzyszących komórek. W związku z tym konieczne jest wstępne oczyszczenie przeszczepu, przede wszystkim z aktywnych komórek układu odpornościowego dawcy. Zazwyczaj w tym celu stosuje się immunoselekcję, opartą na ekspresji specyficznych antygenów przez limfocyty, co umożliwia ich izolację i usunięcie za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Ponadto opracowano immunorozetkową metodę deplecji limfocytów T przeszczepu szpiku kostnego, która opiera się na tworzeniu kompleksów limfocytów CD4+ i specyficznych przeciwciał monoklonalnych, skutecznie usuwanych za pomocą aferezy. Metoda ta zapewnia produkcję oczyszczonego materiału komórkowego z 40-60% zawartością komórek macierzystych hematopoetycznych.

Zwiększenie liczby komórek progenitorowych w wyniku usunięcia dojrzałych elementów uformowanych krwi z produktu leukaferezy uzyskuje się poprzez wirowanie przeciwprądowe, a następnie filtrację (w obecności chelatora - cytrynianu trójsodowego) przez kolumny zawierające włókna nylonowe pokryte immunoglobuliną ludzką. Sekwencyjne stosowanie tych dwóch metod zapewnia całkowite oczyszczenie przeszczepu z płytek krwi, 89% z erytrocytów i 91% z leukocytów. Dzięki znacznemu zmniejszeniu utraty komórek HSC poziom komórek CD34+ w całkowitej masie komórkowej może wzrosnąć do 50%.

Zdolność izolowanych komórek macierzystych układu krwiotwórczego do tworzenia kolonii dojrzałych komórek krwi w hodowli jest wykorzystywana do funkcjonalnej charakterystyki komórek. Analiza utworzonych kolonii pozwala na identyfikację i ilościowe określenie typów komórek progenitorowych, stopnia ich zaangażowania i ustalenie kierunku ich różnicowania. Aktywność klonogenna jest określana w półstałych mediach na metylocelulozie, agarze, osoczu lub żelu fibrynowym, które zmniejszają aktywność migracyjną komórek, zapobiegając ich przywieraniu do powierzchni szkła lub plastiku. W optymalnych warunkach hodowli klony rozwijają się z pojedynczej komórki w ciągu 7-18 dni. Jeśli klon zawiera mniej niż 50 komórek, jest identyfikowany jako pojedynczy klaster; jeśli liczba komórek przekracza 50, jest identyfikowany jako kolonia. Pod uwagę brana jest liczba komórek zdolnych do utworzenia kolonii (jednostki tworzące kolonie - CFU lub komórki tworzące kolonie - COC). Należy zauważyć, że parametry CFU i COC nie odpowiadają liczbie komórek HSC w zawiesinie komórek, chociaż z nią korelują, co po raz kolejny podkreśla potrzebę określenia aktywności funkcjonalnej (tworzącej kolonie) komórek HSC in vitro.

Spośród komórek szpiku kostnego komórki macierzyste układu krwiotwórczego mają najwyższy potencjał proliferacyjny, dzięki czemu tworzą największe kolonie w hodowli. Liczbę takich kolonii proponuje się pośrednio określić liczbę komórek macierzystych. Po utworzeniu kolonii in vitro o średnicy przekraczającej 0,5 mm i liczbie komórek przekraczającej 1000, autorzy przetestowali takie komórki pod kątem odporności na subletalne dawki 5-fluorouracylu i zbadali ich zdolność do ponownego zasiedlania szpiku kostnego śmiertelnie napromieniowanych zwierząt. Zgodnie z podanymi parametrami wyizolowane komórki były prawie nie do odróżnienia od komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) i otrzymały skrótowy symbol HPP-CFC - komórki tworzące kolonie o wysokim potencjale proliferacyjnym.

Trwają poszukiwania lepszej jakości izolacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Jednak komórki macierzyste układu krwiotwórczego są morfologicznie podobne do limfocytów i stanowią stosunkowo jednorodny zbiór komórek o prawie okrągłych jądrach, drobno rozproszonej chromatynie i niewielkiej ilości słabo zasadochłonnej cytoplazmy. Ich dokładna liczba jest również trudna do ustalenia. Zakłada się, że komórki macierzyste układu krwiotwórczego (HSC) w ludzkim szpiku kostnym występują z częstością 1 na 106 komórek jądrzastych.

Identyfikacja komórek macierzystych układu krwiotwórczego

Aby poprawić jakość identyfikacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego, wykonuje się sekwencyjne lub jednoczesne (na sorterze wielokanałowym) badanie spektrum antygenów związanych z błoną komórkową, a w przypadku komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) fenotyp CD34+CD38 należy łączyć z brakiem liniowych markerów różnicowania, w szczególności antygenów komórek immunokompetentnych, takich jak CD4, immunoglobuliny powierzchniowe i glikoforyna.

Prawie wszystkie schematy fenotypowania komórek macierzystych układu krwiotwórczego obejmują określenie antygenu CD34. To glikoproteina o masie cząsteczkowej około 110 kDa, niosąca kilka miejsc glikozylacji, jest wyrażana na błonie komórkowej plazmy po aktywacji odpowiadającego genu zlokalizowanego na chromosomie 1. Funkcja cząsteczki CD34 jest związana z interakcją wczesnych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego z podstawą podścieliska szpiku kostnego za pośrednictwem L-selektyny. Należy jednak pamiętać, że obecność antygenu CD34 na powierzchni komórki pozwala jedynie na wstępną ocenę zawartości HSC w zawiesinie komórek, ponieważ jest on również wyrażany przez inne komórki progenitorowe układu krwiotwórczego, a także komórki podścieliska szpiku kostnego i komórki śródbłonka.

Podczas różnicowania komórek progenitorowych układu krwiotwórczego ekspresja CD34 jest trwale zmniejszona. Erytrocyty, granulocyty i monocytarne zaangażowane komórki progenitorowe albo słabo wyrażają antygen CD34, albo w ogóle nie wyrażają go na swojej powierzchni (fenotyp CD34). Antygen CD34 nie jest wykrywany na błonie powierzchniowej zróżnicowanych komórek szpiku kostnego i dojrzałych komórek krwi.

Należy zauważyć, że w dynamice różnicowania komórek progenitorowych układu krwiotwórczego nie tylko poziom ekspresji CD34 maleje, ale również ekspresja antygenu CD38, integralnego glikoproteiny błonowej o masie cząsteczkowej 46 kDa, która ma aktywność NAD-glikohydrolazy i ADP-rybozylocyklazy, stopniowo wzrasta, co sugeruje jej udział w transporcie i syntezie ADP-rybozy. W ten sposób pojawia się możliwość podwójnej kontroli stopnia zaangażowania komórek progenitorowych układu krwiotwórczego. Populacja komórek o fenotypie CD34+CD38+, która stanowi od 90 do 99% komórek szpiku kostnego CD34-dodatnich, zawiera komórki progenitorowe o ograniczonym potencjale proliferacyjnym i różnicującym, podczas gdy komórki o fenotypie CD34+CD38 mogą rościć sobie prawo do roli HSC.

Rzeczywiście, populacja komórek szpiku kostnego opisana wzorem CD34+CD38- zawiera stosunkowo dużą liczbę pierwotnych komórek macierzystych zdolnych do różnicowania się w kierunku mieloidalnym i limfoidalnym. W warunkach długotrwałej hodowli komórek o fenotypie CD34+CD38- możliwe jest uzyskanie wszystkich dojrzałych uformowanych elementów krwi: neutrofili, eozynofili, bazofili, monocytów, megakariocytów, erytrocytów i limfocytów.

Niedawno ustalono, że komórki CD34-pozytywne ekspresują dwa kolejne markery, AC133 i CD90 (Thy-1), które są również używane do identyfikacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Antygen Thy-1 jest współekspresowany z receptorem CD117 (c-kit) na komórkach CD34+ szpiku kostnego, krwi pępowinowej i krwi obwodowej. Jest to powierzchniowe glikoproteiny wiążące fosfatydyloinozytol o masie cząsteczkowej 25-35 kDa, które uczestniczą w procesach adhezji komórkowej. Niektórzy autorzy uważają, że antygen Thy-1 jest markerem najbardziej niedojrzałych komórek CD34-pozytywnych. Samoreprodukujące się komórki o fenotypie CD34+Thy-1+ dają początek długoterminowym hodowanym liniom z tworzeniem komórek potomnych. Zakłada się, że antygen Thy-1 blokuje sygnały regulacyjne, które powodują zatrzymanie podziału komórek. Mimo że komórki CD34+Thy1+ są zdolne do samoreprodukcji i tworzenia długotrwałych linii hodowlanych, ich fenotypu nie można przypisać wyłącznie komórkom macierzystym krwi (HSC), gdyż zawartość Thy-1+ w całkowitej masie elementów komórkowych CD34-dodatnich wynosi około 50%, co znacznie przewyższa liczbę komórek hematopoetycznych.

Bardziej obiecujące dla identyfikacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego powinno być rozpoznanie AC133 - markera antygenowego komórek progenitorowych układu krwiotwórczego, którego ekspresję po raz pierwszy wykryto na komórkach wątroby zarodkowej. AC133 to glikoproteina transbłonowa, która pojawia się na powierzchni błony komórkowej na najwcześniejszych etapach dojrzewania komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) - możliwe, że nawet wcześniej niż antygen CD34. W badaniach A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) ustalono, że AC133 jest wyrażany przez do 30% komórek wątroby zarodkowej CD34-dodatnich.

Tak więc, według obecnych koncepcji, idealny profil fenotypowy komórek macierzystych układu krwiotwórczego składa się z zarysu komórkowego, którego zarysy powinny obejmować konfiguracje antygenów CD34, AC133 i Thy-1, ale nie ma w nim miejsca na projekcje molekularne CD38, HLA-DR i liniowe markery różnicowania GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Odmianą fenotypowego portretu HSC może być kombinacja CD34+CD45RalowCD71low, ponieważ właściwości komórek opisanych tym wzorem nie różnią się od parametrów funkcjonalnych komórek o fenotypie CD34+CD38. Ponadto ludzkie HSC można zidentyfikować na podstawie cech fenotypowych CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit/low - tylko 30 takich komórek całkowicie przywraca hematopoezę u śmiertelnie napromieniowanych myszy.

40-letni okres intensywnych badań nad komórkami macierzystymi krwi (HSC), które są zdolne zarówno do samoreprodukcji, jak i różnicowania się w inne elementy komórkowe, rozpoczął się od analizy ogólnych cech fenotypowych komórek szpiku kostnego, co pozwoliło uzasadnić stosowanie przeszczepu szpiku kostnego w leczeniu różnych patologii układu krwiotwórczego. Nowe typy komórek macierzystych odkryte później nie znalazły jeszcze szerokiego zastosowania w praktyce klinicznej. Jednocześnie komórki macierzyste krwi pępowinowej i wątroby zarodkowej są w stanie znacznie zwiększyć skalę przeszczepu komórek nie tylko w hematologii, ale także w innych dziedzinach medycyny, ponieważ różnią się od komórek macierzystych szpiku kostnego zarówno pod względem cech ilościowych, jak i jakościowych.

Objętość masy komórek macierzystych krwiotwórczych wymagana do przeszczepu jest zazwyczaj uzyskiwana ze szpiku kostnego, krwi obwodowej i pępowinowej oraz wątroby zarodkowej. Ponadto komórki progenitorowe krwiotwórcze można uzyskać in vitro poprzez namnażanie ESC z ich późniejszym ukierunkowanym różnicowaniem w elementy komórkowe krwiotwórcze. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) słusznie zauważają istotne różnice we właściwościach immunologicznych i zdolności do przywracania hematopoezy HSC różnego pochodzenia, co wynika z nierównego stosunku wczesnych pluripotentnych i późnych zaangażowanych komórek progenitorowych zawartych w ich źródłach. Ponadto komórki macierzyste krwiotwórcze uzyskane z różnych źródeł macierzystych charakteryzują się ilościowo i jakościowo całkowicie różnymi asocjacjami komórek niehematopoetycznych.

Szpik kostny stał się już tradycyjnym źródłem komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Zawiesinę komórek szpiku kostnego uzyskuje się z kości biodrowej lub mostka poprzez płukanie w znieczuleniu miejscowym. Uzyskana w ten sposób zawiesina jest heterogeniczna i zawiera mieszaninę komórek macierzystych krwi (HSC), elementów komórek podścieliska, zaangażowanych komórek progenitorowych linii mieloidalnych i limfoidalnych, a także dojrzałych uformowanych elementów krwi. Liczba komórek o fenotypie CD34+ i CD34+CD38 wśród komórek jednojądrowych szpiku kostnego wynosi odpowiednio 0,5-3,6 i 0-0,5%. Krew obwodowa po indukowanej G-CSF mobilizacji komórek macierzystych krwi (HSC) zawiera 0,4-1,6% CD34+ i 0-0,4% CD34+CD38.

Odsetek komórek o immunofenotypach CD34+CD38 i CD34+ jest wyższy we krwi pępowinowej - 0-0,6 i 1-2,6%, a największą ich liczbę stwierdza się wśród komórek hematopoetycznych wątroby zarodka - odpowiednio 0,2-12,5 i 2,3-35,8%.

Jednak jakość przeszczepionego materiału zależy nie tylko od liczby zawartych w nim komórek CD34+, ale także od ich aktywności funkcjonalnej, którą można ocenić na podstawie poziomu formowania kolonii in vivo (repopulacja szpiku kostnego u zwierząt śmiertelnie napromieniowanych) oraz in vitro - na podstawie wzrostu kolonii na półpłynnych podłożach. Okazało się, że aktywność kolonizacyjna i proliferacyjna komórek macierzystych układu krwiotwórczego o fenotypie CD34+CD38 HLA-DR izolowanych z wątroby zarodka, szpiku kostnego płodu i krwi pępowinowej znacznie przewyższa potencjał proliferacyjny i kolonizacyjny komórek krwiotwórczych szpiku kostnego i krwi obwodowej osoby dorosłej. Ilościowa i jakościowa analiza komórek HSC różnego pochodzenia wykazała istotne różnice zarówno w ich względnej zawartości w zawiesinie komórkowej, jak i zdolnościach funkcjonalnych. Maksymalną liczbę komórek CD34+ (24,6%) stwierdzono w przeszczepionym materiale uzyskanym ze szpiku kostnego płodu. Szpik kostny osoby dorosłej zawiera 2,1% elementów komórkowych CD34-dodatnich. Spośród komórek jednojądrowych krwi obwodowej osoby dorosłej tylko 0,5% ma fenotyp CD34+, podczas gdy we krwi pępowinowej ich liczba sięga 2%. Jednocześnie zdolność tworzenia kolonii komórek CD34+ szpiku kostnego płodu jest 2,7 razy większa niż zdolność wzrostu klonalnego komórek hematopoetycznych szpiku kostnego osoby dorosłej, a komórki krwi pępowinowej tworzą znacznie więcej kolonii niż elementy hematopoetyczne izolowane z krwi obwodowej osób dorosłych: odpowiednio 65,5 i 40,8 kolonii/105 komórek.

Różnice w aktywności proliferacyjnej i zdolności do tworzenia kolonii komórek macierzystych układu krwiotwórczego są związane nie tylko z różnym stopniem ich dojrzałości, ale także z ich naturalnym mikrośrodowiskiem. Wiadomo, że intensywność proliferacji i szybkość różnicowania komórek macierzystych są determinowane przez integralny efekt regulacyjny wieloskładnikowego układu czynników wzrostu i cytokin, które są wytwarzane zarówno przez same komórki macierzyste, jak i przez elementy komórkowe ich mikrośrodowiska macierzysto-podścieliskowego. Zastosowanie oczyszczonych populacji komórek i pożywek bez surowicy do hodowli komórek pozwoliło na scharakteryzowanie czynników wzrostu, które mają stymulujący i hamujący wpływ na komórki macierzyste różnego poziomu, komórki progenitorowe i komórki zaangażowane w jednym lub drugim kierunku liniowym. Wyniki badań przekonująco wskazują, że HSC uzyskane ze źródeł o różnym stopniu rozwoju ontogenetycznego różnią się zarówno fenotypowo, jak i funkcjonalnie. HSC na wcześniejszych etapach ontogenezy charakteryzują się wysokim potencjałem samoreprodukcji i wysoką aktywnością proliferacyjną. Takie komórki wyróżniają się dłuższymi telomerami i ulegają zaangażowaniu w tworzenie wszystkich linii komórek hematopoetycznych. Odpowiedź układu odpornościowego na HSC pochodzenia embrionalnego jest opóźniona, ponieważ takie komórki słabo wyrażają cząsteczki HLA. Istnieje wyraźna gradacja względnej zawartości HSC, ich zdolności do samoodnawiania i liczby typów linii zaangażowania, które tworzą: komórki CD34+ wątroby embrionalnej > komórki CD34+ krwi pępowinowej > komórki CD34+ szpiku kostnego. Ważne jest, że takie różnice są nieodłączne nie tylko dla okresów wewnątrz-, neo- i wczesnego postnatalnego rozwoju człowieka, ale także dla całej ontogenezy - aktywność proliferacyjna i tworząca kolonie HSC uzyskanych ze szpiku kostnego lub krwi obwodowej osoby dorosłej jest odwrotnie proporcjonalna do wieku dawcy.