Molekularne metody genetyczne do diagnozowania chorób dziedzicznych

Metody technologii DNA służą do określania lokalizacji zmutowanego genu w konkretnym chromosomie, odpowiedzialnego za powstanie niektórych form patologii dziedzicznej. Ponieważ gen jest odcinkiem DNA, a mutacja genu jest uszkodzeniem pierwotnej struktury DNA (pod pojęciem mutacji rozumie się wszelkie zmiany w sekwencji DNA, niezależnie od ich lokalizacji i wpływu na żywotność osobnika), to poprzez sondowanie preparatów chromosomów metafazowych pacjenta z chorobą dziedziczną możliwe jest ustalenie lokalizacji genu patologicznego. Metody genetyki molekularnej stwarzają możliwości diagnozowania chorób na poziomie zmienionej struktury DNA, pozwalają na określenie lokalizacji zaburzeń dziedzicznych. Metody genetyki molekularnej mogą identyfikować mutacje związane z wymianą nawet jednej pojedynczej zasady.

Najważniejszym etapem identyfikacji genu jest jego izolacja. DNA można wyizolować z dowolnego rodzaju tkanki i komórek zawierających jądra. Etapy izolacji DNA obejmują: szybką lizę komórek, usuwanie fragmentów organelli komórkowych i błon przez wirowanie, enzymatyczne niszczenie białek i ich ekstrakcję z roztworu za pomocą fenolu i chloroformu, zagęszczanie cząsteczek DNA przez wytrącanie w etanolu.

W laboratoriach genetycznych DNA jest najczęściej izolowane z leukocytów krwi, w tym celu pobiera się od pacjenta 5-20 ml krwi żylnej do sterylnej probówki z roztworem antykoagulantu (heparyny). Następnie leukocyty są oddzielane i przetwarzane zgodnie z powyższymi krokami.

Kolejnym etapem przygotowania materiału do badań jest „cięcie” DNA na fragmenty w obszarach o ściśle określonej sekwencji zasad, co odbywa się przy użyciu enzymów bakteryjnych – endonukleaz restrykcyjnych (enzymów restrykcyjnych). Enzymy restrykcyjne rozpoznają określone sekwencje 4-6, rzadziej 8-12 nukleotydów w dwuniciowej cząsteczce DNA i dzielą ją na fragmenty w miejscach tych sekwencji, zwanych miejscami restrykcyjnymi. Liczba powstałych fragmentów restrykcyjnych DNA jest uwarunkowana częstością występowania miejsc restrykcyjnych, a wielkość fragmentów jest uwarunkowana charakterem rozmieszczenia tych miejsc na długości pierwotnej cząsteczki DNA. Im częściej zlokalizowane są miejsca restrykcyjne, tym krótsze są fragmenty DNA po restrykcji. Obecnie znanych jest ponad 500 różnych typów enzymów restrykcyjnych pochodzenia bakteryjnego, a każdy z tych enzymów rozpoznaje własną określoną sekwencję nukleotydów. W przyszłości miejsca restrykcyjne mogą być wykorzystywane jako markery genetyczne DNA. Fragmenty DNA powstałe w wyniku restrykcji można uporządkować według długości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, a tym samym określić ich masę cząsteczkową. Zazwyczaj DNA w żelu identyfikuje się za pomocą specyficznego barwienia (zwykle bromkiem etydyny) i oglądania żelu w świetle ultrafioletowym. Miejsca lokalizacji DNA są oznaczone na czerwono. Jednak u ludzi, gdy DNA jest przetwarzane przez kilka enzymów restrykcyjnych, powstaje tak wiele fragmentów o różnej długości, że nie można ich rozdzielić za pomocą elektroforezy, tj. nie jest możliwe wizualne zidentyfikowanie poszczególnych fragmentów DNA na elektroforezie (uzyskuje się jednorodne barwienie na całej długości żelu). Dlatego też, aby zidentyfikować pożądane fragmenty DNA w takim żelu, stosuje się metodę hybrydyzacji z użyciem znakowanych sond DNA.

Każdy jednoniciowy segment DNA lub RNA jest zdolny do wiązania się (hybrydyzacji) z komplementarnym pasmem, przy czym guanina zawsze wiąże się z cytozyną, a adenina z tyminą. W ten sposób powstaje dwuniciowa cząsteczka. Jeśli jednoniciowa kopia sklonowanego genu zostanie oznaczona znacznikiem radioaktywnym, uzyskuje się sondę. Sonda jest w stanie znaleźć komplementarny segment DNA, który następnie jest łatwo identyfikowany za pomocą autoradiografii. Radioaktywna sonda dodana do preparatu rozciągniętych chromosomów umożliwia lokalizację genu na określonym chromosomie: za pomocą sondy DNA można zidentyfikować określone obszary podczas blottingu Southern. Hybrydyzacja występuje, jeśli badany odcinek DNA zawiera normalny gen. W przypadku obecności nieprawidłowej sekwencji nukleotydów, tj. odpowiadające struktury chromosomu zawierają zmutowany gen, hybrydyzacja nie nastąpi, co pozwala na określenie lokalizacji genu patologicznego.

Aby uzyskać sondy DNA, stosuje się metodę klonowania genów. Istota metody polega na tym, że fragment DNA odpowiadający genowi lub części genu jest wprowadzany do cząsteczki klonującej, zwykle plazmidu bakteryjnego (pierścieniowego DNA pozachromosomowego obecnego w komórkach bakteryjnych i niosącego geny oporności na antybiotyki), a następnie bakterie z plazmidem z wprowadzonym genem ludzkim są namnażane. Dzięki procesom syntezy w plazmidzie można uzyskać miliardy kopii genu ludzkiego lub jego części.

Powstałe kopie DNA, znakowane znacznikiem radioaktywnym lub fluorochromami, są następnie wykorzystywane jako sondy do wyszukiwania komplementarnych sekwencji w badanej puli cząsteczek DNA.

Obecnie istnieje wiele różnych metod diagnozowania mutacji genów przy użyciu sond DNA.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]