Diagnostyka chorób mitochondrialnych

Ocena charakteru dziedziczenia i manifestacji objawów klinicznych chorób mitochondrialnych

Ponieważ choroby miotochondrialne w niektórych przypadkach mogą być spowodowane uszkodzeniem genomu jądrowego, transmisja choroby będzie odpowiadać prawom dziedziczenia Mendla. W przypadkach, w których rozwój choroby jest spowodowany mutacjami w mitochondrialnym DNA, dziedziczenie będzie odpowiadać typowi mitochondrialnemu, to znaczy będzie przekazywane przez linię matczyną. Wreszcie, gdy patologia rozwija się z jednoczesnym uszkodzeniem genów genomu jądrowego i mitochondrialnego, dziedziczenie będzie złożone i zdeterminowane przez różne czynniki. W związku z tym w analizie genealogicznej według cechy formalnej (charakteru dziedziczenia według rodowodu) można stwierdzić najróżniejsze typy dziedziczenia: autosomalne dominujące, autosomalne recesywne, sprzężone z chromosomem X, mitochondrialne.

Rozwój takich chorób miotochondrialnych, jak zaburzenia metabolizmu kwasu pirogronowego lub beta-oksydacji kwasów tłuszczowych, cykl Krebsa, wiąże się z mutacjami genów genomu jądrowego. Patologie te charakteryzują się dziedziczeniem autosomalnym recesywnym, gdy rodzice są nosicielami mutacji (heterozygoty), a dziecko jest nosicielem obu odziedziczonych mutacji otrzymanych od ojca i matki (homozygota). Rodzice są zazwyczaj zdrowi na zewnątrz, a podobnej choroby lub jej mikroobjawów należy szukać u rodzeństwa chorego dziecka (proband sibs) oraz u krewnych zarówno ze strony matki, jak i ojca (kuzyni).

W przypadku recesywnego, sprzężonego z chromosomem X typu dziedziczenia (np. noworodkowa kwasica glutarowa typu II lub niedobór podjednostki E1 kompleksu pirogronowego, choroba Menkesa itp.), chłopcy są częściej dotknięci, a matki są nosicielkami mutacji i przekazują je swoim synom. Dziedziczenie matczyne różni się od sprzężonego z chromosomem X tym, że dotknięte są obie płcie. W takich przypadkach, analizując rodowód, należy przeanalizować częstość występowania choroby u mężczyzn, ponieważ nie ujawni się ona u kobiet. Rodowód nie pokazuje transmisji choroby wzdłuż linii ojciec-syn, ponieważ ojciec może przekazać swojemu synowi tylko chromosom Y.

Gdy choroba rozwija się z powodu uszkodzenia genomu mitochondrialnego (na przykład szereg chorób łańcucha oddechowego, neuropatia nerwu wzrokowego Lebera, MELAS, MERF, zespoły NARP itp.), dziedziczenie matczyne jest śledzone, ponieważ dziecko dziedziczy mitochondria od matki, a ona może je przekazać zarówno chłopcom, jak i dziewczynkom. W ten sposób obie płcie są dotknięte w równym stopniu. W związku z tym należy prześledzić transmisję choroby w linii matki w rodowodzie.

Analizując drzewo genealogiczne i poszukując objawów chorób mitochondrialnych u krewnych, należy pamiętać, że nasilenie choroby (wyrazistość znaku) może się znacznie różnić, co może wynikać z różnej liczby uszkodzonych mitochondriów, charakteru ich uszkodzenia, różnego rozmieszczenia mutacji w komórkach itp. Dlatego nie zawsze jest możliwe wykrycie oczywistych oznak chorób. W niektórych przypadkach wykrywane są albo pojedyncze, wymazane objawy, albo znaki, które można wykryć podczas ich ukierunkowanego wyszukiwania.

Rozwój patologii mitochondrialnej może być związany z uszkodzeniem dużych obszarów mitochondriów, tzw. mikrodelecjami (na przykład zespół Kearnsa-Sayre'a, zespół Pearsona, niektóre formy cukrzycy z głuchotą, postępująca zewnętrzna oftalmoplegia itp.). W takich przypadkach charakterystycznych objawów często nie stwierdza się u krewnych, ponieważ rozwój chorób wiąże się z pojawieniem się nowych mutacji, które wystąpiły w zygocie bezpośrednio po zapłodnieniu komórki jajowej ( mutacja de novo ). Choroba ma charakter sporadyczny. Często wraz z tymi chorobami dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący szereg stanów związanych z wieloma mutacjami mitochondrialnego DNA: na przykład niektóre formy encefalomiopatii, miopatia z uszkodzeniem oczu, pomimo obecności mutacji mtDNA (wielokrotne delecje), mają autosomalny dominujący typ dziedziczenia.

Jednakże w odróżnieniu od dziedziczenia mendlowskiego, autosomalny dominujący typ dziedziczenia w patologii mitochondrialnej charakteryzuje się dużą liczbą dotkniętych chorobą osobników w kolejnych pokoleniach.

Wreszcie, niektóre choroby mitochondrialne, często związane z wyczerpaniem mitochondriów mtDNA lub ich brakiem w komórkach, mogą być dziedziczone w sposób autosomalny recesywny. Należą do nich wrodzone formy miopatii, kardiomiopatii, zespołu neurodistresu, kwasicy mleczanowej, uszkodzenia wątroby itp.

Badanie charakteru dziedzicznego przekazywania choroby ma istotne znaczenie dla prognozy medycznej i genetycznej i wymaga dogłębnej analizy objawów klinicznych, a także znajomości mechanizmów powstawania patologii mitochondrialnej i sposobów jej dziedziczenia.

Manifestacja objawów klinicznych jest bardzo zróżnicowana od pierwszych dni życia do wieku dorosłego. Analizując ten wskaźnik, należy wziąć pod uwagę formy nozologiczne, ponieważ każda z nich ma pewien wiek debiutu.

Zaburzenia metaboliczne obserwowane w chorobach mitochondrialnych są postępujące w zdecydowanej większości przypadków. Początkowe objawy są często łagodne, następnie nasilają się i mogą prowadzić do poważnych zaburzeń powodujących niepełnosprawność. Rzadkie formy patologii, takie jak łagodna miopatia dziecięca i niektóre formy neuropatii wzrokowej Lebera, mogą być łagodne i podatne na regresję.

Podczas badań laboratoryjnych zwraca się uwagę na charakterystyczne objawy chorób mitochondrialnych:

• obecność kwasicy;
• podwyższone stężenie mleczanu i pirogronianu we krwi, zwiększenie wskaźnika mleczanowo-pirogronianowego powyżej 15, zwłaszcza wzrastające przy obciążeniu glukozą lub wysiłku fizycznym;
• hiperketonemia;
• hipoglikemia;
• hiperamonemia;
• zwiększone stężenie acetooctanu i 3-hydroksybutyratu;
• zwiększony stosunek kwasu 3-hydroksymasłowego do kwasu acetylooctowego we krwi;
• zwiększony poziom aminokwasów we krwi i moczu (alanina, glutamina, kwas glutaminowy, walina, leucyna, izoleucyna);
• podwyższony poziom kwasów tłuszczowych we krwi;
• nadmierne wydalanie kwasów organicznych z moczem;
• obniżony poziom karnityny we krwi;
• wzrost zawartości mioglobiny w płynach biologicznych;
• zmniejszona aktywność enzymów mitochondrialnych w miocytach i fibroblastach.

Wartość diagnostyczna tych wskaźników jest wyższa przy obciążeniu pokarmowym niż na czczo. W praktyce dobrze sprawdził się test diagnostyczny: oznaczanie mleczanu we krwi na tle obciążenia glukozą, co pozwala na wyraźniejsze wykrycie niewydolności łańcucha oddechowego przy dodatkowym obciążeniu glukozą.

Do diagnostyki laboratoryjnej dysfunkcji mitochondriów i jej specyficznych postaci nozologicznych nie wystarczą konwencjonalne, rutynowe biochemiczne metody badań; konieczne jest przeprowadzenie specjalnych testów. Szczególnie wygodnie jest analizować aktywność enzymów w biopsjach mięśni szkieletowych niż w innych tkankach. Możliwe jest określenie aktywności enzymów łańcucha oddechowego, zwłaszcza syntetazy cytrynianowej, dehydrogenazy bursztynianowej i oksydazy cytochromu C.

Dane z badań morfologicznych i genetyki molekularnej

Badania morfologiczne mają szczególne znaczenie w diagnostyce patologii mitochondrialnej. Ze względu na ich dużą wartość informacyjną często wymagane są biopsja tkanki mięśniowej i badanie histochemiczne uzyskanych biopsji. Ważne informacje można uzyskać, badając jednocześnie materiał za pomocą mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Jednym z ważnych markerów chorób mitochondrialnych jest zjawisko „poszarpanych” czerwonych włókien [zjawisko RRF (poszarpane czerwone włókna)], odkryte w 1963 r. Jest ono związane z powstawaniem genetycznie zmienionych nieprawidłowych mitochondriów wzdłuż krawędzi włókna mięśniowego z powodu proliferacji i ogniskowej akumulacji. Zjawisko to wykrywa się za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu specjalnego barwnika Gomoriego, ale w ostatnich latach w tym celu stosuje się różne markery mitochondrialne i różne metody immunologiczne.

Inne morfologiczne objawy patologii mitochondrialnej obejmują:

• gwałtowny wzrost wielkości mitochondriów;
• gromadzenie się glikogenu, lipidów i konglomeratów wapnia w podsarkolemmie;
• zmniejszona aktywność enzymów mitochondrialnych;
• zaburzony rozkład granulek aktywności enzymów dehydrogenazy bursztynianowej (SDH), oksydoreduktazy NADH, oksydazy cytochromu C itp.

U pacjentów z chorobami mitochondrialnymi mikroskopia świetlna tkanki mięśniowej może ujawnić niespecyficzne objawy morfologiczne: miejscową martwicę włókien mięśniowych, nagromadzenie mas sarkoplazmatycznych, obecność lizy podsarkolemmalnych obszarów sarkoplazmy, bazofilię sarkoplazmy, zwiększoną liczbę jąder mięśniowych, aktywację procesów regeneracyjnych itp.

Badanie roli zjawiska „postrzępionych” włókien czerwonych wykazało jego znaczenie dla diagnostyki takich stanów jak MELAS, MERRF, zespoły Kearnsa-Sayre’a, przewlekła postępująca oftalmoplegia i inne związane z mutacjami mtDNA. Zjawisko to może rozwinąć się w innych chorobach: dystrofii mięśniowej Duchenne’a, zapaleniu skórno-mięśniowym, dystrofii miotonicznej, przyjmowaniu leków (klofibrat) i innych stanach patologicznych. Tak więc, obok pierwotnych chorób mitochondrialnych, zjawisko RRF może towarzyszyć wtórnym dysfunkcjom mitochondrialnym.

Obecnie histochemiczne i mikroskopowe badanie tkanki mięśniowej w celu wykrycia oznak niewydolności mitochondrialnej stało się powszechne. W niektórych przypadkach pomagają one w diagnozie, zwłaszcza przy prawidłowym obrazie morfologicznym tkanki mięśniowej według danych z mikroskopii świetlnej.

Objawy mikroskopowe elektronowe - wykrywanie proliferacji mitochondriów, zaburzenia ich kształtu i wielkości, dezorganizacja i powiększenie grzebieni, gromadzenie się nieprawidłowych mitochondriów pod sarkolemmą, gromadzenie się lipidów i nieprawidłowych parakrystalicznych (głównie składających się z białek) lub osmofilowych wtrąceń zlokalizowanych pomiędzy błoną wewnętrzną i zewnętrzną lub wewnątrz grzebieni, skupiska kuliste, często zlokalizowane w macierzy (składającej się głównie z triglicerydów) itp.

U niektórych pacjentów można wykryć nieprawidłowości cytochemiczne w leukocytach.

Kompleks badań biochemicznych i morfologicznych uzupełniają nowoczesne metody diagnostyki molekularnej (wykrywanie mutacji jądrowych lub mitochondrialnych), które są wykonywane w wyspecjalizowanych laboratoriach diagnostyki DNA. W chorobach mitochondrialnych wykrywa się różnego rodzaju mutacje: mutacje punktowe, delecje, duplikacje, ilościowe anomalie DNA itp.

W przypadku braku mutacji w mtDNA i podejrzenia patologii mitochondriów wykonuje się badanie DNA jądrowego.

Kryteria diagnostyczne

Istnieją 2 grupy kryteriów diagnostycznych chorób mitochondrialnych. Główne kryteria diagnostyczne (pierwsza grupa).

• Kliniczny:
  • ustalone rozpoznania: MERRF, MELAS, NARP, MNGIE, zespoły Pearsona, neuropatia Lebera, choroba Leigha i Alpersa;
  • obecność 2 lub kombinacji następujących objawów:
    • uszkodzenie wielonarządowe, patognomoniczne dla chorób łańcucha oddechowego;
    • przebieg postępujący z epizodami zaostrzeń lub obecnością mutacji mitochondrialnych w rodzinie;
    • wykluczenie chorób metabolicznych i innych chorób poprzez przeprowadzenie odpowiednich badań.
• Histologiczne – wykrycie zjawiska RRF w ponad 2% tkanki mięśniowej.
• Enzymatyczny:
  • włókna cytochromu c oksydazy-ujemne;
  • obniżona aktywność enzymów kompleksu łańcucha oddechowego (<20% normy w tkance, <30% w komórkach lub kilku tkankach).
• Funkcjonalne – spadek syntezy ATP w fibroblastach o więcej niż 3 odchylenia standardowe.
• Genetyka molekularna - patogenetycznie istotne mutacje jądrowego DNA lub mtDNA.

Dodatkowe kryteria diagnostyczne (druga grupa).

• Kliniczne - niespecyficzne objawy występujące w chorobach łańcucha oddechowego (martwe urodzenie, obniżona aktywność ruchowa płodu, wczesna śmierć noworodka, zaburzenia ruchu, zaburzenia rozwojowe, zaburzenia napięcia mięśniowego w okresie noworodkowym).
• Histologiczne - niewielki odsetek zjawiska RRF, podsarkolemmalne nagromadzenie mitochondriów lub ich anomalie.
• Enzymatyczny – niska aktywność enzymów kompleksu oddechowego (w tkankach 20-30% normy, w komórkach lub liniach komórkowych 30-40%).
• Funkcjonalne – spadek syntezy ATP w fibroblastach o 2–3 odchylenia standardowe lub brak wzrostu fibroblastów w środowisku z galaktozą.
• Genetyka molekularna – wykrywanie mutacji w jądrowym lub mtDNA mogących mieć powiązanie z patogenezą.
• Metaboliczne – wykrycie jednego lub więcej metabolitów wskazujących na zaburzenie bioenergetyki komórkowej.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]