Rola złogów kryształów w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów

Kryształy zasadowego fosforanu wapnia (BCP) występują w płynie stawowym u 30-60% pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Według A. Swana i in. (1994) kryształy zawierające wapń występują w płynie stawowym u znacznie większej liczby pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów; jednak ze względu na wyjątkowo mały rozmiar kryształów lub ich niewielką liczbę nie są one identyfikowane przy użyciu konwencjonalnych technik. Obecność kryształów BCP w płynie stawowym koreluje z radiograficznymi objawami zwyrodnienia chrząstki stawowej i wiąże się z większą objętością wysięku w porównaniu z wysiękiem w stawach kolanowych bez kryształów. Badanie czynników wpływających na radiograficzną progresję gonartrozy wykazało, że odkładanie się kryształów dwuwodnego pirofosforanu wapnia (CPPD) jest predyktorem niekorzystnego wyniku klinicznego i radiograficznego. W badaniu pacjentów w podeszłym wieku stwierdzono, że choroba zwyrodnieniowa stawów jest związana z chondrokalcynozą, szczególnie w bocznym przedziale piszczelowo-udowym kolana i pierwszych trzech stawach śródręczno-paliczkowych. Nie jest niczym niezwykłym, że u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów występują oba rodzaje kryształów, OFC i PFC.

Klinicznie, zwyrodnienie chrząstki stawowej spowodowane odkładaniem się kryształów wapnia różni się od tego obserwowanego w pierwotnej osteoartrozie. Gdyby kryształy były prostym epifenomenem zwyrodnienia chrząstki, można by je znaleźć w stawach najczęściej dotkniętych pierwotną osteoartrozą, tj. kolanach, biodrach i małych stawach rąk. Natomiast choroby związane z odkładaniem się kryształów najczęściej dotyczą stawów, które nie są typowe dla pierwotnej osteoartrozy, takich jak bark, nadgarstek i łokieć. Obecność kryształów w płynie stawowym (wysiękowym) wiąże się z cięższym zwyrodnieniem chrząstki stawowej. Kwestia, co jest przyczyną, a co skutkiem, odkładaniem się kryształów czy zwyrodnieniem chrząstki, jest przedmiotem debaty. Pośrednią pozycję zajmuje następujące założenie: pierwotna anomalia w metabolizmie chrząstki prowadzi do jej zwyrodnienia, a wtórne odkładanie się kryształów przyspiesza jej degradację (tzw. teoria pętli amplifikacji).

Dokładny mechanizm, za pomocą którego kryształy wapnia uszkadzają chrząstkę stawową, jest nieznany, podsumowano poniżej. Teoretycznie kryształy wapnia mogą bezpośrednio uszkadzać chondrocyty. Jednak badanie histologiczne rzadko ujawnia kryształy w pobliżu chondrocytów, a jeszcze rzadziej są one przez nie wchłaniane. Najbardziej prawdopodobnym mechanizmem jest fagocytoza kryształów przez komórki wyściółki błony maziowej, a następnie uwolnienie enzymów proteolitycznych lub wydzielanie cytokin, które stymulują uwalnianie enzymów przez chondrocyty. Koncepcję tę potwierdza badanie roli zapalenia błony maziowej wywołanego przez PFKD w rozwoju szybko postępującej choroby zwyrodnieniowej stawów w artropatii pirofosforanowej. W tym badaniu kryształy dwuwodnego pirofosforanu wapnia (1 lub 10 mg) wstrzykiwano co tydzień do prawego kolana królików z chorobą zwyrodnieniową stawów wywołaną częściową boczną meniscektomią. Okazało się, że po 8 zastrzykach prawy staw kolanowy wykazywał znacznie poważniejsze zmiany w porównaniu do lewego. Intensywność zapalenia błony maziowej korelowała z dostawowymi wstrzyknięciami kryształów dwuwodnego pirofosforanu wapnia i ich dawką. Pomimo faktu, że dawki kryształów CPPD stosowane w tym badaniu przekraczają te in vivo, wyniki wskazują na rolę stanu zapalnego wywołanego przez CPPD w postępie choroby zwyrodnieniowej stawów w artropatii pirofosforanowej.

Potencjalne mechanizmy wywoływania uszkodzeń chrząstki stawowej przez kryształy zawierające wapń są związane z ich właściwościami mitogennymi, zdolnością do indukowania MMP i stymulowania syntezy prostaglandyn.

Mitogenne działanie kryształów zawierających wapń. W artropatiach związanych z kryształami często obserwuje się proliferację komórek wyściółki błony maziowej, przy czym same kryształy są tylko częściowo odpowiedzialne za ten proces. Wzrostowi liczby komórek błony maziowej towarzyszy zwiększone wydzielanie cytokin, które promują chondrolizę i indukują wydzielanie enzymów proteolitycznych. Kryształy OFC w stężeniach występujących w patologii stawów u ludzi zależnie od dawki stymulują mitogenezę kultur fibroblastów skóry spoczynkowej oraz fibroblastów błony maziowej psów i myszy. Kryształy dwuwodnego pirofosforanu wapnia, moczanu, siarczanu, węglanu i fosforanu wapnia stymulują wzrost komórek. Początek i szczyt włączania ( ^3H )-tymidyny indukowane przez te kryształy są przesunięte o 3 godziny w porównaniu do stymulacji komórek surowicą krwi. Ten okres czasu może być konieczny do fagocytozy i rozpuszczenia kryształów. Dodanie kryształów kontrolnych o tej samej wielkości (np. pyłu diamentowego lub cząstek lateksu) nie stymulowało mitogenezy. Kryształy jednowodnego moczanu sodu miały słabe właściwości mitogenne i były znacznie gorsze od kryształów moczanu wapnia, co wskazuje na znaczenie zawartości wapnia w kryształach w mitogenezie. Syntetyczne kryształy OFC miały takie same właściwości mitogenne jak kryształy uzyskane od pacjentów z chondrokalcynozą. Mitogenny efekt kryształów zawierających wapń nie był wynikiem wzrostu zawartości wapnia w otaczającym podłożu odżywczym in vitro, ponieważ rozpuszczenie zasadowych kryształów fosforanu wapnia w podłożu odżywczym nie stymulowało włączania ( ^3H )-tymidyny przez fibroblasty.

Jednym z proponowanych mechanizmów mitogenezy indukowanej przez OFC jest to, że nieprawidłowa proliferacja komórek błony maziowej może być spowodowana, przynajmniej częściowo, endocytozą i wewnątrzkomórkowym rozpuszczeniem kryształów, co zwiększa stężenie cytoplazmatycznego Ca ²⁺ i aktywuje zależną od wapnia ścieżkę prowadzącą do mitogenezy. Koncepcję tę potwierdza wymóg bezpośredniego kontaktu komórka-kryształ w celu stymulacji mitogenezy, ponieważ narażenie hodowli komórkowych na kryształy indukowało wzrost komórek, podczas gdy narażenie komórek pozbawionych takiego kontaktu nie powodowało tego. Aby zbadać wymóg fagocytozy kryształów po interakcji komórka-kryształ, komórki hodowano z ⁴⁵ Ca-OPC i ( ^3H )-tymidyną. Stwierdzono, że komórki zawierające ⁴⁵ Ca-OPC włączały znacznie więcej ( ^3H )-tymidyny niż komórki bez znakowania zasadowym fosforanem wapnia. W hodowlach makrofagów hamowanie endocytozy kryształów przez cytochalazynę skutkowało zahamowaniem rozpuszczania kryształów, co dodatkowo podkreśla konieczność fagocytozy.

Kryształy zawierające wapń są rozpuszczalne w kwasie. Po fagocytozie kryształy rozpuszczają się w kwaśnym środowisku fagolizosomów makrofagów. Chlorochina, chlorek amonu, bafilomycyna A1 i wszystkie środki lizosomotropowe, które zwiększają pH lizosomów, zależnie od dawki hamują wewnątrzkomórkowe rozpuszczanie kryształów i wychwyt (3H)-tymidyny ^w fibroblastach hodowanych z zasadowymi kryształami fosforanu wapnia.

Dodanie kryształów OFC do hodowli fibroblastów monowarstwowych spowodowało natychmiastowy dziesięciokrotny wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia, który powrócił do poziomu wyjściowego po 8 minutach. Źródłem wapnia były głównie jony pozakomórkowe, ponieważ podstawowe kryształy fosforanu wapnia dodano do bezwapniowego podłoża hodowlanego. Kolejny wzrost stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia zaobserwowano po 60 minutach i trwał on co najmniej 3 godziny. W tym przypadku źródłem wapnia były fagocytowane kryształy rozpuszczone w fagolizosomach.

Stwierdzono, że mitogenny efekt kryształów OFC jest podobny do efektu PDGF jako czynnika wzrostu; podobnie jak ten ostatni, kryształy OFC wykazują synergię z IGF-1 i osoczem krwi. Blokada IGF-1 zmniejsza mitogenezę komórek w odpowiedzi na OFC. PG Mitchell i in. (1989) wykazali, że indukcja mitogenezy w fibroblastach Balb/c- _{3 T3przez} kryształy OFC wymaga obecności serynowo/treoninowej kinazy białkowej C (PKC), jednego z głównych mediatorów sygnałów generowanych podczas zewnętrznej stymulacji komórek hormonami, neuroprzekaźnikami i czynnikami wzrostu. Spadek aktywności PKC w komórkach Balb/c-3 T3 _{hamuje indukcję protoonkogenów c-fos i c-myc za pośrednictwemOFC}, ale nie wpływa na stymulację tych onkogenów za pośrednictwem PDGF.

Wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia po rozpuszczeniu fagocytowanych kryształów nie jest jedyną ścieżką sygnałową dla mitogenezy. Kiedy czynniki wzrostu, takie jak PDGF, wiążą się ze swoim receptorem błonowym, stymulowana jest fosfolipaza C (fosfodiesteraza), która hydrolizuje 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu, tworząc wewnątrzkomórkowe przekaźniki: inozytolo-3-fosforan i diacyloglicerol. Pierwszy z nich uwalnia wapń z siateczki śródplazmatycznej poprzez modulację aktywności zależnych od wapnia i zależnych od wapnia/kalmoduliny enzymów, takich jak kinazy białkowe i proteazy.

R. Rothenberg i H. Cheung (1988) opisali zwiększoną degradację 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu przez fosfolipazę C w komórkach błony maziowej królika w odpowiedzi na stymulację kryształami OFC. Te ostatnie znacząco zwiększyły zawartość inozytolu-1-fosforanu w komórkach ze znakowanym ( ^3H )-inozytolem; szczyt został osiągnięty w ciągu 1 minuty i utrzymywał się przez około 1 godzinę.

Diacyloglicerol jest potencjalnym aktywatorem dwuwodnego pirofosforanu wapnia. Ponieważ kryształy OFC zwiększają aktywność fosfolipazy C, co prowadzi do akumulacji diacyloglicerolu, w konsekwencji można spodziewać się wzrostu aktywacji PKC. PG Mitchell i in. (1989) porównali wpływ kryształów OFC i PDGF na syntezę DNA przez _{fibroblasty Balb/c-3T3}. W hodowli komórkowej PKC została inaktywowana przez inkubację komórek z diestrem forbolu podtrzymującym guz (TPD), analogiem diacyloglicerolu. Długotrwała stymulacja niskimi dawkami TPD zmniejszyła aktywność PKC, podczas gdy pojedyncza stymulacja dużą dawką ją aktywowała. Stymulacja syntezy DNA przez kryształy OFC została zahamowana po inaktywacji PKC, co wskazuje na znaczenie tego enzymu w mitogenezie indukowanej przez OFC. Wcześniej GM McCarthy i in. (1987) wykazali związek między odpowiedzią mitogenną ludzkich fibroblastów na kryształy OFC a aktywacją PKC. Jednakże kryształy OFC nie aktywują kinazy fosfatydyloinozytolu 3 ani kinaz tyrozynowych, co potwierdza, że mechanizm aktywacji komórek przez kryształy OFC jest selektywny.

Proliferacja komórek jest kontrolowana przez grupę genów zwanych protoonkogenami. Białka foe i mye, produkty protoonkogenów c-fos i c-myc, są zlokalizowane w jądrze komórkowym i wiążą się ze specyficznymi sekwencjami DNA. Stymulacja fibroblastów 3T3 kryształami OFC powoduje ekspresję c-fos w ciągu kilku minut, która osiąga maksimum 30 minut po stymulacji. Indukcja transkrypcji c-myc przez kryształy OFC lub PDGF następuje w ciągu 1 godziny i osiąga maksimum 3 godziny po stymulacji. Komórki utrzymują podwyższony poziom transkrypcji c-fos i c-myc przez co najmniej 5 godzin. W komórkach z inaktywowanym PCD stymulacja c-fos i c-myc przez kryształy OFC lub TFD jest znacząco tłumiona, podczas gdy indukcja tych genów przez PDGF nie zmienia się.

Członkowie rodziny kinaz białkowych aktywowanych mitogenem (MAP K) są kluczowymi regulatorami różnych kaskad sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Jedna podklasa tej rodziny, p42/p44, reguluje proliferację komórek poprzez mechanizm obejmujący aktywację protoonkogenów c-fos i c-jun. Kryształy OFC i PFKD aktywują szlak sygnalizacji kinazy białkowej, który obejmuje zarówno p42, jak i p44, co sugeruje rolę tego szlaku w mitogenezie indukowanej przez kryształy zawierające wapń.

Wreszcie, mitogeneza indukowana przez OFC obejmuje czynnik transkrypcyjny jądrowy czynnik κB (NF-κB), który został po raz pierwszy opisany jako gen lekkiego łańcucha immunoglobuliny κ (IgK). Jest to indukowalny czynnik transkrypcyjny ważny w wielu szlakach sygnałowych, ponieważ reguluje ekspresję różnych genów. Indukcja NF-κB jest zwykle sprzężona z uwalnianiem białek hamujących zwanych IκB z cytoplazmy. Indukcji NF-κB towarzyszy translokacja aktywnego czynnika transkrypcyjnego do jądra. Kryształy OFC indukują NF-κB w fibroblastach Balb/c- _3T3 i fibroblastach skóry ludzkiej.

Kilka ścieżek może być zaangażowanych w przekazywanie sygnału po aktywacji NF-κB, ale wszystkie obejmują kinazy białkowe, które fosforylują (a tym samym degradują) IκB. Na podstawie badań in vitro uważano wcześniej, że IκB służy jako substrat dla kinaz (np. PKC i kinazy białkowej A). Jednak niedawno zidentyfikowano kompleks kinazy IκB o dużej masie cząsteczkowej. Kinazy te specyficznie fosforylują reszty serynowe IκB. Aktywacja NF-κB przez TNF-α i IL-1 wymaga wydajnego działania kinazy indukującej NF-κB (NIK) i kinazy IκB. Mechanizm molekularny aktywacji NIK jest obecnie nieznany. Chociaż kryształy OFC aktywują zarówno PKC, jak i NF-κB, zakres, w jakim te dwa procesy mogą być powiązane, jest nieznany. Ponieważ modyfikacja kinazy GκB zachodzi poprzez fosforylację, nie można wykluczyć roli PKC w indukcji NF-κB przez kryształy OFC poprzez fosforylację i aktywację kinazy GκB. Koncepcję tę potwierdza hamowanie mitogenezy indukowanej przez kryształy OFC i ekspresji NF-κB przez inhibitor PKC, staurosporynę. Podobnie, staurosporyna może hamować kinazę GκB, a tym samym hamować kinazę białkową A i inne kinazy białkowe.

Mechanizm mitogenezy fibroblastów wywołanej przez kryształy OFC obejmuje zatem co najmniej dwa różne procesy:

• szybkie zdarzenie związane z błoną komórkową, które powoduje aktywację PKC i MAP K, indukcję NF-κB i protoonkogenów,
• wolniejsze wewnątrzkomórkowe rozpuszczanie kryształów, co prowadzi do zwiększenia wewnątrzkomórkowej zawartości Ca2 ⁺, a następnie do aktywacji szeregu procesów zależnych od wapnia, które stymulują mitogenezę.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Indukcja przez kryształy zawierające MMP-wapń

Mediatorami uszkodzeń tkanek przez kryształy zawierające wapń są MMP - kolagenaza-1, stromelizyna, żelatynaza 92 kD i kolagenaza-3.

Biorąc pod uwagę związek między zawartością kryształów OFC a zniszczeniem tkanki stawowej, wysunięto hipotezę, że kryształy OFC i prawdopodobnie niektóre kolageny są fagocytowane przez komórki błony maziowej. Pobudzone synowocyty proliferują i wydzielają proteazy. Hipotezę tę przetestowano in vitro poprzez dodanie naturalnych lub syntetycznych kryształów OFC, PFCD i innych do hodowanych ludzkich lub psich synowocytów. Aktywność neutralnych proteaz i kolagenaz wzrastała zależnie od dawki i była około 5-8 razy wyższa niż w przypadku hodowli komórek kontrolnych hodowanych bez kryształów.

W komórkach hodowanych w podłożu zawierającym kryształy stwierdzono współindukcję kolagenazy-1, stromelizyny i mRNA żelatynazy-92 kDa, a następnie wydzielanie enzymów do podłoża.

Kryształy OFC indukowały również akumulację mRNA kolagenazy-1 i kolagenazy-2 w dojrzałych chondrocytach świni, a następnie wydzielanie enzymów do podłoża.

GM McCarty i in. (1998) badali rolę wewnątrzkomórkowego rozpuszczania kryształów w indukowanej kryształami produkcji MMP. Podniesienie pH lizosomów za pomocą bafilomycyny A zahamowało wewnątrzkomórkowe rozpuszczanie kryształów, a także osłabiło odpowiedź proliferacyjną ludzkich fibroblastów na kryształy OFC, ale nie zahamowało syntezy i wydzielania MMP.

Ani zasadowy fosforan wapnia ani kryształy PFCD nie indukowały produkcji IL-1 in vitro, natomiast kryształy moczanu sodu tak.

Aktualne dane jednoznacznie wskazują na bezpośrednią stymulację produkcji MMP przez fibroblasty i chondrocyty pod wpływem kontaktu z kryształami zawierającymi wapń.

Objawy choroby zwyrodnieniowej stawów wskazują na znaczącą rolę MMP w postępie choroby. Obecność kryształów zawierających wapń zwiększa degenerację tkanek dotkniętych stawów.

Stymulacja syntezy prostaglandyn

Oprócz stymulacji wzrostu komórek i wydzielania enzymów, kryształy zawierające wapń powodują uwalnianie prostaglandyn z kultur komórek ssaków, zwłaszcza PGE2 _. Uwalnianie PGE2 _we wszystkich przypadkach następuje w ciągu pierwszej godziny po wystawieniu komórek na działanie kryształów. R. Rothenberg (1987) ustalił, że głównymi źródłami kwasu arachidonowego do syntezy PGE2 _są fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina, a także potwierdził, że fosfolipaza A2 _i NOX są dominującymi szlakami _produkcji PGE2.

PGE1 może być również uwalniany w odpowiedzi na kryształy OFA. GM McCarty i in. (1993, 1994) badali wpływ PGE2 _, PGE i jego analogu misoprostolu na mitogenną odpowiedź ludzkich fibroblastów na kryształy OFA. Wszystkie trzy środki hamowały odpowiedź mitogenną w sposób zależny od dawki, przy czym PGE i misoprostol wykazywały bardziej wyraźną aktywność hamującą. PGE2 i misoprostol, ale nie PGE2 _, hamowały akumulację mRNA kolagenazy w odpowiedzi na kryształy OFA.

MG McCarty i H. Cheung (1994) zbadali mechanizm aktywacji komórek przez OFC za pomocą PGE. Autorzy wykazali, że PGE, silniejszy induktor wewnątrzkomórkowego cAMP niż PGE2 _, i PGE, hamują mitogenezę indukowaną przez OFC i produkcję MMP poprzez zależną od cAMP ścieżkę przekazywania sygnału. Możliwe, że wzrost produkcji PGE indukowany przez kryształy OFC osłabia ich inne biologiczne efekty (mitogenezę i produkcję MMP) poprzez mechanizm sprzężenia zwrotnego.

Zapalenie wywołane kryształami

Kryształy zawierające wapń często występują w płynie stawowym u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów, jednak epizody ostrego zapalenia z leukocytozą są rzadkie zarówno w chorobie zwyrodnieniowej stawów, jak i w artropatiach związanych z kryształami (na przykład zespół barku Milwaukee). Potencjał flogistonowy kryształów może być modyfikowany przez szereg czynników hamujących. R. Terkeltaub i in. (1988) wykazali zdolność surowicy krwi i osocza do znacznego hamowania odpowiedzi granulocytów obojętnochłonnych na kryształy zasadowego fosforanu wapnia. Czynnikami powodującymi takie hamowanie są białka wiążące kryształy. Badanie jednego z tych białek, glikoproteiny ₂ -HS (AHSr), wykazało, że AHSР jest najsilniejszym i najspecyficznym inhibitorem odpowiedzi granulocytów obojętnochłonnych na kryształy OFC. AHSr jest białkiem surowicy pochodzenia wątrobowego; Wiadomo, że w porównaniu z innymi białkami surowicy występuje w stosunkowo wysokich stężeniach w kościach i tkance mineralizującej. Ponadto AHSr jest obecny w „niezapalnym” płynie stawowym i został również wykryty na kryształach zasadowego fosforanu wapnia w natywnym płynie stawowym. Tak więc nie można wykluczyć możliwości, że AHSr moduluje potencjał flogogenny zasadowych kryształów fosforanu wapnia in vivo.

Podsumowując powyższe, przedstawiamy dwa schematy patogenezy choroby zwyrodnieniowej stawów zaproponowane przez WB van den Berg i wsp. (1999) oraz M. Carrabba i in. (1996), które łączą czynniki mechaniczne, genetyczne i biochemiczne.