Ograniczenia, zagrożenia i powikłania przeszczepu komórek

Regeneracyjna medycyna plastyczna opiera się na klinicznym wykorzystaniu toti- i pluripotentnych właściwości komórek macierzystych zarodkowych i progenitorowych. Dzięki temu możliwe jest tworzenie in vitro i in vivo określonych linii komórkowych, które regenerują uszkodzone tkanki i narządy osoby chorej.

Rzeczywista możliwość wykorzystania komórek macierzystych zarodkowych i komórek macierzystych tkanek ostatecznych (tzw. „dorosłych” komórek macierzystych) człowieka w celach terapeutycznych nie budzi już wątpliwości. Jednak eksperci z National and Medical Academies of the USA (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press) i National Institute of Health of the USA (Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA) zalecają dokładniejsze badanie właściwości komórek macierzystych w eksperymentach na odpowiednich modelach biologicznych i obiektywną ocenę wszystkich konsekwencji przeszczepu, a dopiero potem wykorzystanie komórek macierzystych w klinice.

Udowodniono, że komórki macierzyste są częścią pochodnych tkankowych wszystkich trzech warstw zarodkowych. Komórki macierzyste znajdują się w siatkówce, rogówce, naskórku skóry, szpiku kostnym i krwi obwodowej, w naczyniach krwionośnych, miazdze zębowej, nerkach, nabłonku przewodu pokarmowego, trzustce i wątrobie. Za pomocą nowoczesnych metod udowodniono, że nerwowe komórki macierzyste są zlokalizowane w mózgu i rdzeniu kręgowym osoby dorosłej. Te sensacyjne dane przyciągnęły szczególną uwagę naukowców i mediów, ponieważ neurony w mózgu służyły jako klasyczny przykład statycznej populacji komórek, która nie jest przywracana. Zarówno we wczesnym, jak i późnym okresie ontogenezy neurony, astrocyty i oligodendrocyty powstają w mózgu zwierząt i ludzi dzięki nerwowym komórkom macierzystym (Komórki macierzyste: postęp naukowy i przyszłe kierunki badań. Nat. Inst, of Health USA).

Jednakże w normalnych warunkach plastyczność komórek macierzystych tkanek ostatecznych nie ujawnia się. Aby zrealizować potencjał plastyczny komórek macierzystych tkanek ostatecznych, muszą one zostać wyizolowane, a następnie hodowane w pożywkach z cytokinami (LIF, EGF, FGF). Ponadto pochodne komórek macierzystych z powodzeniem wszczepiają się tylko wtedy, gdy zostaną przeszczepione do organizmu zwierzęcia z osłabionym układem odpornościowym (γ-napromieniowanie, cytostatyki, busulfan itp.). Do tej pory nie uzyskano przekonujących dowodów na wdrożenie plastyczności komórek macierzystych u zwierząt, które nie były narażone na promieniowanie lub inne efekty powodujące głęboką immunosupresję.

W takich warunkach niebezpieczny potencjał ESC ujawnia się przede wszystkim podczas ich transplantacji do obszarów ektopowych - podczas podskórnego wstrzyknięcia ESC myszom z niedoborem odporności w miejscu wstrzyknięcia tworzą się potworniaki. Ponadto w trakcie rozwoju zarodka ludzkiego częstość występowania nieprawidłowości chromosomalnych jest wyższa niż w embriogenezie u zwierząt. W stadium blastocysty tylko 20-25% zarodków ludzkich składa się z komórek o prawidłowym kariotypie, a zdecydowana większość wczesnych zarodków ludzkich uzyskanych po zapłodnieniu in vitro wykazuje chaotyczny mozaikowość chromosomową i bardzo często napotyka aberracje liczbowe i strukturalne.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Korzystne efekty komórek macierzystych

Wstępne wyniki badań klinicznych potwierdzają korzystny wpływ komórek macierzystych na pacjenta, ale nadal nie ma informacji o długoterminowych efektach przeszczepu komórek. Literatura początkowo była zdominowana przez doniesienia o pozytywnych wynikach przeszczepu fragmentów mózgu zarodka w chorobie Parkinsona, ale później zaczęły pojawiać się dane zaprzeczające skutecznemu efektowi terapeutycznemu tkanki nerwowej zarodka lub płodu przeszczepionej do mózgu pacjentów.

W połowie XX wieku po raz pierwszy odkryto przywrócenie hematopoezy u śmiertelnie napromieniowanych zwierząt po dożylnej transfuzji komórek szpiku kostnego, a w 1969 roku amerykański badacz D. Thomas wykonał pierwszy przeszczep szpiku kostnego u ludzi. Brak wiedzy na temat mechanizmów niezgodności immunologicznej komórek szpiku kostnego dawcy i biorcy w tamtym czasie doprowadził do wysokiej śmiertelności z powodu częstego niepowodzenia przeszczepu i rozwoju reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi. Odkrycie głównego kompleksu zgodności tkankowej, w którego skład wchodzą ludzkie antygeny leukocytarne (HbA), oraz udoskonalenie metod ich typowania pozwoliło na znaczne zwiększenie przeżywalności po przeszczepie szpiku kostnego, co doprowadziło do powszechnego stosowania tej metody leczenia w onkohematologii. Dekadę później wykonano pierwsze przeszczepy komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) uzyskanych z krwi obwodowej metodą leukaferezy. W 1988 roku krew pępowinowa została po raz pierwszy użyta jako źródło komórek HSC we Francji w leczeniu dziecka z niedokrwistością Fanconiego, a od końca 2000 roku w prasie pojawiają się doniesienia o zdolności komórek HSC do różnicowania się w komórki różnych typów tkanek, co potencjalnie rozszerza zakres ich zastosowania klinicznego. Okazało się jednak, że materiał przeszczepu, wraz z komórkami HSC, zawiera znaczną liczbę zanieczyszczeń komórek niehematopoetycznych o różnym charakterze i właściwościach. W związku z tym opracowywane są metody oczyszczania przeszczepu i kryteria oceny jego czystości komórkowej. W szczególności stosuje się pozytywną immunoselekcję komórek CD34+, co pozwala na izolację komórek HSC przy użyciu przeciwciał monoklonalnych.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Powikłania terapii komórkami macierzystymi

Powikłania po przeszczepie szpiku kostnego są najczęściej hematologiczne i wiążą się z długim okresem jatrogennej pancytopenii. Najczęściej rozwijają się powikłania infekcyjne, anemia i krwotoki. W związku z tym niezwykle ważne jest wybranie optymalnego sposobu pobierania, przetwarzania i przechowywania szpiku kostnego w celu maksymalnego zachowania komórek macierzystych, co zapewni szybką i stabilną odbudowę hematopoezy. Podczas charakteryzowania przeszczepu obecnie powszechnie ocenia się następujące parametry: liczbę komórek jednojądrowych i/lub jądrzastych, jednostki tworzące kolonie i zawartość komórek CD34-dodatnich. Niestety, wskaźniki te zapewniają jedynie pośrednią ocenę rzeczywistej zdolności hematopoetycznej populacji komórek macierzystych przeszczepu. Obecnie nie ma absolutnie dokładnych parametrów określających wystarczalność przeszczepu do długoterminowej odbudowy hematopoezy u pacjentów, nawet w przypadku autologicznego przeszczepu szpiku kostnego. Opracowanie ogólnych kryteriów jest niezwykle trudne ze względu na brak ścisłych standardów przetwarzania, kriokonserwacji i badania przeszczepu. Ponadto konieczne jest uwzględnienie całej gamy czynników wpływających na parametry pomyślnego przywrócenia hematopoezy u każdego pacjenta. W przypadku autologicznego przeszczepu szpiku kostnego najważniejsze z nich to liczba poprzednich kursów chemioterapii, charakterystyka schematu kondycjonowania, okres choroby, w którym pobrano szpik kostny, a także schematy stosowania czynników stymulujących kolonie w okresie po przeszczepie. Ponadto nie należy zapominać, że chemioterapia poprzedzająca pobranie przeszczepu może mieć negatywny wpływ na komórki macierzyste szpiku kostnego.

Częstość występowania poważnych powikłań toksycznych znacznie wzrasta podczas allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego. W tym względzie interesujące są dane statystyczne dotyczące allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego w talasemii. Sprawozdania Europejskiej Grupy Transplantacji Szpiku Bone Marrow zarejestrowały około 800 przeszczepów szpiku kostnego u pacjentów z talasemią major. Allogeniczny przeszczep w talasemii wykonuje się w zdecydowanej większości przypadków od rodzeństwa identycznego pod względem HLA, co wiąże się z poważnymi powikłaniami i wysoką śmiertelnością podczas przeszczepu materiału komórek macierzystych od częściowo zgodnych spokrewnionych lub zgodnych niespokrewnionych dawców. Aby zminimalizować ryzyko śmiertelnych powikłań zakaźnych, pacjentów umieszcza się w izolowanych aseptycznych pudełkach z laminarnym przepływem powietrza i otrzymuje dietę nisko- lub bezbakteryjną. W celu dekontaminacji bakteryjnej jelit przepisuje się nieresorbowalne formy antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych doustnie. W celach profilaktycznych amfoterycynę B podaje się dożylnie. Zapobieganie zakażeniom układowym jest wzmacniane amikacyną i ceftazydymem, które są przepisywane dzień przed przeszczepem, kontynuując leczenie do momentu wypisania pacjenta ze szpitala. Wszystkie produkty krwiopochodne są napromieniowywane dawką 30 Gy przed transfuzją. Żywienie pozajelitowe podczas przeszczepu jest warunkiem koniecznym i rozpoczyna się natychmiast po ograniczeniu przyjmowania pokarmów w sposób naturalny.

Z wysoką toksycznością leków immunosupresyjnych wiąże się szereg powikłań, które często powodują nudności, wymioty i zapalenie błon śluzowych, uszkodzenie nerek i śródmiąższowe zapalenie płuc. Jednym z najpoważniejszych powikłań chemioterapii jest choroba żylno-okluzyjna wątroby, prowadząca do zgonu we wczesnym okresie po przeszczepie. Czynnikami ryzyka zakrzepicy żył układu wrotnego wątroby są wiek pacjentów, obecność zapalenia wątroby i zwłóknienia wątroby, a także terapia immunosupresyjna po przeszczepie szpiku kostnego. Choroba żylno-okluzyjna jest szczególnie niebezpieczna w talasemii, której towarzyszy hemosyderoza wątroby, zapalenie wątroby i zwłóknienie - częste towarzysze terapii transfuzyjnej. Zakrzepica żył układu wrotnego wątroby rozwija się 1-2 tygodnie po przeszczepie i charakteryzuje się szybkim wzrostem zawartości bilirubiny i aktywności aminotransferaz we krwi, postępem hepatomegalii, wodobrzusza, encefalopatii i bólem w górnej części brzucha. Histologicznie materiał z autopsji ujawnia uszkodzenia śródbłonka, krwotoki podśródbłonkowe, uszkodzenia hepatocytów centriolobularnych, zakrzepowe zwężenie żyłek i żył centralnych wątroby. Opisano przypadki śmiertelnego zatrzymania akcji serca związanego z toksycznym działaniem cytostatyków u pacjentów z talasemią.

W okresie przedtransplantacyjnym cyklofosfamid i busulfan często powodują toksyczne krwotoczne zapalenie pęcherza moczowego ze zmianami patologicznymi w komórkach nabłonka dróg moczowych. Stosowanie cyklosporyny A w przeszczepie szpiku kostnego często wiąże się z nefro- i neurotoksycznością, zespołem nadciśnienia, zatrzymaniem płynów w organizmie i cytolizą hepatocytów. Dysfunkcja seksualna i rozrodcza częściej występuje u kobiet. U małych dzieci rozwój dojrzewania płciowego zwykle nie jest zaburzony po przeszczepie, ale u starszych dzieci patologia rozwoju sfery seksualnej może być bardzo poważna - aż do bezpłodności. Powikłania bezpośrednio związane z samym przeszczepem obejmują odrzucenie allogenicznych komórek szpiku kostnego, niezgodność grup ABO, ostre i przewlekłe postacie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi.

U pacjentów z przeszczepem szpiku kostnego niezgodnym z ABO, izoaglutyniny gospodarza przeciwko dawcy ABO są wytwarzane przez 330-605 dni po przeszczepie, co może prowadzić do przedłużonej hemolizy i drastycznie zwiększyć potrzebę transfuzji krwi. Powikłaniu temu zapobiega się, przetaczając wyłącznie krwinki czerwone typu 0. Po przeszczepie niektórzy pacjenci doświadczają neutropenii autoimmunologicznej, trombocytopenii lub pancytopenii, które wymagają splenektomii w celu ich skorygowania.

U 35-40% biorców ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi rozwija się w ciągu 100 dni po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego identycznym pod względem HLA. Stopień zajęcia skóry, wątroby i jelit waha się od wysypki, biegunki i umiarkowanej hiperbilirubinemii do złuszczania skóry, niedrożności jelit i ostrej niewydolności wątroby. U pacjentów z talasemią częstość występowania ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi stopnia I po przeszczepie szpiku kostnego wynosi 75%, a stopnia II i wyższego wynosi 11-53%. Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jako układowy zespół wielonarządowy zwykle rozwija się w ciągu 100-500 dni po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego u 30-50% pacjentów. Dotknięte są skóra, jama ustna, wątroba, oczy, przełyk i górne drogi oddechowe. Rozróżnia się ograniczoną postać przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, gdy dotknięta jest skóra i/lub wątroba, oraz postać rozsianą, gdy uogólnione zmiany skórne są połączone z przewlekłym agresywnym zapaleniem wątroby, zmianami oczu, gruczołów ślinowych lub dowolnego innego narządu. Śmierć jest często spowodowana powikłaniami zakaźnymi wynikającymi z ciężkiego niedoboru odporności. W talasemii łagodna postać przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi występuje u 12%, umiarkowana postać u 3%, a ciężka postać u 0,9% biorców allogenicznego szpiku kostnego zgodnego pod względem HLA. Ciężkim powikłaniem przeszczepu szpiku kostnego jest odrzucenie przeszczepu, które rozwija się 50–130 dni po operacji. Częstotliwość odrzucenia zależy od schematu kondycjonowania. W szczególności u chorych na talasemię, którzy w okresie przygotowawczym otrzymywali wyłącznie metotreksat, odrzucenie przeszczepu szpiku kostnego obserwowano w 26% przypadków, przy skojarzeniu metotreksatu z cyklosporyną A – w 9% przypadków, a przy podawaniu wyłącznie cyklosporyny A – w 8% przypadków (Gaziev i in., 1995).

Powikłania infekcyjne po przeszczepie szpiku kostnego są wywoływane przez wirusy, bakterie i grzyby. Ich rozwój wiąże się z głęboką neutropenią indukowaną lekami chemioterapeutycznymi w okresie kondycjonowania, uszkodzeniem barier śluzowych przez cytostatyki oraz reakcją przeszczep przeciwko gospodarzowi. W zależności od czasu rozwoju rozróżnia się trzy fazy powikłań infekcyjnych. W pierwszej fazie (rozwijającej się w pierwszym miesiącu po przeszczepie) dominują uszkodzenia barier śluzowych i neutropenia, którym często towarzyszą zakażenia wirusowe (opryszczka, wirus Epsteina-Barr, cytomegalowirus, półpasiec), a także zakażenia wywołane przez bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne, grzyby Candida, aspergilli. We wczesnym okresie potransplantacyjnym (drugi i trzeci miesiąc po przeszczepie) najcięższą infekcją jest cytomegalowirus, który często prowadzi do śmierci pacjentów w drugiej fazie powikłań infekcyjnych. W talasemii zakażenie cytomegalowirusem po przeszczepie szpiku kostnego rozwija się u 1,7-4,4% biorców. Trzecia faza jest obserwowana w późnym okresie po przeszczepie (trzy miesiące po operacji) i charakteryzuje się ciężkim złożonym niedoborem odporności. W tym okresie powszechne są zakażenia wywołane przez Varicella zoster, paciorkowce, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae i wirusy hepatotropowe. W talasemii śmiertelność pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego jest związana z posocznicą bakteryjną i grzybiczą, idiopatycznym śródmiąższowym zapaleniem płuc i zapaleniem płuc wywołanym przez cytomegalowirusa, ostrym zespołem niewydolności oddechowej, ostrą niewydolnością serca, tamponadą serca, krwotokiem mózgowym, żylno-okluzyjną chorobą wątroby i ostrą chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi.

Obecnie osiągnięto pewne sukcesy w opracowaniu metod izolowania czystych populacji komórek macierzystych hematopoezy ze szpiku kostnego. Udoskonalono technikę pozyskiwania krwi płodowej z pępowiny, a także opracowano metody izolowania komórek hematopoezy z krwi pępowinowej. W prasie naukowej pojawiają się doniesienia, że komórki macierzyste hematopoezy są zdolne do namnażania się, gdy są hodowane w pożywkach z cytokinami. Przy użyciu specjalnie zaprojektowanych bioreaktorów do ekspansji komórek macierzystych hematopoezy, biomasa komórek macierzystych hematopoezy wyizolowanych ze szpiku kostnego, krwi obwodowej lub pępowinowej znacznie wzrasta. Możliwość ekspansji komórek macierzystych hematopoezy jest ważnym krokiem w kierunku rozwoju klinicznego przeszczepu komórek.

Jednak przed rozmnażaniem in vitro komórek macierzystych układu krwiotwórczego konieczne jest wyizolowanie jednorodnej populacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Zazwyczaj osiąga się to za pomocą markerów, które umożliwiają selektywne znakowanie komórek macierzystych układu krwiotwórczego przeciwciałami monoklonalnymi kowalencyjnie związanymi z fluorescencyjnym lub magnetycznym znacznikiem i ich izolację za pomocą odpowiedniego sortera komórek. Jednocześnie kwestia cech fenotypowych komórek macierzystych układu krwiotwórczego nie została ostatecznie rozwiązana. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) uważają komórki z antygenami CD34, AC133 i Thyl na swojej powierzchni i bez CD38, HLA-DR lub innych markerów różnicowania (komórki z fenotypem CD34+Liir) za kandydatów na komórki macierzyste układu krwiotwórczego. Markery linii (Lin) obejmują glikoforynę A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Komórki z fenotypem CD34+CD45RalüW CD71low, a także fenotypem CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low są uważane za obiecujące pod kątem przeszczepu.

Kwestia liczby komórek macierzystych układu krwiotwórczego wystarczających do skutecznego przeszczepu pozostaje problematyczna. Obecnie źródłami komórek macierzystych układu krwiotwórczego są szpik kostny, krew obwodowa i pępowinowa oraz wątroba zarodkowa. Ekspansję komórek macierzystych układu krwiotwórczego osiąga się poprzez ich hodowlę w obecności komórek śródbłonka i czynników wzrostu układu krwiotwórczego. W różnych protokołach do indukowania proliferacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) stosuje się mieloproteiny, SCF, erytropoetynę, insulinopodobne czynniki wzrostu, kortykosteroidy i estrogeny. Przy stosowaniu kombinacji cytokin in vitro możliwe jest osiągnięcie znacznego wzrostu puli komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) ze szczytem ich produkcji pod koniec drugiego tygodnia hodowli.

Tradycyjnie przeszczep komórek macierzystych krwi pępowinowej jest stosowany głównie w przypadku hemoblastoz. Jednak minimalna dawka komórek hematopoetycznych wymagana do udanego przeszczepu komórek krwi pępowinowej wynosi 3,7 x 10 ⁷ komórek jądrzastych na 1 kg masy ciała biorcy. Użycie mniejszej liczby komórek macierzystych krwi pępowinowej znacznie zwiększa ryzyko niepowodzenia przeszczepu i nawrotu choroby. Dlatego przeszczep komórek macierzystych krwi pępowinowej jest stosowany głównie w leczeniu hemoblastoz u dzieci.

Niestety, nadal nie ma standardów dotyczących pozyskiwania ani znormalizowanych protokołów dotyczących klinicznego wykorzystania komórek hematopoetycznych z krwi pępowinowej. W związku z tym same komórki macierzyste z krwi pępowinowej nie są prawnie uznanym źródłem komórek hematopoetycznych do przeszczepu. Ponadto nie ma norm etycznych ani prawnych regulujących działalność i organizację banków krwi pępowinowej, które istnieją za granicą. Tymczasem, aby przeszczep był bezpieczny, wszystkie próbki krwi pępowinowej muszą być starannie monitorowane. Przed pobraniem krwi od kobiety w ciąży należy uzyskać jej zgodę. Każda kobieta w ciąży musi zostać zbadana pod kątem nosicielstwa HBsAg, obecności przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C, HIV i kiły. Każda próbka krwi pępowinowej musi zostać standardowo zbadana pod kątem liczby komórek jądrzastych, CD34+ i zdolności do tworzenia kolonii. Ponadto przeprowadza się typizację HbA, określenie grupy krwi przez ABO i jej przynależności przez czynnik Rh. Niezbędne procedury testowe to bakteriologiczna hodowla w celu sprawdzenia sterylności, testy serologiczne na zakażenia HIV-1 i HIV-2, HBsAg, wirusowe zapalenie wątroby typu C, zakażenie cytomegalowirusem, HTLY-1 i HTLY-II, kiłę i toksoplazmozę. Ponadto przeprowadza się reakcję łańcuchową polimerazy w celu wykrycia zakażeń cytomegalowirusem i HIV. Wydaje się wskazane uzupełnienie protokołów testowych o analizę komórek macierzystych krwi pępowinowej w celu wykrycia takich chorób genetycznych, jak a-talasemia, niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, niedobór deaminazy adenozyny, agammaglobulinemia Brutona, choroby Hurlera i Pontera.

Kolejnym etapem przygotowania do przeszczepu jest kwestia konserwacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Najbardziej niebezpiecznymi procedurami dla żywotności komórek podczas ich przygotowywania są zamrażanie i rozmrażanie. Podczas zamrażania komórek krwiotwórczych znaczna ich część może zostać zniszczona z powodu tworzenia kryształów. W celu zmniejszenia procentu obumierania komórek stosuje się specjalne substancje - krioprotektory. Najczęściej jako krioprotektor stosuje się DMSO w stężeniu końcowym 10%. Jednak DMSO w takim stężeniu charakteryzuje się bezpośrednim działaniem cytotoksycznym, które objawia się nawet w warunkach minimalnego narażenia. Zmniejszenie działania cytotoksycznego uzyskuje się poprzez ścisłe utrzymanie zerowej temperatury trybu narażenia, a także przestrzeganie przepisów dotyczących przetwarzania materiału w trakcie i po rozmrożeniu (szybkość wszelkich manipulacji, stosowanie wielokrotnych procedur płukania). Nie należy stosować stężeń DMSO mniejszych niż 5%, ponieważ powoduje to masową śmierć komórek krwiotwórczych w okresie zamrażania.

Obecność zanieczyszczeń erytrocytowych w zawiesinie komórek macierzystych układu krwiotwórczego stwarza ryzyko wystąpienia reakcji niezgodności antygenów erytrocytów. Jednocześnie, gdy erytrocyty są usuwane, utrata komórek hematopoetycznych znacznie wzrasta. W związku z tym zaproponowano metodę niefrakcjonowanej izolacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego. W tym przypadku stosuje się 10% roztwór DMSO i stałe chłodzenie (GS/min) do -80°C w celu ochrony komórek jądrzastych przed szkodliwym działaniem niskich temperatur, po czym zawiesinę komórek zamraża się w ciekłym azocie. Uważa się, że ta metoda kriokonserwacji powoduje częściową lizę erytrocytów, więc próbki krwi nie wymagają frakcjonowania. Przed przeszczepem zawiesinę komórek rozmraża się, wypłukuje z wolnej hemoglobiny i DMSO w roztworze albuminy ludzkiej lub w surowicy krwi. Zachowanie prekursorów hematopoetycznych przy zastosowaniu tej metody jest rzeczywiście lepsze niż po frakcjonowaniu krwi pępowinowej, jednak ryzyko powikłań poprzetoczeniowych z powodu przetoczenia erytrocytów niezgodnych z układem AB0 pozostaje.

Utworzenie systemu bankowego do przechowywania próbek HSC z testami HLA i typowaniem mogłoby rozwiązać powyższe problemy. Wymaga to jednak opracowania norm etycznych i prawnych, które obecnie są jedynie przedmiotem dyskusji. Przed utworzeniem sieci bankowej konieczne jest przyjęcie szeregu przepisów i dokumentów dotyczących standaryzacji procedur pobierania, frakcjonowania, testowania i typowania, a także kriokonserwacji HSC. Obowiązkowym warunkiem skutecznego działania banków HSC jest zorganizowanie bazy komputerowej do interakcji z rejestrami World Marrow Donor Association (WMDA) i National Marrow Donor Program of the United States (NMDP).

Ponadto konieczna jest optymalizacja i standaryzacja metod ekspansji HSC in vitro, przede wszystkim komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej. Ekspansja HSC krwi pępowinowej jest konieczna, aby zwiększyć liczbę potencjalnych biorców zgodnych z układem HLA. Ze względu na małe objętości krwi pępowinowej, liczba zawartych w niej HSC zwykle nie jest w stanie zapewnić repopulacji szpiku kostnego u pacjentów dorosłych. Jednocześnie, aby wykonać przeszczepy niespokrewnione, konieczny jest dostęp do wystarczającej liczby typowanych próbek HSC (od 10 000 do 1 500 000 na biorcę).

Transplantacja komórek macierzystych układu krwiotwórczego nie eliminuje powikłań towarzyszących przeszczepowi szpiku kostnego. Analiza pokazuje, że w przypadku przeszczepu komórek macierzystych krwi pępowinowej ciężkie postacie ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi rozwijają się u 23% biorców, a postacie przewlekłe u 25% biorców. U pacjentów onkohematologicznych nawroty ostrej białaczki w ciągu pierwszego roku po przeszczepie komórek macierzystych krwi pępowinowej obserwuje się w 26% przypadków.

W ostatnich latach intensywnie rozwijają się metody przeszczepiania obwodowych komórek macierzystych krwiotwórczych. Zawartość HSC we krwi obwodowej jest tak mała (1 HSC na 100 000 krwinek), że ich izolacja bez specjalnego przygotowania nie ma sensu. Dlatego dawcy najpierw podaje się kurs stymulacji lekowej uwalniania komórek hematopoetycznych szpiku kostnego do krwi. W tym celu stosuje się tak dalekie od nieszkodliwości leki jak cyklofosfamid i czynnik stymulujący kolonie granulocytów. Ale nawet po procedurze mobilizacji HSC do krwi obwodowej zawartość w niej komórek CD34+ nie przekracza 1,6%.

Do mobilizacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego w klinice najczęściej stosuje się metodę S-SEC, która charakteryzuje się stosunkowo dobrą tolerancją, z wyjątkiem niemal naturalnego występowania bólu kości. Należy zauważyć, że zastosowanie nowoczesnych separatorów krwi pozwala na skuteczną izolację komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Jednak w normalnych warunkach hematopoezy należy wykonać co najmniej 6 zabiegów, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek macierzystych układu krwiotwórczego, porównywalną pod względem zdolności repopulacyjnej do zawiesiny szpiku kostnego. Każdy taki zabieg wymaga przetworzenia na separatorze 10-12 litrów krwi, co może powodować trombocytopenię i leukopenię. Zabieg separacji polega na wprowadzeniu do dawcy antykoagulantu (cytrynian sodu), co nie wyklucza jednak kontaktowej aktywacji płytek krwi podczas pozaustrojowego wirowania. Czynniki te stwarzają warunki do rozwoju powikłań infekcyjnych i krwotocznych. Kolejną wadą tej metody jest znaczna zmienność reakcji mobilizacyjnej, co wymaga monitorowania zawartości komórek macierzystych krwi (HSC) we krwi obwodowej dawców, co jest konieczne w celu określenia ich maksymalnego poziomu.

Autogenna transplantacja komórek macierzystych układu krwiotwórczego, w przeciwieństwie do transplantacji allogenicznej, całkowicie eliminuje rozwój reakcji odrzucenia. Jednak istotną wadą autotransplantacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego, która ogranicza zakres wskazań do jej wykonania, jest duże prawdopodobieństwo reinfuzji komórek klonów białaczkowych wraz z przeszczepem. Ponadto brak efektu „przeszczep kontra guz” o podłożu immunologicznym znacząco zwiększa częstość nawrotów złośliwej choroby krwi. Dlatego jedyną radykalną metodą eliminacji nowotworowej hematopoezy klonalnej i przywrócenia prawidłowej hematopoezy poliklonalnej w zespołach mielodysplastycznych pozostaje intensywna polichemioterapia z przeszczepieniem hematopoezy allogenicznej.

Ale nawet w tym przypadku leczenie większości hemoblastoz ma na celu jedynie wydłużenie czasu przeżycia pacjentów i poprawę ich jakości życia. Według kilku dużych badań, długoterminowe przeżycie bez nawrotu po allotransplantacji komórek macierzystych krwiotwórczych osiąga się u 40% pacjentów onkohematologicznych. Przy stosowaniu komórek macierzystych zgodnego pod względem HLA rodzeństwa, najlepsze wyniki obserwuje się u młodych pacjentów z krótką historią choroby, liczbą komórek blastycznych do 10% i korzystną cytogenetyką. Niestety, śmiertelność związana z procedurą allotransplantacji komórek macierzystych krwiotwórczych u pacjentów z chorobami mielodysplastycznymi pozostaje wysoka (w większości raportów - około 40%). Wyniki 10-letniej pracy Narodowego Programu Dawców Szpiku Kostnego w USA (510 pacjentów, mediana wieku - 38 lat) wskazują, że dwuletnie przeżycie bez nawrotu wynosi 29% przy stosunkowo niskim prawdopodobieństwie nawrotu (14%). Jednakże śmiertelność związana z procedurą allotransplantacji komórek macierzystych krwi od dawcy niespokrewnionego jest niezwykle wysoka i sięga 54% w okresie dwóch lat. Podobne wyniki uzyskano w badaniu europejskim (118 pacjentów, mediana wieku - 24 lata, dwuletnie przeżycie bez nawrotu - 28%, nawrót - 35%, śmiertelność - 58%).

Podczas intensywnych kursów chemioterapii z późniejszym przywróceniem hematopoezy za pomocą allogenicznych komórek hematopoetycznych często występują powikłania immunohematologiczne i transfuzyjne. Wynikają one w dużej mierze z faktu, że ludzkie grupy krwi są dziedziczone niezależnie od cząsteczek MHC. Dlatego nawet jeśli dawca i biorca są zgodni pod względem głównych antygenów HLA, ich erytrocyty mogą mieć różne fenotypy. Rozróżnia się niezgodność „główną”, gdy biorca ma już istniejące przeciwciała przeciwko antygenom erytrocytów dawcy, i niezgodność „drobną”, gdy dawca ma przeciwciała przeciwko antygenom erytrocytów biorcy. Możliwe są przypadki kombinacji niezgodności „głównej” i „drobnej”.

Wyniki analizy porównawczej skuteczności klinicznej allotransplantacji szpiku kostnego i komórek macierzystych układu krwiotwórczego krwi pępowinowej w hemoblastozach wskazują, że u dzieci po allotransplantacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego krwi pępowinowej ryzyko wystąpienia reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi jest istotnie zmniejszone, ale obserwuje się dłuższy okres odzyskiwania liczby neutrofili i płytek krwi, a także wyższą częstość występowania śmiertelności w ciągu 100 dni po przeszczepie.

Badanie przyczyn wczesnej śmiertelności pozwoliło na wyjaśnienie przeciwwskazań do allogenicznego przeszczepu komórek macierzystych krwiotwórczych, wśród których do najważniejszych zalicza się:

• obecność dodatnich wyników testów na zakażenie cytomegalowirusem u biorcy lub dawcy (bez leczenia profilaktycznego);
• ostra choroba popromienna;
• obecność lub nawet podejrzenie obecności zakażenia grzybiczego u chorego (bez stosowania systemowej wczesnej profilaktyki za pomocą leków grzybobójczych);
• hemoblastozy, w których pacjenci otrzymywali długotrwałe leczenie cytostatykami (ze względu na duże prawdopodobieństwo nagłego zatrzymania krążenia i niewydolności wielonarządowej);
• przeszczep od dawców o różnym HLA (bez profilaktyki ostrej reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi cyklosporyną A);
• przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby typu C (ze względu na duże ryzyko rozwoju choroby wenookluzyjnej wątroby).

Tak więc przeszczep HSC może powodować poważne komplikacje, które często prowadzą do śmierci. We wczesnym okresie (do 100 dni po przeszczepie) obejmują one powikłania infekcyjne, ostrą chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi, odrzucenie przeszczepu (niewydolność dawcy HSC), chorobę wątroby z zatkaniem żył, a także uszkodzenie tkanek spowodowane toksycznością schematu kondycjonowania, który charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem przebudowy (skóra, śródbłonek naczyniowy, nabłonek jelitowy). Powikłania późnego okresu po przeszczepie obejmują przewlekłą chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi, nawroty choroby podstawowej, zahamowanie wzrostu u dzieci, dysfunkcję układu rozrodczego i tarczycy oraz uszkodzenie oczu.

Ostatnio, w związku z publikacjami na temat plastyczności komórek szpiku kostnego, pojawił się pomysł wykorzystania komórek HSC do leczenia zawałów serca i innych chorób. Chociaż niektóre eksperymenty na zwierzętach potwierdzają tę możliwość, wnioski dotyczące plastyczności komórek szpiku kostnego muszą zostać potwierdzone. Okoliczność ta powinna być wzięta pod uwagę przez tych badaczy, którzy uważają, że przeszczepione ludzkie komórki szpiku kostnego łatwo przekształcają się w komórki mięśni szkieletowych, mięśnia sercowego lub ośrodkowego układu nerwowego. Hipoteza, że komórki HSC są naturalnym źródłem komórkowym regeneracji tych narządów, wymaga poważnych dowodów.

W szczególności opublikowano pierwsze wyniki otwartego, randomizowanego badania V. Belenkova (2003). Jego celem było zbadanie wpływu C-SvK (tj. mobilizacji autologicznych komórek macierzystych krwi do krwi) na stan kliniczny, hemodynamiczny i neurohumoralny pacjentów z umiarkowaną do ciężkiej przewlekłą niewydolnością serca, a także ocena jego bezpieczeństwa na tle standardowej terapii (inhibitory konwertazy angiotensyny, beta-blokery, leki moczopędne, glikozydy nasercowe). W pierwszej publikacji wyników badania autorzy programu zauważają, że jedynym argumentem na korzyść O-SvK są wyniki leczenia jednego pacjenta, który wykazał niepodważalną poprawę wszystkich parametrów klinicznych i hemodynamicznych na tle terapii tym lekiem. Jednakże teoria mobilizacji komórek macierzystych krwi do krwiobiegu i późniejszej regeneracji mięśnia sercowego w strefie pozawałowej nie potwierdziła się – nawet u pacjenta z pozytywną dynamiką kliniczną, echokardiografia obciążeniowa z dobutaminą nie wykazała pojawienia się stref żywotnego mięśnia sercowego w obszarze blizny.

Należy zauważyć, że obecnie nie ma wyraźnie wystarczających danych, aby zalecić terapię zastępczą komórkami do powszechnego stosowania w codziennej praktyce klinicznej. Dobrze zaprojektowane i wysokiej jakości badania kliniczne są potrzebne, aby określić skuteczność różnych opcji terapii regeneracyjnej komórkami, opracować wskazania i przeciwwskazania do niej, a także wytyczne dotyczące łącznego stosowania terapii regeneracyjno-plastycznej i tradycyjnego leczenia chirurgicznego lub zachowawczego. Nadal nie ma odpowiedzi na pytanie, która konkretna populacja komórek szpiku kostnego (macierzyste hematopoetyczne lub podścieliskowe) może dawać początek neuronom i kardiomiocytom, a także nie jest jasne, jakie warunki przyczyniają się do tego in vivo.

Prace w tych obszarach są prowadzone w wielu krajach. W podsumowaniu sympozjum na temat ostrej niewydolności wątroby Narodowych Instytutów Zdrowia USA wśród obiecujących metod leczenia, obok przeszczepu wątroby, odnotowano przeszczep kseno- lub allogenicznych hepatocytów oraz pozaustrojowe połączenie bioreaktorów z komórkami wątroby. Istnieją bezpośrednie dowody na to, że tylko obce funkcjonalnie aktywne hepatocyty są w stanie zapewnić skuteczne wsparcie dla wątroby biorcy. Do klinicznego wykorzystania izolowanych hepatocytów konieczne jest utworzenie banku komórek, co znacznie skróci czas między izolacją komórek a ich wykorzystaniem. Najbardziej akceptowalną metodą tworzenia banku izolowanych hepatocytów jest kriokonserwacja komórek wątroby w ciekłym azocie. Przy stosowaniu takich komórek w klinice u pacjentów z ostrą i przewlekłą niewydolnością wątroby ujawniono dość wysoki efekt terapeutyczny.

Pomimo optymistycznych i zachęcających wyników przeszczepu komórek wątroby w eksperymentach i praktyce klinicznej, nadal istnieje wiele problemów, które są dalekie od rozwiązania. Należą do nich ograniczona liczba narządów nadających się do uzyskania izolowanych hepatocytów, niewystarczająco skuteczne metody ich izolacji, brak znormalizowanych metod konserwacji komórek wątroby, niejasne wyobrażenia o mechanizmach regulacji wzrostu i proliferacji przeszczepionych komórek, brak odpowiednich metod oceny przyjęcia lub odrzucenia allogenicznych hepatocytów. Obejmuje to również obecność odporności przeszczepu przy użyciu komórek allogenicznych i ksenogenicznych, chociaż mniejszej niż w ortotopowym przeszczepie wątroby, ale wymagającej stosowania leków immunosupresyjnych, otoczkowania izolowanych hepatocytów lub ich specjalnego traktowania enzymami. Przeszczep hepatocytów często prowadzi do konfliktu immunologicznego między biorcą a dawcą w postaci reakcji odrzucenia, która wymaga zastosowania cytostatyków. Rozwiązaniem tego problemu może być zastosowanie polimerycznych nośników mikroporowatych do izolowania komórek wątroby, co zwiększy ich przeżywalność, gdyż błona otoczki skutecznie chroni hepatocyty pomimo immunizacji gospodarza.

Jednak w przypadku ostrej niewydolności wątroby taki przeszczep hepatocytów jest nieskuteczny ze względu na stosunkowo długi czas potrzebny komórkom wątroby do zagnieżdżenia się w nowym środowisku i osiągnięcia etapu optymalnego funkcjonowania. Potencjalnym ograniczeniem jest wydzielanie żółci podczas ektopowego przeszczepu izolowanych hepatocytów, a w przypadku stosowania bioreaktorów istotną barierą fizjologiczną jest niedopasowanie gatunkowe między białkami ludzkimi a białkami wytwarzanymi przez ksenogeniczne hepatocyty.

W literaturze istnieją doniesienia, że miejscowy przeszczep komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego ułatwia skuteczną korekcję ubytków kostnych, a odbudowa tkanki kostnej w tym przypadku przebiega intensywniej niż w przypadku spontanicznej regeneracji reparacyjnej. Kilka badań przedklinicznych na modelach eksperymentalnych przekonująco dowodzi możliwości wykorzystania przeszczepów komórek podścieliska szpiku kostnego w ortopedii, chociaż konieczne są dalsze prace w celu optymalizacji tych metod, nawet w najprostszych przypadkach. W szczególności nie znaleziono jeszcze optymalnych warunków ekspansji osteogenicznych komórek podścieliska ex vivo, a struktura i skład ich idealnego nośnika (matrycy) pozostają nieopracowane. Minimalna liczba komórek wymagana do objętościowej regeneracji kości nie została ustalona.

Udowodniono, że komórki macierzyste mezenchymalne wykazują plastyczność transgermalną, tj. zdolność do różnicowania się w typy komórek fenotypowo niezwiązane z komórkami linii pierwotnej. W optymalnych warunkach hodowli poliklonalne linie komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego mogą wytrzymać ponad 50 podziałów in vitro, co umożliwia uzyskanie miliardów komórek podścieliska z 1 ml aspiratu szpiku kostnego. Jednak populacja komórek macierzystych mezenchymalnych jest heterogeniczna, co objawia się zarówno zmiennością wielkości kolonii, różnym tempem ich powstawania, jak i różnorodnością morfologiczną typów komórek, od wrzecionowatych przypominających fibroblasty do dużych płaskich komórek. Heterogeniczność fenotypowa jest obserwowana już po 3 tygodniach hodowli komórek macierzystych podścieliska: niektóre kolonie tworzą guzki tkanki kostnej, inne tworzą skupiska adipocytów, a jeszcze inne, rzadsze, tworzą wyspy tkanki chrzęstnej.

Transplantacja embrionalnej tkanki nerwowej była początkowo stosowana w leczeniu chorób zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego. W ostatnich latach zamiast tkanki mózgowej embrionalnej przeszczepiano elementy komórkowe neurosfer uzyskanych z komórek macierzystych neuronów (Poltavtseva, 2001). Neurosfery zawierają zaangażowane prekursory neuronów i neuroglii, co daje nadzieję na przywrócenie utraconych funkcji mózgu po ich przeszczepieniu. Po przeszczepieniu rozproszonych komórek neurosfer do regionu prążkowia mózgu szczura zauważono ich proliferację i różnicowanie w neurony dopaminergiczne, co wyeliminowało asymetrię ruchową u szczurów z doświadczalnym hemiparkinsonizmem. Jednak w niektórych przypadkach z komórek neurosfer rozwijały się guzy, co prowadziło do śmierci zwierząt (Bjorklund, 2002).

W klinice, dokładne badania dwóch grup pacjentów, w których ani pacjenci, ani obserwujący ich lekarze nie wiedzieli (badanie podwójnie ślepe), że jednej grupie pacjentów przeszczepiono tkankę embrionalną z neuronami produkującymi dopaminę, a druga grupa pacjentów przeszła operację pozorowaną, dały nieoczekiwane rezultaty. Pacjenci, którym przeszczepiono tkankę nerwową zarodkową, nie czuli się lepiej niż pacjenci z grupy kontrolnej. Ponadto, u 5 z 33 pacjentów rozwinęła się trwała dyskineza 2 lata po przeszczepie tkanki nerwowej zarodkowej, której nie było u pacjentów z grupy kontrolnej (Komórki macierzyste: postęp naukowy i przyszłe kierunki badań. Nat. Inst, of Health. USA). Jednym z nierozwiązanych problemów badań klinicznych neuronalnych komórek macierzystych mózgu pozostaje analiza rzeczywistych perspektyw i ograniczeń przeszczepiania ich pochodnych w celu korekcji zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego. Możliwe, że neuronogeneza w hipokampie wywołana przedłużoną aktywnością napadową, prowadząca do jego strukturalnej i funkcjonalnej reorganizacji, może być czynnikiem postępującego rozwoju padaczki. Wniosek ten zasługuje na szczególną uwagę, ponieważ wskazuje na możliwe negatywne skutki powstawania nowych neuronów w dojrzałym mózgu i tworzenia przez nie nieprawidłowych połączeń synaptycznych.

Nie należy zapominać, że hodowla w mediach z cytokinami (mitogenami) zbliża cechy komórek macierzystych do cech komórek nowotworowych, gdyż zachodzą w nich podobne zmiany w regulacji cykli komórkowych, determinujące zdolność do nieograniczonego podziału. Nierozsądne jest przeszczepianie wczesnych pochodnych komórek macierzystych zarodka człowiekowi, gdyż w tym przypadku zagrożenie rozwojem nowotworów złośliwych jest bardzo wysokie. Znacznie bezpieczniej jest wykorzystywać ich bardziej zaangażowane potomstwo, czyli komórki prekursorowe zróżnicowanych linii. Jednak obecnie nie opracowano jeszcze niezawodnej techniki uzyskiwania stabilnych linii komórek ludzkich, które różnicują się w pożądanym kierunku.

Wykorzystanie technologii biologii molekularnej do korygowania patologii dziedzicznych i chorób człowieka poprzez modyfikację komórek macierzystych jest bardzo interesujące dla medycyny praktycznej. Cechy genomu komórek macierzystych umożliwiają opracowanie unikalnych schematów transplantacji w celu korygowania chorób genetycznych. Istnieje jednak szereg ograniczeń w tym obszarze, które należy pokonać przed praktycznym zastosowaniem inżynierii genetycznej komórek macierzystych. Przede wszystkim należy zoptymalizować proces modyfikacji genomu komórek macierzystych ex vivo. Wiadomo, że długotrwała (3-4 tygodnie) proliferacja komórek macierzystych zmniejsza ich transfeccję, dlatego do osiągnięcia wysokiego poziomu ich modyfikacji genetycznej konieczne jest przeprowadzenie kilku cykli transfeccji. Jednak główny problem wiąże się z czasem trwania ekspresji genów terapeutycznych. Do tej pory w żadnym badaniu okres efektywnej ekspresji po transplantacji zmodyfikowanych komórek nie przekroczył czterech miesięcy. W 100% przypadków z czasem ekspresja transfekowanych genów spada z powodu inaktywacji promotorów i/lub śmierci komórek ze zmodyfikowanym genomem.

Ważną kwestią jest koszt wykorzystania technologii komórkowych w medycynie. Na przykład szacowane roczne zapotrzebowanie na finansowanie wyłącznie kosztów medycznych jednostki przeszczepu szpiku kostnego zaprojektowanej do wykonywania 50 przeszczepów rocznie wynosi około 900 000 USD.

Rozwój technologii komórkowych w medycynie klinicznej jest złożonym i wieloetapowym procesem, który obejmuje konstruktywną współpracę między multidyscyplinarnymi ośrodkami naukowymi i klinicznymi oraz społecznością międzynarodową. Jednocześnie kwestie organizacji naukowej badań w dziedzinie terapii komórkowej wymagają szczególnej uwagi. Najważniejsze z nich to opracowanie protokołów badań klinicznych, kontrola nad wiarygodnością danych klinicznych, utworzenie krajowego rejestru badań, integracja z międzynarodowymi programami wieloośrodkowych badań klinicznych i wdrażanie wyników w praktyce klinicznej.

Podsumowując wprowadzenie do problematyki transplantologii komórkowej, chciałbym wyrazić nadzieję, że połączenie wysiłków czołowych ukraińskich specjalistów z różnych dziedzin nauki zapewni znaczny postęp w badaniach eksperymentalnych i klinicznych oraz pozwoli w najbliższych latach znaleźć skuteczne sposoby niesienia pomocy ciężko chorym ludziom potrzebującym przeszczepu narządów, tkanek i komórek.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]