Immunofenotypowanie hemoblastoz

Znaczący postęp w badaniach hematologicznych w ostatnich latach wiąże się z wykorzystaniem nowoczesnych metod immunologicznych oraz zautomatyzowanych środków analizy i sortowania komórek krwi obwodowej i szpiku kostnego - cytometrów przepływowych. Tradycyjne badania morfologiczne i cytochemiczne komórek podłoża choroby (krew, czerwony szpik kostny, węzły chłonne, śledziona itp.) w wielu przypadkach, zwłaszcza w chorobach limfoproliferacyjnych, nie pozwalają na identyfikację pełnej różnorodności wariantów wśród form morfologicznie podobnych i ustalenie źródła pochodzenia klonu patologicznego. Problemy te można rozwiązać tylko poprzez badanie cech immunologicznych komórek. Każdemu etapowi różnicowania komórek hematopoetycznych odpowiada własny zestaw antygenów, które zgodnie z międzynarodową klasyfikacją nazywane są różnicowaniem i dzielą się na klastry różnicowania, oznaczane CD.

W zmianach nowotworowych blokada różnicowania może wystąpić na każdym etapie prawidłowego rozwoju komórki, powodując powstanie klonu komórek patologicznych, które determinują podłoże choroby i mają takie same cechy immunologiczne (lub fenotypowe). Poprzez przeprowadzenie badań tych markerów na komórkach możliwe jest określenie, jakiej formie i odmianie choroby odpowiadają, czyli na podstawie fenotypu immunologicznego komórek, przeprowadzenie diagnostyki różnicowej, co jest najtrudniejsze w chorobach limfoproliferacyjnych, ponieważ główną komórką podłoża patologicznego choroby są komórki morfologicznie niemal identyczne.

Fenotypowanie pozwala na użycie przeciwciał monoklonalnych do typowania blastów i dojrzałych komórek krwi serii mielocytowej, mono-, limfocytarnej poprzez obecność antygenów różnicowania (receptorów) w ścianie komórkowej. W rozdziale „Ocena stanu odporności organizmu” opisano częściowo charakterystykę i wartość diagnostyczną badania markerów komórkowych; poniżej znajduje się krótki opis markerów antygenowych komórek w odniesieniu do diagnostyki hemoblastoz. Następujące antygeny (markery) można wykryć na błonach komórek krwi i czerwonego szpiku kostnego.

• CD2 jest monomerycznym glikoproteiną transbłonową. Jest obecna na powierzchni wszystkich limfocytów T krążących we krwi i na niektórych limfocytach NK. CD2 bierze udział w procesie alternatywnej aktywacji limfocytów T. Wykrywanie CD2 za pomocą przeciwciał monoklonalnych w praktyce klinicznej jest wykorzystywane do fenotypowania ostrej białaczki komórek T, chłoniaków, przewlekłych stanów zapalnych i niedoborów odporności.
• CD3 to kompleks białkowy związany z receptorem limfocytów T specyficznym dla antygenu, jest głównym markerem funkcjonalnym limfocytów T. Ułatwia on transfer sygnału aktywacji z błony do cytoplazmy komórki. Oznaczanie CD3 jest wskazane w diagnostyce ostrej białaczki limfocytów T, chłoniaków (CD3 nie jest wyrażany w nowotworach limfoidalnych niebędących nowotworami limfoidalnymi komórek T) i chorób niedoboru odporności.
• CD4 to glikoproteina transbłonowa ekspresowana przez subpopulację limfocytów T pomocniczych (induktorów), które stanowią 45% limfocytów krwi obwodowej. We wczesnych stadiach rozwoju limfocytów w grasicy antygeny CD4, jak również CD8, są ekspresowane przez wszystkie limfocyty korowe. Tymocyty rdzeniaste, których fenotyp jest podobny do dojrzałych limfocytów T CD4+ krwi obwodowej (komórki T pomocnicze), ekspresują już receptory CD4 lub CD8. We krwi obwodowej do 5% komórek przenosi zarówno markery CD4, jak i CD8. Niewielka ekspresja CD4 jest możliwa na niektórych komórkach serii monocytowej. CD4 jest ekspresowany w większości przypadków chłoniaków komórek T, w tym ziarniniaka grzybiastego, a także w białaczce komórek T związanej z HTLV (HTLV - ludzki wirus limfotropowy T).
• CD5 to jednołańcuchowa glikoproteina obecna na wszystkich dojrzałych limfocytach T i większości tymocytów, słabo ekspresjonowana przez limfocyty B. CD5 jest wykrywana na komórkach nowotworowych przewlekłej białaczki limfocytowej komórek B i chłoniaka centrocytowego. W innych typach złośliwych chorób limfoidalnych - chłoniaku grudkowym, białaczce włochatokomórkowej, chłoniaku wielkokomórkowym - CD5 nie jest ekspresjonowana.
• CD7 to białko jednołańcuchowe, najwcześniejszy marker różnicowania komórek T. Jest ono wyrażane przez prolimfocyty T jeszcze przed ich migracją do grasicy. CD7 jest wykrywane na większości komórek NK, słaba ekspresja jest zauważalna na monocytach. Limfocyty B i granulocyty nie zawierają tego antygenu. Oznaczenie CD7 jest wykorzystywane do diagnozowania chłoniaków, dziecięcej białaczki limfoblastycznej komórek T.
• CD8 to białko składające się z dwóch łańcuchów polipeptydowych połączonych mostkami disiarczkowymi. Jest ono wyrażane przez subpopulację cytotoksycznych i supresorowych limfocytów T, które stanowią 20-35% limfocytów krwi obwodowej. Ten antygen jest również wyrażany przez limfocyty NK, tymocyty korowe, 30% tymocytów rdzeniowych i subpopulację czerwonych komórek szpiku kostnego. CD8 jest badane w celu ilościowego określenia zawartości supresorów T (patrz sekcja „Limfocyty supresorowe T we krwi” powyżej).

• CD10 to endopeptydaza związana z błoną komórkową. CD10 jest wyrażany przez młode formy limfocytów B i subpopulację limfocytów korowych. CD10 jest wyrażany przez wszystkie komórki ALL.
• CD11c jest ekspresowany na błonie komórkowej przez makrofagi, monocyty, granulocyty, komórki NK i komórki białaczki włochatokomórkowej.
• CD13 to glikoproteina ekspresowana przez komórki linii mielomonocytowej (komórki progenitorowe, neutrofile, bazofile, eozynofile, monocyty i komórki białaczki szpikowej). Nie występuje w limfocytach T i B, erytrocytach i płytkach krwi.
• CD14 to glikoproteina błonowa powierzchniowa. Jest ona wyrażana głównie przez monocyty i makrofagi. CD14 jest wykrywany w ponad 95% monocytów we krwi obwodowej i szpiku kostnym. Silna ekspresja CD14 jest obserwowana w ostrej białaczce mieloblastycznej. Ten antygen nie jest wyrażany w ostrej i przewlekłej białaczce limfoblastycznej.
• CD15 jest oligosacharydem. Bierze udział w fagocytozie i chemotaksji. Ten antygen jest obecny na powierzchni dojrzałych granulocytów i komórek Berezovsky-Sternberga. Ekspresję antygenu CD15 wykrywa się w chorobie Hodgkina. W chłoniakach nieziarniczych CD15 nie jest wykrywany w większości przypadków.
• CD16 jest wyrażany na powierzchni granulocytów, monocytów, makrofagów i komórek NK. Wszystkie limfocyty wyrażające ten antygen mają zdolność do cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał. CD16 jest określany podczas typowania przewlekłych białaczek mielocytowych w celu scharakteryzowania komórek NK.
• CD19 to glikoproteina obecna na wszystkich obwodowych limfocytach B i wszystkich prekursorach komórek B. Nie występuje w komórkach plazmatycznych. Jest najwcześniejszym markerem komórek B i odgrywa ważną rolę w regulacji aktywacji i proliferacji komórek B. CD19 jest ekspresowany na wszystkich komórkach nowotworowych ostrej białaczki pochodzenia B i jest również obecny w niektórych postaciach ostrej białaczki monoblastycznej.
• CD20 jest białkiem nieglikozylowanym. W ontogenezie limfocytów B antygen CD20 pojawia się po CD19 na etapie pre-B-komórkowego różnicowania limfocytów. Nie występuje w błonie plazmatycznej komórek plazmatycznych. Jest ekspresowany w ALL, przewlekłej białaczce limfocytowej komórek B, białaczce włochatokomórkowej, chłoniaku Burkitta i bardzo rzadko w ostrej białaczce monoblastycznej.
• CD21 to glikoproteina występująca w znacznych ilościach na limfocytach B w narządach limfoidalnych i w małych ilościach na komórkach B we krwi obwodowej. CD21 jest receptorem wirusa Epsteina-Barr.
• CD22 to białko składające się z dwóch łańcuchów polipeptydowych. Jest ono wyrażane na błonie większości limfocytów B, w tym komórek prekursorowych (prolimfocytów). Antygen nie jest wyrażany na limfocytach B (komórkach plazmatycznych) po ich aktywacji. Najbardziej wyraźną ekspresję CD22 wykrywa się na komórkach w białaczce włochatokomórkowej, słabą - w białaczce szpikowej i nie-T-komórkowej ALL.
• CD23 to glikoproteina wyrażana w znacznie większym stopniu przez aktywowane limfocyty B krwi obwodowej. CD23 pośredniczy w cytotoksyczności zależnej od IgE i fagocytozie przez makrofagi i eozynofile.
• CD25 to jednołańcuchowy glikoproteina zidentyfikowany jako receptor o niskim powinowactwie do IL-2. Receptor ten jest wyrażany na aktywowanych limfocytach T i, w mniejszym zagęszczeniu, na aktywowanych komórkach B. We krwi obwodowej zdrowych osób antygen jest obecny na ponad 5% komórek limfoidalnych.
• CD29 to receptor fibronektyny. Jest szeroko rozpowszechniony w tkankach i jest wyrażany przez leukocyty. Wykrywanie CD29 na komórkach krwi obwodowej jest wykorzystywane do typowania subpopulacji komórek T o fenotypie CD4+CD29+, które są nazywane komórkami pomocniczymi typu 2 (Th2). Komórki te uczestniczą w humoralnej odpowiedzi immunologicznej poprzez produkcję limfokin.
• CD33 jest glikoproteiną transbłonową. Jest obecna na powierzchni komórek serii mieloidalnej i monocytowej. Znajduje się na powierzchni monocytów i, w mniejszym stopniu, granulocytów we krwi obwodowej. Około 30% czerwonych komórek szpiku kostnego wyraża CD33, w tym mieloblasty, promielocyty i mielocyty. Antygen ten nie występuje w błonach pluripotentnych komórek macierzystych. Oznaczanie CD33 jest wykorzystywane do charakteryzowania komórek w białaczkach pochodzenia mieloidalnego. Komórki białaczkowe pochodzenia limfoidalnego i erytrocytowego nie wyrażają CD33.
• CD34 to fosfoglikoproteina ekspresowana przez hematopoetyczne komórki progenitorowe, w tym monopotencjalne komórki macierzyste. Najbardziej wyraźna ekspresja Ag jest obserwowana we wczesnych komórkach progenitorowych; w miarę dojrzewania komórek ekspresja markera maleje. CD34 występuje również na komórkach śródbłonka. Oznaczanie CD34 jest wykorzystywane do charakteryzowania komórek w ostrych białaczkach mieloblastycznych i limfoblastycznych. W przewlekłych białaczkach limfocytowych i chłoniakach ekspresja antygenu CD34 nie jest wykrywana.

• CD41a jest wyrażany przez płytki krwi i megakariocyty. Przeciwciała monoklonalne do wykrywania CD41a są używane do diagnozowania białaczki megakarioblastycznej. W trombastenii Glanzmanna ekspresja tego antygenu jest nieobecna lub znacząco stłumiona.
• CD42b to glikoproteina błonowa składająca się z dwóch łańcuchów polipeptydowych. Marker wykrywany jest na powierzchni płytek krwi i megakariocytów. W praktyce klinicznej wykrywanie CD42b jest wykorzystywane do diagnozowania trombocytopatii - zespołu Bernarda-Souliera.
• CD45RA należy do klasy glikoprotein transbłonowych. Jest powszechnym antygenem leukocytów. Jest wyrażany na błonie komórkowej limfocytów B, w mniejszym stopniu limfocytów T i na dojrzałych tymocytach rdzeniastych. Marker nie jest wyrażany przez granulocyty.
• CD45RO to niskocząsteczkowa izoforma CD45RA, powszechnego antygenu leukocytów. Wykrywa się ją na komórkach T (limfocytach pamięci T), subpopulacji limfocytów B, monocytów i makrofagów. Przeciwciała monoklonalne przeciwko CD45RO oddziałują z większością tymocytów, subpopulacją spoczynkowych limfocytów T CD4+ i CD8+ oraz dojrzałymi aktywowanymi komórkami T. Komórki pochodzenia mielomonocytowego, granulocyty i monocyty również niosą ten antygen. Wykrywa się go w chłoniakach centroblastycznych i immunoblastycznych.
• CD46 to dimer O-glikozylowany. Jest szeroko rozpowszechniony w tkankach i jest wyrażany przez limfocyty T i B, monocyty, granulocyty, komórki NK, płytki krwi, komórki śródbłonka, fibroblasty, ale nie występuje na powierzchni czerwonych krwinek. CD46 zapewnia ochronę tkanek przed dopełniaczem.
• CD61 to antygen płytkowy. Jest on wyrażany na płytkach krwi obwodowej i czerwonym szpiku kostnym, a także na megakariocytach i megakarioblastach. Jego oznaczenie jest stosowane jako marker w ostrej białaczce megakarioblastycznej. Ekspresja antygenu jest nieobecna lub stłumiona u pacjentów z trombastenią Glanzmanna.
• CD95, nazywany również Fas lub APO-1, jest glikoproteiną transbłonową, członkiem rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu. Jest on wyrażany w znacznych ilościach na limfocytach T (CD4+ i CD8+) we krwi obwodowej, a w mniejszym stopniu na limfocytach B i komórkach NK. Ten antygen jest również wyrażany na granulocytach, monocytach, komórkach tkankowych i komórkach nowotworowych. Wiązanie CD95 z ligandem Fas (CD95L) indukuje apoptozę w komórkach.
• CD95L, lub ligand Fas, jest białkiem błonowym należącym do rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu. Ten antygen jest wyrażany przez cytotoksyczne limfocyty T, komórki NK i bardzo często komórki nowotworowe; jest głównym induktorem apoptozy w komórkach.
• HLA-DR to monomorficzny wyznacznik klasy II cząsteczek ludzkiego głównego układu zgodności tkankowej (HLA). Marker jest wyrażany na komórkach Langerhansa, komórkach dendrytycznych narządów limfoidalnych, niektórych typach makrofagów, limfocytach B, aktywowanych limfocytach T i komórkach nabłonka grasicy. Badanie tego markera służy do ilościowego oznaczania aktywowanych limfocytów T o fenotypie CD3+ HLA-DR+.

Stosując różny dobór przeciwciał monoklonalnych do markerów, możliwe jest stworzenie portretu fenotypowego komórek charakterystycznych dla danej postaci białaczki.

Oprócz stosowania metod immunofenotypowania w diagnostyce i diagnostyce różnicowej hemoblastoz, szczególnie ważne okazało się ich wykorzystanie w procesie leczenia do oceny stanu remisji i resztkowej populacji komórek białaczkowych. Znając fenotypowy „portret” komórek blastycznych w okresie diagnozy, markery te pozwalają wykryć komórki klonu białaczkowego w okresie remisji, a poprzez wzrost ich liczby – przewidzieć rozwój nawrotu na długo przed (1-4 miesiące) pojawieniem się jego objawów klinicznych i morfologicznych.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]