Hematopoetyczne komórki macierzyste woreczka żółtkowego

Oczywiste jest, że różne potencjały proliferacyjne i różnicujące komórek macierzystych układu krwiotwórczego są determinowane przez osobliwości ich rozwoju ontogenetycznego, ponieważ nawet lokalizacja głównych obszarów hematopoezy zmienia się u ludzi w trakcie ontogenezy. Komórki progenitorowe układu krwiotwórczego woreczka żółtkowego płodu są zobowiązane do tworzenia wyłącznie erytropoetycznej linii komórkowej. Po migracji pierwotnych komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) do wątroby i śledziony spektrum linii zobowiązań rozszerza się w mikrośrodowisku tych narządów. W szczególności komórki macierzyste układu krwiotwórczego nabywają zdolność do generowania komórek linii limfoidalnej. W okresie prenatalnym komórki progenitorowe układu krwiotwórczego osiągają strefę ostatecznej lokalizacji i zasiedlają szpik kostny. Podczas rozwoju wewnątrzmacicznego krew płodu zawiera znaczną liczbę komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Na przykład w 13. tygodniu ciąży poziom HSC osiąga 18% całkowitej liczby mononuklearnych komórek krwi. Następnie obserwuje się postępujący spadek ich zawartości, ale nawet przed urodzeniem ilość HSC we krwi pępowinowej niewiele różni się od ich ilości w szpiku kostnym.

Zgodnie z klasycznymi koncepcjami, naturalna zmiana lokalizacji hematopoezy podczas rozwoju embrionalnego ssaków odbywa się poprzez migrację i wprowadzenie do nowego mikrośrodowiska pluripotentnych komórek macierzystych hematopoezy - z woreczka żółtkowego do wątroby, śledziony i szpiku kostnego. Ponieważ na wczesnych etapach rozwoju embrionalnego tkanka hematopoetyczna zawiera dużą liczbę komórek macierzystych, która zmniejsza się w miarę dojrzewania płodu, za najbardziej obiecującą do uzyskania komórek macierzystych hematopoezy uważa się tkankę hematopoetyczną wątroby zarodka, izolowaną z materiału poronionego w 5-8 tygodniu ciąży.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Pytania o pochodzenie komórek macierzystych układu krwiotwórczego

Nie ma wątpliwości, że embrionalne formowanie erytrocytów ma swój początek w wyspach krwi woreczka żółtkowego. Jednak potencjał różnicowania in vitro komórek hematopoetycznych woreczka żółtkowego jest bardzo ograniczony (różnicują się głównie w erytrocyty). Należy zauważyć, że przeszczepienie komórek macierzystych hematopoetycznych woreczka żółtkowego nie jest w stanie przywrócić hematopoezy przez długi czas. Okazało się, że komórki te nie są prekursorami dorosłych HSC. Prawdziwe HSC pojawiają się wcześniej, w 3-5 tygodniu rozwoju wewnątrzmacicznego, w strefie formowania tkanki żołądka i śródbłonka naczyń krwionośnych (paraaortic splanchnopleura, P-SP), a także w miejscu aorty, gonad i nerek pierwotnych - w mezonephros lub tzw. regionie AGM. Wykazano, że komórki regionu AGM są źródłem nie tylko komórek macierzystych krwi (HSC), ale także komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, a także osteoklastów zaangażowanych w procesy formowania tkanki kostnej. W 6. tygodniu ciąży wczesne komórki progenitorowe hematopoezy z regionu AGM przemieszczają się do wątroby, która pozostaje głównym narządem hematopoetycznym płodu aż do narodzin.

Ponieważ ten punkt jest niezwykle ważny z punktu widzenia transplantacji komórek, problem pochodzenia HSC w procesie ludzkiej embriogenezy zasługuje na bardziej szczegółowe omówienie. Klasyczne idee, że hematopoetyczne komórki macierzyste ssaków i ptaków pochodzą ze źródła pozazarodkowego, opierają się na badaniach Metcalfa i Moore'a, którzy jako pierwsi zastosowali metody klonowania HSC i ich potomków wyizolowanych z woreczka żółtkowego. Wyniki ich pracy posłużyły za podstawę teorii migracji, zgodnie z którą HSC, po pojawieniu się po raz pierwszy w woreczku żółtkowym, kolejno zasiedlają przejściowe i ostateczne narządy hematopoetyczne, gdy tworzy się w nich odpowiednie mikrośrodowisko. W ten sposób ustalono punkt widzenia, że generacja HSC, początkowo zlokalizowana w woreczku żółtkowym, służy jako komórkowa podstawa dla ostatecznej hematopoezy.

Komórki macierzyste hematopoezy woreczka żółtkowego należą do kategorii najwcześniejszych komórek macierzystych hematopoezy. Ich fenotyp opisuje wzór AA4.1+CD34+c-kit+. W przeciwieństwie do dojrzałych komórek macierzystych szpiku kostnego HSC nie ekspresjonują antygenów Sca-1 i cząsteczek MHC. Wydaje się, że pojawienie się antygenów markerowych na błonach powierzchniowych komórek macierzystych woreczka żółtkowego podczas hodowli odpowiada ich różnicowaniu podczas rozwoju embrionalnego z tworzeniem zaangażowanych linii hematopoetycznych: poziom ekspresji antygenów CD34 i Thy-1 spada, ekspresja CD38 i CD45RA wzrasta, a pojawiają się cząsteczki HLA-DR. Wraz z późniejszą specjalizacją in vitro indukowaną przez cytokiny i czynniki wzrostu rozpoczyna się ekspresja antygenów specyficznych dla komórek macierzystych hematopoezy określonej linii komórkowej. Jednakże wyniki badania hematopoezy embrionalnej u przedstawicieli trzech klas kręgowców (płazów, ptaków i ssaków), a w szczególności analiza pochodzenia komórek macierzystych krwi (HSC) odpowiedzialnych za ostateczną hematopoezę w ontogenezie postnatalnej, przeczą klasycznym koncepcjom. Ustalono, że u przedstawicieli wszystkich rozpatrywanych klas podczas embriogenezy powstają dwa niezależne regiony, w których powstają komórki macierzyste krwi (HSC). Pozazarodkowy „klasyczny” region jest reprezentowany przez woreczek żółtkowy lub jego analogi, podczas gdy niedawno zidentyfikowana strefa wewnątrzzarodkowa lokalizacji komórek macierzystych krwi (HSC) obejmuje mezenchymę paraaortalną i region AGM. Obecnie można argumentować, że u płazów i ptaków ostateczna hematopoeza pochodzi ze źródeł wewnątrzzarodkowych, podczas gdy u ssaków i ludzi nie można jeszcze całkowicie wykluczyć udziału komórek macierzystych krwi (HSC) woreczka żółtkowego w ostateczną hematopoezę.

Hematopoeza zarodkowa w woreczku żółtkowym jest w istocie pierwotną erytropoezą, która charakteryzuje się zachowaniem jądra na wszystkich etapach dojrzewania erytrocytów i syntezą hemoglobiny typu płodowego. Według najnowszych danych fala pierwotnej erytropoezy kończy się w woreczku żółtkowym w 8. dniu rozwoju embrionalnego. Następuje po niej okres gromadzenia się ostatecznych komórek progenitorowych erytrocytów - BFU-E, które powstają wyłącznie w woreczku żółtkowym i pojawiają się po raz pierwszy w 9. dniu ciąży. Na kolejnym etapie embriogenezy powstają już ostateczne komórki progenitorowe erytrocytów - CFU-E, a także (!) komórki tuczne i CFU-GM. Stanowi to podstawę poglądu, że ostateczne komórki progenitorowe powstają w woreczku żółtkowym, migrują z krwią, osiadają w wątrobie i szybko inicjują pierwszą fazę wewnątrzzarodkowej hematopoezy. Zgodnie z tymi koncepcjami woreczek żółtkowy można uważać z jednej strony za miejsce pierwotnej erytropoezy, a z drugiej strony za pierwsze źródło ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych w rozwoju embrionalnym.

Wykazano, że komórki tworzące kolonie o wysokim potencjale proliferacyjnym można wyizolować z woreczka żółtkowego już w 8. dniu ciąży, tj. na długo przed zamknięciem układu naczyniowego zarodka i woreczka żółtkowego. Ponadto komórki o wysokim potencjale proliferacyjnym uzyskane z woreczka żółtkowego in vitro tworzą kolonie, których wielkość i skład komórkowy nie różnią się od odpowiednich parametrów wzrostu kulturowego komórek macierzystych szpiku kostnego. Jednocześnie przy retransplantacji komórek tworzących kolonie woreczka żółtkowego o wysokim potencjale proliferacyjnym powstaje znacznie więcej potomnych komórek tworzących kolonie i wielopotencjalnych komórek progenitorowych niż przy wykorzystaniu komórek progenitorowych hematopoezy szpiku kostnego.

Ostateczny wniosek na temat roli hematopoetycznych komórek macierzystych woreczka żółtkowego w definitywnej hematopoezie mogą być dostarczone przez wyniki pracy, w której autorzy uzyskali linię komórek śródbłonka woreczka żółtkowego (G166), która skutecznie wspierała proliferację swoich komórek z fenotypowymi i funkcjonalnymi cechami HSC (AA4.1+WGA+, niska gęstość i słabe właściwości adhezyjne). Zawartość tych ostatnich wzrosła ponad 100-krotnie, gdy hodowano je na warstwie odżywczej komórek C166 przez 8 dni. Makrofagi, granulocyty, megakariocyty, komórki blastyczne i monocyty, a także komórki prekursorowe limfocytów B i T zidentyfikowano w mieszanych koloniach hodowanych na podwarstwie komórek C166. Komórki woreczka żółtkowego rosnące na podwarstwie komórek śródbłonka miały zdolność do samoreprodukcji i wytrzymywały do trzech pasaży w eksperymentach autorów. Przywrócenie hematopoezy z ich pomocą u dojrzałych myszy z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID) wiązało się z powstawaniem wszystkich typów leukocytów, a także limfocytów T i B. Jednak autorzy w swoich badaniach wykorzystali komórki woreczka żółtkowego 10-dniowego zarodka, w którym układy naczyniowe zewnątrz- i wewnątrzzarodkowe są już zamknięte, co nie pozwala nam wykluczyć obecności wewnątrzzarodkowych komórek macierzystych krwi (HSC) wśród komórek woreczka żółtkowego.

Jednocześnie analiza potencjału różnicowania komórek hematopoetycznych wczesnych stadiów rozwoju, wyizolowanych przed zjednoczeniem układów naczyniowych woreczka żółtkowego i zarodka (8-8,5 dnia ciąży), wykazała obecność prekursorów komórek T i B w woreczku żółtkowym, ale nie w ciele zarodka. W układzie in vitro, metodą dwuetapowej hodowli na monowarstwie komórek nabłonkowych i podnabłonkowych grasicy, komórki jednojądrowe woreczka żółtkowego różnicowały się w limfocyty pre-T i dojrzałe T. W tych samych warunkach hodowli, ale na monowarstwie komórek podścieliska wątroby i szpiku kostnego, komórki jednojądrowe woreczka żółtkowego różnicowały się w limfocyty pre-B i dojrzałe limfocyty IglVT-B.

Wyniki tych badań wskazują na możliwość rozwoju komórek układu odpornościowego z tkanki pozazarodkowej woreczka żółtkowego, a powstawanie pierwotnych linii komórek T i B uzależnione jest od czynników mikrośrodowiska podścieliska narządów krwiotwórczych zarodka.

Inni autorzy wykazali również, że woreczek żółtkowy zawiera komórki o potencjale do różnicowania limfoidalnego, a powstałe limfocyty nie różnią się pod względem cech antygenowych od tych u zwierząt dojrzałych płciowo. Ustalono, że komórki woreczka żółtkowego 8-9-dniowego zarodka są zdolne do przywrócenia limfopoezy w grasicy atymocytów wraz z pojawieniem się dojrzałych limfocytów CD3+CD4+- i CD3+CD8+- posiadających uformowany repertuar receptorów komórek T. Tak więc grasica może być zasiedlona przez komórki pochodzenia pozazarodkowego, ale nie można wykluczyć prawdopodobnej migracji wczesnych komórek prekursorowych limfocytów T ze źródeł wewnątrzzarodkowych limfopoezy do grasicy.

Jednocześnie przeszczepienie komórek hematopoetycznych woreczka żółtkowego dorosłym napromieniowanym biorcom nie zawsze skutkuje długoterminowym ponownym zasiedleniem stref lokalizacji wyczerpanej tkanki krwiotwórczej, a komórki woreczka żółtkowego in vitro tworzą znacznie mniej kolonii śledzionowych niż komórki regionu AGM. W niektórych przypadkach, wykorzystując komórki woreczka żółtkowego 9-dniowego zarodka, nadal możliwe jest osiągnięcie długoterminowego (do 6 miesięcy) ponownego zasiedlenia tkanki krwiotwórczej u napromieniowanych biorców. Autorzy uważają, że komórki woreczka żółtkowego o fenotypie CD34+c-kit+ nie tylko nie różnią się od komórek z regionu AGM pod względem zdolności do ponownego zasiedlania wyczerpanych narządów krwiotwórczych, ale także przywracają hematopoezę skuteczniej, ponieważ woreczek żółtkowy zawiera ich prawie 37 razy więcej.

Należy zauważyć, że w eksperymentach wykorzystano komórki hematopoetyczne woreczka żółtkowego z antygenami markerowymi komórek macierzystych hematopoetycznych (c-kit+ i/lub CD34+ i CD38+), które wstrzyknięto bezpośrednio do wątroby lub żyły brzusznej potomstwa samic myszy, którym podano zastrzyk busulfanu w 18. dniu ciąży. U takich nowonarodzonych zwierząt ich własna mielopoeza została gwałtownie zahamowana z powodu eliminacji komórek macierzystych hematopoetycznych spowodowanej przez busulfan. Po przeszczepie komórek macierzystych hematopoetycznych woreczka żółtkowego, uformowane elementy zawierające marker dawcy - dehydrogenazę glicerofosforanową - wykrywano we krwi obwodowej biorców przez 11 miesięcy. Stwierdzono, że komórki macierzyste woreczka żółtkowego przywracają zawartość komórek linii limfoidalnej, mieloidalnej i erytrocytowej we krwi, grasicy, śledzionie i szpiku kostnym, a poziom chimeryzmu był wyższy w przypadku wewnątrzwątrobowego niż dożylnego podania komórek woreczka żółtkowego. Autorzy uważają, że komórki macierzyste woreczka żółtkowego zarodków we wczesnym stadium rozwoju (do 10 dni) wymagają wstępnej interakcji z mikrośrodowiskiem hematopoetycznym wątroby, aby pomyślnie zasiedlić narządy hematopoetyczne dorosłych biorców. Możliwe, że istnieje unikalny etap rozwoju w embriogenezie, kiedy komórki woreczka żółtkowego, początkowo migrujące do wątroby, nabywają następnie zdolność do zasiedlania podścieliska narządów hematopoetycznych dojrzałych biorców.

W tym kontekście należy zauważyć, że chimeryzm komórek układu odpornościowego jest dość często obserwowany po przeszczepieniu komórek szpiku kostnego napromieniowanym dojrzałym biorcom - we krwi tych ostatnich komórki o fenotypie dawcy znajdują się w dość dużej ilości wśród limfocytów B, T i granulocytów biorcy, co utrzymuje się przez co najmniej 6 miesięcy.

Komórki hematopoetyczne u ssaków są po raz pierwszy wykrywane metodami morfologicznymi w 7. dniu rozwoju embrionalnego i są reprezentowane przez wyspy hematopoetyczne wewnątrz naczyń woreczka żółtkowego. Jednak naturalne różnicowanie hematopoetyczne w woreczku żółtkowym jest ograniczone do pierwotnych erytrocytów, które zatrzymują jądra i syntetyzują hemoglobinę płodową. Niemniej jednak tradycyjnie uważano, że woreczek żółtkowy służy jako jedyne źródło HSC migrujących do narządów hematopoetycznych rozwijającego się zarodka i zapewniających ostateczną hematopoezę u dorosłych zwierząt, ponieważ pojawienie się HSC w ciele zarodka zbiega się z zamknięciem układów naczyniowych woreczka żółtkowego i zarodka. Ten punkt widzenia jest wspierany przez dane, że komórki woreczka żółtkowego, gdy klonowane in vitro, dają początek granulocytom i makrofagom, a in vivo - koloniom śledziony. Następnie, w toku eksperymentów transplantacyjnych, ustalono, że komórki hematopoetyczne woreczka żółtkowego, które w samym woreczku żółtkowym są zdolne do różnicowania się wyłącznie w pierwotne erytrocyty, w mikrośrodowisku wątroby nowonarodzonych i dorosłych myszy SCID, wyczerpany grasica lub podścielisko odżywiające nabywają zdolność do ponownego zasiedlania narządów hematopoetycznych z przywróceniem wszystkich linii hematopoetycznych nawet u dorosłych zwierząt biorców. W zasadzie pozwala nam to klasyfikować je jako prawdziwe HSC - jako komórki, które funkcjonują w okresie postnatalnym. Zakłada się, że woreczek żółtkowy, wraz z regionem AGM, służy jako źródło HSC do ostatecznej hematopoezy u ssaków, ale ich wkład w rozwój układu krwiotwórczego jest nadal niejasny. Biologiczne znaczenie istnienia dwóch narządów hematopoetycznych o podobnych funkcjach we wczesnej embriogenezie ssaków jest również niejasne.

Poszukiwania odpowiedzi na te pytania trwają. In vivo udało się udowodnić obecność w woreczku żółtkowym 8-8,5-dniowych zarodków komórek, które przywracają limfopoezę u subletalnie napromieniowanych myszy SCID z wyraźnym niedoborem limfocytów T i B. Komórki hematopoetyczne woreczka żółtkowego wstrzykiwano zarówno dootrzewnowo, jak i bezpośrednio do śledziony i tkanki wątroby. Po 16 tygodniach u biorców wykryto limfocyty TCR/CD34 CD4+ i CD8+ oraz limfocyty B B-220+IgM+ znakowane genami antrx dawcy MHC. Jednocześnie autorzy nie znaleźli komórek macierzystych zdolnych do takiej odbudowy układu odpornościowego w organizmie 8-8,5-dniowych zarodków.

Komórki hematopoetyczne woreczka żółtkowego mają wysoki potencjał proliferacyjny i są zdolne do przedłużonej samoreprodukcji in vitro. Niektórzy autorzy identyfikują te komórki jako HSC na podstawie przedłużonej (prawie 7 miesięcy) generacji komórek progenitorowych erytrocytów, które różnią się od komórek progenitorowych szpiku kostnego linii erytrocytów dłuższym okresem pasażu, większymi rozmiarami kolonii, zwiększoną wrażliwością na czynniki wzrostu i dłuższą proliferacją. Ponadto w odpowiednich warunkach hodowli komórek woreczka żółtkowego in vitro powstają również komórki progenitorowe limfoidalne.

Przedstawione dane pozwalają nam ogólnie uznać woreczek żółtkowy za źródło komórek macierzystych krwi (HSC), mniej zaangażowanych, a zatem posiadających większy potencjał proliferacyjny niż komórki macierzyste szpiku kostnego. Jednak pomimo faktu, że woreczek żółtkowy zawiera pluripotentne komórki progenitorowe krwiotwórcze, które utrzymują różne linie różnicowania krwiotwórczego in vitro przez długi czas, jedynym kryterium kompletności komórek HSC jest ich zdolność do długoterminowego ponownego zasiedlania narządów krwiotwórczych biorcy, którego komórki krwiotwórcze są zniszczone lub genetycznie wadliwe. Tak więc kluczowym pytaniem jest, czy pluripotentne komórki krwiotwórcze woreczka żółtkowego mogą migrować i zasiedlać narządy krwiotwórcze i czy wskazane jest zrewidowanie znanych prac, które wykazują ich zdolność do ponownego zasiedlania narządów krwiotwórczych dojrzałych zwierząt wraz z utworzeniem głównych linii krwiotwórczych. Wewnątrzzarodkowe źródła ostatecznych GSC zidentyfikowano w zarodkach ptaków już w latach 70. XX wieku, co już wtedy podważało ustalone idee na temat pozazarodkowego pochodzenia GSC, w tym u przedstawicieli innych klas kręgowców. W ciągu ostatnich kilku lat pojawiły się publikacje na temat obecności podobnych obszarów wewnątrzzarodkowych zawierających GSC u ssaków i ludzi.

Należy raz jeszcze zauważyć, że podstawowa wiedza w tej dziedzinie jest niezwykle ważna dla praktycznej transplantologii komórek, ponieważ pomoże nie tylko ustalić preferowane źródło komórek HSC, ale także ustalić cechy interakcji pierwotnych komórek hematopoetycznych z genetycznie obcym organizmem. Wiadomo, że wprowadzenie komórek macierzystych hematopoetycznych ludzkiej wątroby płodowej do zarodka owcy na etapie organogenezy prowadzi do narodzin zwierząt chimerycznych, we krwi i szpiku kostnym, z których 3 do 5% ludzkich komórek hematopoetycznych jest stabilnie określonych. Jednocześnie ludzkie komórki HSC nie zmieniają swojego kariotypu, utrzymując wysoki wskaźnik proliferacji i zdolność do różnicowania. Ponadto przeszczepione ksenogeniczne komórki HSC nie wchodzą w konflikt z układem odpornościowym i fagocytami organizmu gospodarza i nie przekształcają się w komórki nowotworowe, co stanowiło podstawę intensywnego rozwoju metod wewnątrzmacicznej korekty dziedzicznej patologii genetycznej z wykorzystaniem komórek HSC lub ESC transfekowanych wadliwymi genami.

Ale na jakim etapie embriogenezy bardziej właściwe jest przeprowadzenie takiej korekty? Po raz pierwszy komórki określone do hematopoezy pojawiają się u ssaków bezpośrednio po implantacji (6. dzień ciąży), gdy morfologiczne oznaki różnicowania hematopoetycznego i domniemanych narządów hematopoetycznych są jeszcze nieobecne. Na tym etapie rozproszone komórki zarodka myszy są zdolne do ponownego zasiedlenia narządów hematopoetycznych napromieniowanych biorców z utworzeniem erytrocytów i limfocytów, które różnią się od komórek gospodarza rodzajem hemoglobiny lub izomerazy glicerofosforanowej, odpowiednio, a także dodatkowym markerem chromosomalnym (Tb) komórek dawcy. U ssaków, podobnie jak u ptaków, równocześnie z woreczkiem żółtkowym, przed zamknięciem wspólnego łożyska naczyniowego, komórki hematopoetyczne pojawiają się bezpośrednio w ciele zarodka w splanchnopleurze paraaortalnej. Komórki hematopoetyczne o fenotypie AA4.1+ wyizolowano z regionu AGM i scharakteryzowano jako wielopotencjalne komórki hematopoetyczne, które tworzą limfocyty T i B, granulocyty, megakariocyty i makrofagi. Fenotypowo te wielopotencjalne komórki progenitorowe są bardzo zbliżone do komórek macierzystych krwi (HSC) szpiku kostnego dorosłych zwierząt (CD34+c-kit+). Liczba wielopotencjalnych komórek AA4.1+ wśród wszystkich komórek regionu AGM jest niewielka - stanowią one nie więcej niż 1/12 jego części.

W ludzkim zarodku zidentyfikowano również region wewnątrzzarodkowy zawierający komórki HSC homologiczne do regionu AGM u zwierząt. Ponadto u ludzi ponad 80% komórek multipotencjalnych o wysokim potencjale proliferacyjnym znajduje się w ciele zarodka, chociaż takie komórki są również obecne w woreczku żółtkowym. Szczegółowa analiza ich lokalizacji wykazała, że setki takich komórek są zbierane w zwartych grupach, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie śródbłonka ściany brzusznej aorty grzbietowej. Fenotypowo są to komórki CD34CD45+Lin. Natomiast w woreczku żółtkowym, jak również w innych narządach krwiotwórczych zarodka (wątroba, szpik kostny), takie komórki są pojedyncze.

W konsekwencji w ludzkim zarodku region AGM zawiera skupiska komórek hematopoetycznych ściśle związane z śródbłonkiem brzusznym aorty grzbietowej. Kontakt ten jest również śledzony na poziomie immunochemicznym - zarówno komórki skupisk hematopoetycznych, jak i komórki śródbłonka wyrażają czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, ligand Flt-3, ich receptory FLK-1 i STK-1, a także czynnik transkrypcyjny komórek macierzystych białaczki. W regionie AGM pochodne mezenchymalne są reprezentowane przez gęsty pasmo zaokrąglonych komórek zlokalizowanych wzdłuż całej aorty grzbietowej i wyrażających tenascynę C - glikoproteinę substancji podstawowej aktywnie uczestniczącą w procesach interakcji międzykomórkowej i migracji.

Wielopotencjalne komórki macierzyste regionu AGM po przeszczepie szybko przywracają hematopoezę u dojrzałych napromieniowanych myszy i zapewniają skuteczną hematopoezę przez długi czas (do 8 miesięcy). Autorzy nie znaleźli komórek o takich właściwościach w woreczku żółtkowym. Wyniki tego badania potwierdzają dane z innej pracy, która wykazała, że w zarodkach na wczesnych etapach rozwoju (10,5 dnia) region AGM jest jedynym źródłem komórek odpowiadających definicji HSC, przywracających hematopoezę mieloidalną i limfoidalną u dojrzałych napromieniowanych biorców.

Linia stromalna AGM-S3 została wyizolowana z regionu AGM, którego komórki wspierają generację zaangażowanych komórek progenitorowych CFU-GM, BFU-E, CFU-E i jednostek tworzących kolonie typu mieszanego w hodowli. Zawartość tych ostatnich podczas hodowli na podwarstwie odżywczej komórek linii AGM-S3 wzrasta od 10 do 80 razy. Tak więc mikrośrodowisko regionu AGM zawiera komórki bazowe stromalne, które skutecznie wspierają hematopoezę, więc sam region AGM może równie dobrze działać jako embrionalny narząd hematopoetyczny - źródło ostatecznych HSC, czyli HSC, które tworzą tkankę hematopoetyczną dorosłego zwierzęcia.

Rozszerzone immunofenotypowanie składu komórkowego regionu AGM wykazało, że zawiera on nie tylko wielopotencjalne komórki hematopoetyczne, ale także komórki zaangażowane w różnicowanie mieloidalne i limfoidalne (limfocyty T i B). Jednak analiza molekularna pojedynczych komórek CD34+c-kit+ z regionu AGM przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy wykazała aktywację tylko genów beta-globiny i mieloperoksydazy, ale nie genów limfoidalnych kodujących syntezę CD34, Thy-1 i 15. Częściowa aktywacja genów specyficznych dla linii jest charakterystyczna dla wczesnych stadiów ontogenetycznych generacji komórek macierzystych krwi (HSC) i komórek progenitorowych. Biorąc pod uwagę, że liczba zaangażowanych komórek progenitorowych w regionie AGM 10-dniowego zarodka jest o 2-3 rzędy wielkości niższa niż w wątrobie, można argumentować, że 10. dnia embriogenezy hematopoeza w regionie AGM dopiero się rozpoczyna, podczas gdy w głównym narządzie krwiotwórczym płodu w tym okresie rozwijają się już linie hematopoetyczne.

Rzeczywiście, w przeciwieństwie do wcześniejszych (9-11 dniowych) komórek macierzystych hematopoezy woreczka żółtkowego i regionu AGM, które ponownie zasiedlają mikrośrodowisko hematopoetyczne noworodka, ale nie dorosłego organizmu, komórki progenitorowe hematopoezy 12-17-dniowej wątroby zarodkowej nie wymagają już wczesnego mikrośrodowiska postnatalnego i zasiedlają narządy hematopoetyczne dorosłego zwierzęcia nie gorzej niż noworodek. Po przeszczepie embrionalnych komórek macierzystych wątroby, hematopoeza u napromieniowanych dorosłych myszy biorców miała charakter poliklonalny. Ponadto, wykorzystując znakowane kolonie, wykazano, że funkcjonowanie wszczepionych klonów jest całkowicie podporządkowane sukcesji klonalnej ujawnionej w dorosłym szpiku kostnym. W rezultacie zarodkowe komórki macierzyste wątroby, znakowane w najbardziej łagodnych warunkach, bez wstępnej stymulacji egzogennymi cytokinami, posiadają już główne cechy dorosłych komórek macierzystych wątroby: nie wymagają wczesnego mikrośrodowiska postembrionalnego, po przeszczepie wchodzą w stan głębokiego uśpienia i są mobilizowane do formowania klonalnego sekwencyjnie, zgodnie z modelem sukcesji klonalnej.

Oczywiście, konieczne jest dokładniejsze omówienie zjawiska sukcesji klonalnej. Erytropoeza jest przeprowadzana przez komórki macierzyste układu krwiotwórczego, które mają wysoki potencjał proliferacyjny i zdolność do różnicowania się we wszystkie linie zaangażowanych komórek prekursorowych komórek krwi. Przy normalnej intensywności hematopoezy większość komórek macierzystych układu krwiotwórczego znajduje się w stanie uśpienia i jest mobilizowana do proliferacji i różnicowania, tworząc sekwencyjnie klony, które zastępują się nawzajem. Proces ten nazywa się sukcesją klonalną. Dowody eksperymentalne na sukcesję klonalną w układzie krwiotwórczym uzyskano w badaniach z komórkami macierzystymi układu krwiotwórczego (HSC) oznaczonymi retrowirusowym transferem genów. U dorosłych zwierząt hematopoezę utrzymuje wiele jednocześnie funkcjonujących klonów hematopoetycznych, pochodnych komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC). Na podstawie zjawiska sukcesji klonalnej opracowano podejście repopulacyjne do identyfikacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC). Zgodnie z tą zasadą rozróżnia się długotrwałe komórki macierzyste układu krwiotwórczego (LT-HSC), które są zdolne do przywracania układu krwiotwórczego przez całe życie, oraz krótkotrwałe komórki macierzyste układu krwiotwórczego, które pełnią tę funkcję przez ograniczony okres czasu.

Jeśli rozpatrujemy komórki macierzyste układu krwiotwórczego z punktu widzenia podejścia repopulacyjnego, to osobliwością komórek hematopoetycznych wątroby zarodkowej jest ich zdolność do tworzenia kolonii znacznie większych niż te w hodowli komórek macierzystych krwi pępowinowej lub szpiku kostnego, a dotyczy to wszystkich typów kolonii. Już sam ten fakt wskazuje na wyższy potencjał proliferacyjny komórek hematopoetycznych wątroby zarodkowej. Unikalną właściwością komórek progenitorowych układu krwiotwórczego wątroby zarodkowej jest krótszy cykl komórkowy w porównaniu z innymi źródłami, co ma ogromne znaczenie z punktu widzenia skuteczności repopulacji narządów krwiotwórczych podczas przeszczepu. Analiza składu komórkowego zawiesiny hematopoetycznej uzyskanej ze źródeł dojrzałego organizmu wskazuje, że na wszystkich etapach ontogenezy komórki jądrowe są reprezentowane głównie przez komórki ostatecznie zróżnicowane, których liczba i fenotyp zależą od wieku ontogenetycznego dawcy tkanki hematopoetycznej. W szczególności zawiesiny komórek jednojądrowych szpiku kostnego i krwi pępowinowej składają się w ponad 50% z dojrzałych komórek szeregu limfoidalnego, podczas gdy tkanka hematopoetyczna wątroby zarodka zawiera mniej niż 10% limfocytów. Ponadto komórki linii mieloidalnej w wątrobie zarodka i płodu są reprezentowane głównie przez szereg erytrocytów, podczas gdy we krwi pępowinowej i szpiku kostnym przeważają elementy granulocytarno-makrofagowe.

Ważne jest również, aby wątroba zarodka zawierała kompletny zestaw najwcześniejszych prekursorów hematopoetycznych. Wśród tych ostatnich należy wymienić komórki erytrocytowe, granulopoetyczne, megakariopoetyczne i wieloliniowe komórki tworzące kolonie. Ich bardziej prymitywne prekursory - LTC-IC - są zdolne do proliferacji i różnicowania in vitro przez 5 tygodni lub dłużej, a także zachowują aktywność funkcjonalną po wszczepieniu do organizmu biorcy podczas allogenicznego, a nawet ksenogenicznego przeszczepu u zwierząt z niedoborami odporności.

Celowość biologiczna przewagi komórek erytrocytowych w wątrobie zarodka (do 90% całkowitej liczby elementów hematopoetycznych) wynika z konieczności zaopatrzenia szybko zwiększającej się objętości krwi rozwijającego się płodu w masę erytrocytów. W wątrobie zarodka erytropoezę reprezentują jądrowe prekursory erytrocytów o różnym stopniu dojrzałości zawierające hemoglobinę płodową (a2u7), która ze względu na większe powinowactwo do tlenu zapewnia skuteczne wchłanianie tej ostatniej z krwi matki. Nasilenie erytropoezy w wątrobie zarodka wiąże się z lokalnym wzrostem syntezy erytropoetyny (EPO). Warto zauważyć, że sama obecność erytropoetyny jest wystarczająca do realizacji potencjału hematopoetycznego komórek hematopoetycznych w wątrobie zarodka, podczas gdy kombinacja cytokin i czynników wzrostu składających się z EPO, SCF, GM-CSF i IL-3 jest wymagana do zaangażowania szpiku kostnego i krwi pępowinowej HSC w erytropoezę. Jednocześnie wczesne komórki progenitorowe hematopoezy izolowane z wątroby zarodka, które nie mają receptorów dla EPO, nie reagują na egzogenną erytropoetynę. Do indukcji erytropoezy w zawiesinie komórek jednojądrowych wątroby zarodka, konieczna jest obecność bardziej zaawansowanych komórek wrażliwych na erytropoetynę o fenotypie CD34+CD38+, które ekspresują receptor EPO.

W literaturze nadal nie ma konsensusu co do rozwoju hematopoezy w okresie embrionalnym. Funkcjonalne znaczenie istnienia poza- i wewnątrzzarodkowych źródeł komórek progenitorowych hematopoezy nie zostało ustalone. Nie ma jednak wątpliwości, że w ludzkiej embriogenezie wątroba jest centralnym narządem hematopoezy, a w 6-12 tygodniu ciąży służy jako główne źródło komórek macierzystych hematopoezy, które zasiedlają śledzionę, grasicę i szpik kostny. GDR zapewniają wykonywanie odpowiednich funkcji w pre- i postnatalnych okresach rozwoju.

Należy jeszcze raz zauważyć, że wątroba zarodkowa, w porównaniu z innymi źródłami, charakteryzuje się najwyższą zawartością komórek HSC. Około 30% komórek CD344 wątroby zarodkowej ma fenotyp CD38. Jednocześnie liczba komórek progenitorowych limfoidalnych (CD45+) we wczesnych stadiach hematopoezy w wątrobie nie przekracza 4%. Ustalono, że w miarę rozwoju płodu, od 7 do 17 tygodnia ciąży, liczba limfocytów B stopniowo wzrasta z miesięcznym „skokiem” 1,1%, podczas gdy poziom komórek HSC trwale spada.

Aktywność funkcjonalna komórek macierzystych układu krwiotwórczego zależy również od okresu rozwoju embrionalnego ich źródła. Badanie aktywności tworzenia kolonii komórek wątroby ludzkich zarodków w 6-8 i 9-12 tygodniu ciąży podczas hodowli w półpłynnym podłożu w obecności SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 i EPO wykazało, że całkowita liczba kolonii jest 1,5 razy większa przy wysiewaniu komórek HSC wątroby zarodka na wczesnych etapach rozwoju. Jednocześnie liczba komórek progenitorowych mielopoezy, takich jak CFU-GEMM w wątrobie w 6-8 tygodniu embriogenezy, jest ponad trzykrotnie większa niż ich liczba w 9-12 tygodniu ciąży. Ogólnie rzecz biorąc, aktywność tworzenia kolonii komórek wątroby hematopoetycznej zarodków w pierwszym trymestrze ciąży była istotnie wyższa niż komórek wątroby płodu w drugim trymestrze ciąży.

Powyższe dane wskazują, że wątroba zarodkowa na początku embriogenezy wyróżnia się nie tylko zwiększoną zawartością wczesnych komórek progenitorowych hematopoezy, ale jej komórki hematopoetyczne charakteryzują się szerszym spektrum różnicowania w różne linie komórkowe. Te cechy aktywności funkcjonalnej komórek macierzystych hematopoezy wątroby zarodkowej mogą mieć pewne znaczenie kliniczne, ponieważ ich jakościowe cechy pozwalają oczekiwać wyraźnego efektu terapeutycznego przy przeszczepieniu nawet niewielkiej liczby komórek uzyskanych na wczesnych etapach ciąży.

Niemniej jednak problem ilości komórek macierzystych układu krwiotwórczego niezbędnych do skutecznego przeszczepu pozostaje otwarty i aktualny. Podejmowane są próby jego rozwiązania, wykorzystując wysoki potencjał samoreprodukcji komórek hematopoetycznych wątroby zarodkowej in vitro, gdy są stymulowane cytokinami i czynnikami wzrostu. Przy stałej perfuzji wczesnych komórek macierzystych wątroby zarodkowej w bioreaktorze, po 2-3 dniach możliwe jest uzyskanie ilości komórek macierzystych układu krwiotwórczego na wyjściu, która jest 15 razy większa niż ich początkowy poziom. Dla porównania należy zauważyć, że potrzeba co najmniej dwóch tygodni, aby osiągnąć 20-krotny wzrost produkcji ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej w tych samych warunkach.

Tak więc wątroba zarodkowa różni się od innych źródeł komórek macierzystych układu krwiotwórczego wyższą zawartością zarówno zaangażowanych, jak i wczesnych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego. W hodowli z czynnikami wzrostu komórki wątroby zarodkowej o fenotypie CD34+CD45Ra1 CD71l0W tworzą 30 razy więcej kolonii niż podobne komórki krwi pępowinowej i 90 razy więcej niż komórki macierzyste szpiku kostnego. Najbardziej wyraźne różnice w określonych źródłach dotyczą zawartości wczesnych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego, które tworzą mieszane kolonie - ilość CFU-GEMM w wątrobie zarodkowej przekracza tę we krwi pępowinowej i szpiku kostnym odpowiednio 60 i 250 razy.

Ważne jest również to, że do 18. tygodnia rozwoju embrionalnego (okres rozpoczęcia hematopoezy w szpiku kostnym) w realizacji funkcji hematopoetycznej bierze udział ponad 60% komórek wątroby. Ponieważ płód ludzki nie posiada grasicy, a co za tym idzie, tymocytów do 13. tygodnia rozwoju, przeszczepienie komórek hematopoetycznych z wątroby zarodka w 6-12. tygodniu ciąży znacznie zmniejsza ryzyko wystąpienia reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi” i nie wymaga wyboru histokompatybilnego dawcy, ponieważ stosunkowo łatwo jest osiągnąć chimeryzm hematopoetyczny.