Wirus zapalenia wątroby typu A

Wirusowe zapalenie wątroby typu A jest chorobą zakaźną ludzi, charakteryzującą się przede wszystkim uszkodzeniem wątroby i klinicznie objawiającą się zatruciem i żółtaczką. Wirus zapalenia wątroby typu A został odkryty w 1973 roku przez S. Feinstone'a (i in.) metodą immunomikroskopii elektronowej i poprzez zarażanie małp - szympansów i marmozet. Istotą metody immunomikroskopii elektronowej jest to, że do przesączu kału pacjenta z zapaleniem wątroby typu A dodaje się swoiste przeciwciała (surowicę ozdrowieńców), a osad poddaje się mikroskopii elektronowej. Ze względu na interakcję wirusów ze swoistymi przeciwciałami ulegają one swoistej agregacji. W takim przypadku są łatwiejsze do wykrycia, a agregacja pod wpływem przeciwciał potwierdza swoistość patogenu. Odkrycie S. Feinstone'a zostało potwierdzone w eksperymentach na ochotnikach.

Wirus zapalenia wątroby typu A ma kształt kulisty, średnica wirionu wynosi 27 nm. Genom jest reprezentowany przez jednoniciowy dodatni RNA o mm 2,6 MD. Nie ma superkapsydu. Typ symetrii to sześcienny - dwudziestościan. Kapsyd ma 32 kapsomery, jest tworzony przez cztery polipeptydy (VP1-VP4). Ze względu na swoje właściwości wirus zapalenia wątroby typu A należy do rodzaju Heparnovirus, rodziny Picornaviridae. Pod względem antygenów wirus zapalenia wątroby typu A (HAV - hepatitis A virus) jest jednorodny. HAV dobrze rozmnaża się w organizmie szympansów, pawianów, pawianów płaszczowych i małp marmozet. Przez długi czas wirusa nie można było hodować. Dopiero w latach 80. udało się uzyskać hodowle komórkowe, w których rozmnaża się HAV. Początkowo w tym celu wykorzystywano ciągłe linie komórkowe pochodzące z nerki zarodka makaka rezusa (kultura FRhK-4), obecnie stosuje się ciągłą linię komórkową pochodzącą z komórek nerki małpy zielonej (kultura 4647).

Zgodnie z zaleceniami ekspertów WHO przyjęto następującą nomenklaturę markerów wirusa zapalenia wątroby typu A: wirus zapalenia wątroby typu A - przeciwciała HAV przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu A: anty-HAV IgM i anty-HAV IgG.

HAV to mała cząsteczka o średnicy 27-30 nm, o symetrii ikozaedrycznej i jednorodności. Elektronogram uzyskany metodą immunoagregacji ujawnia cząstki o dużej gęstości elektronowej z powierzchniowo położonymi, symetrycznie ułożonymi kapsomerami. Przy ujemnym kontrastowaniu w preparatach ujawniają się zarówno pełne, jak i puste cząstki. Nukleokapsyd HAV, w przeciwieństwie do nukleokapsydu grypy, nie ma powierzchniowych wypustek i błony. Ważne jest również, że wirion HAV nie ma struktury w kształcie serca.

Na podstawie właściwości fizykochemicznych wirus zapalenia wątroby typu A jest klasyfikowany jako należący do rodziny pikornawirusów, rodzaju enterowirusów o numerze seryjnym 72. Jednak ta taksonomia okazała się zbyt nietypowa i WHO uznała za możliwe zachowanie terminologii „wirus zapalenia wątroby typu A”.

Podobnie jak wszystkie wirusy z rodziny Picornaviridae, wirus zapalenia wątroby typu A zawiera kwas rybonukleinowy. Niektóre laboratoria wykazały możliwość klonowania genomu wirusa zapalenia wątroby typu A, co otwiera perspektywę uzyskania szczepionek.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Odporność na wirus zapalenia wątroby typu A

Wirus jest stosunkowo odporny na wysokie temperatury, kwasy, rozpuszczalniki tłuszczowe (bez lipidów), środki dezynfekujące i dobrze znosi niskie temperatury. Wszystko to przyczynia się do jego długotrwałego zachowania w środowisku zewnętrznym. W temperaturze pokojowej przeżywa kilka tygodni, w temperaturze 60 °C częściowo traci swoją zakaźność po 4-12 godzinach, a całkowicie - po kilku minutach w temperaturze 85 °C. Jest wysoce odporny na chlor, dzięki czemu jest w stanie przenikać do wody wodociągowej przez bariery urządzeń do uzdatniania wody.

Podsumowując wszystkie dane, możemy scharakteryzować wirus zapalenia wątroby typu A w następujący sposób:

• naturalnym gospodarzem jest człowiek;
• zwierzęta doświadczalne - marmozety, szympansy;
• źródłem zakażenia jest kał;
• choroba ma charakter epidemiczny i endemiczny;
• droga transmisji: feko-oralna;
• okres inkubacji - 14-40 dni;
• przejście w przewlekłe zapalenie wątroby - nie obserwowano.

Właściwości immunologiczne wirusa HAV są następujące:

• Szczepy prototypowe - Ms-1, CR-326, GВG. Wszystkie są immunologicznie podobne lub identyczne;
• Przeciwciała IgM i IgG powstają w odpowiedzi na wprowadzenie białek strukturalnych wirusa i pełnią funkcję ochronną;
• I. Działanie ochronne ludzkiej gamma-globuliny surowicy – zapobiega chorobie lub ją łagodzi, jeśli zostanie podana przed zakażeniem lub w okresie inkubacji.

Charakterystyka fizykochemiczna NAU jest następująca:

• Morfologia: cząstka kulista, pozbawiona skorupy, o symetrii sześciennej, kapsyd składa się z 32 kapsomerów;
• Średnica - 27-30 nm;
• Gęstość w CsCl (g/cm3) - 1,38-1,46 (cząstki otwarte), 1,33-1,34 (wirion dojrzały), 1,29-1,31 (wiriony niedojrzałe, cząstki puste);
• Współczynnik sedymentacji - 156-160 dojrzałych wirionów;
• Kwas nukleinowy jest jednoniciowym, liniowym RNA;
• Masa cząsteczkowa względna - 2,25 106-2,8 106KD;
• Liczba nukleotydów wynosi 6500-8100.

Stabilność wirusa HAV pod wpływem czynników fizycznych i chemicznych przedstawia się następująco:

• Chloroform, eter - stabilny;
• Chlor, 0,5-1,5 mg/l, 5 °C, 15 min - częściowa inaktywacja;
• Chloramina, 1 g/l, 20 °C, 15 min - całkowita inaktywacja;
• Formalina, 1:4000, 35-37 °C, 72 h - całkowita inaktywacja, 1:350, 20 °C, 60 min - częściowa inaktywacja.

Temperatura:

• 20-70 °C - stabilny;
• 56 °C, 30 min - stabilny;
• 60 °C, 12 h - częściowa inaktywacja;
• 85 °C, 1 min - całkowita inaktywacja;
• Autoklawowanie, 120 °C. 20 min - całkowita inaktywacja;
• Suche ciepło, 180 °C, 1 godzina - całkowita inaktywacja;
• UFO, 1,1 W, 1 min - całkowita inaktywacja.

Przedstawione dane pokazują, że pod względem właściwości fizykochemicznych wirus zapalenia wątroby typu A jest najbardziej zbliżony do enterowirusów. Podobnie jak inne enterowirusy, HAV jest odporny na wiele roztworów dezynfekujących i ulega całkowitej inaktywacji w ciągu kilku minut w temperaturze 85 °C i autoklawowaniu.

Udowodniono, że wirus zapalenia wątroby typu A może się rozmnażać w pierwotnych i ciągłych liniach monowarstwowych kultur komórek ludzkich i małpich. Szczególnie aktywną reprodukcję wirusa zapalenia wątroby typu A w kulturach in vitro obserwuje się, gdy jako materiał wyjściowy stosuje się wyciągi z wątroby chorych małp. Należy jednak zauważyć, że we wszystkich eksperymentach nad reprodukcją wirusa zapalenia wątroby typu A w kulturach in vitro zwraca się uwagę na długi okres inkubacji podczas pasaży pierwotnych (do 4-10 tygodni), następnie akumulacja materiału genetycznego wirusa wzrasta, ale wartości bezwzględne pozostają bardzo nieznaczne, co daje wielu badaczom podstawy do mówienia o niepełnej replikacji wirusa zapalenia wątroby typu A w kulturach tkankowych.

Podsumowując dane literaturowe dotyczące reprodukcji wirusa zapalenia wątroby typu A w hodowlach pozatkankowych, można stwierdzić, że fakt długotrwałego przeżycia HAV in vitro nie budzi wątpliwości. Optymalne warunki dla stabilnego, wysokiego poziomu replikacji wirusa nie zostały ostatecznie zidentyfikowane, co utrudnia badanie jego właściwości biologicznych, uzyskanie źródła odczynników do produkcji diagnostyki i projektowania szczepionek.

Jednocześnie w literaturze można znaleźć bardziej optymistyczne sądy na temat tego problemu. Rozwiązanie wszystkich kwestii związanych z hodowlą wirusa zapalenia wątroby typu A jest kwestią niedalekiej przyszłości. Badając optymalne warunki reprodukcji HAV w hodowli komórek embrionalnych nerek makaka rezusa, wyróżniono dwie fazy: fazę produkcji wirusa zakaźnego (do 6-8 dni na poziomie 5 pasażu) oraz fazę intensywnej akumulacji antygenu wirusowego. Wykazano również, że najbardziej znacząca akumulacja antygenu wirusowego zachodzi w warunkach tzw. hodowli rolkowej (rotating flask). Metoda ta otwiera szerokie możliwości uzyskania antygenu kulturowego w dużych ilościach, a w konsekwencji pojawi się materiał źródłowy do przygotowania systemów diagnostycznych i produkcji szczepionek.

Epidemiologia zapalenia wątroby typu A

Wirus zapalenia wątroby typu A jest wysoce patogenny dla ludzi. Według WHO (1987) do wywołania choroby wystarczy zakażenie jednym wirionem. Jednak praktyczna dawka zakaźna jest prawdopodobnie znacznie wyższa. Jedynym źródłem zakażenia jest osoba zakażona. Wirus jest wydalany w dużych ilościach z kałem na 12-14 dni przed wystąpieniem żółtaczki i w ciągu 3 tygodni okresu żółtaczkowego. Nie stwierdzono istotnych różnic w wydalaniu patogenu u pacjentów z żółtaczkową, żółtaczkową i bezobjawową postacią zapalenia wątroby typu A. Droga zakażenia jest fekalno-oralna, głównie drogą wodną, a także drogą domową i spożywczą. Droga zakażenia jest fekalno-oralna, głównie drogą wodną, a także drogą domową i spożywczą. Główną (pierwotną) drogą transmisji wirusa jest droga wodna. Możliwe jest również zakażenie drogą kropelkową. Podatność populacji jest powszechna. Najczęściej dotknięte są dzieci poniżej 14 roku życia. Choroba ma wyraźną sezonowość jesienno-zimową.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Objawy zapalenia wątroby typu A

Okres inkubacji waha się od 15 do 50 dni, w zależności od dawki zakaźnej wirusa, ale średnio wynosi 28-30 dni. Po dostaniu się do organizmu wirus zapalenia wątroby typu A namnaża się w regionalnych węzłach chłonnych, przenika do krwi, a następnie do komórek wątroby i powoduje ostre rozlane zapalenie wątroby, któremu towarzyszy uszkodzenie hepatocytów i elementów siateczkowo-śródbłonkowych wątroby oraz spadek jej funkcji detoksykacyjnych i barierowych. Uszkodzenie hepatocytów następuje nie na skutek bezpośredniego działania wirusa, ale w wyniku mechanizmów immunopatologicznych. Najbardziej typowym obrazem zapalenia wątroby typu A jest ostra żółtaczkowa postać cykliczna: okres inkubacji, okres prodromalny (przedżółtaczkowy), okres żółtaczkowy i rekonwalescencja. Jednak w ogniskach zakażenia wykrywa się dużą liczbę pacjentów z postaciami żółtaczkowymi i bezobjawowymi, których liczba znacznie przewyższa liczbę żółtaczkowych („zjawisko góry lodowej”).

Odporność po zakażeniu jest silna i długotrwała, dzięki obecności przeciwciał neutralizujących wirusa i komórek pamięci immunologicznej.

Diagnostyka mikrobiologiczna zapalenia wątroby typu A

Diagnostyka zapalenia wątroby typu A (oprócz zakażenia zwierząt - szympansów, marmozet, pawianów, których nie mamy) opiera się na różnych metodach immunologicznych: RSC, metoda immunofluorescencyjna, hemaglutynacja adhezji immunologicznej (kompleks antygen wirusowy + przeciwciało w obecności dopełniacza adsorbuje się na erytrocytach i powoduje ich sklejenie). Możliwości wykorzystania tych metod są jednak ograniczone ze względu na brak specyficznych antygenów wirusowych, a reakcja immunofluorescencyjna wymaga biopsji wątroby, co jest niepożądane. Metoda immunomikroskopii elektronowej jest niezawodna i specyficzna, ale bardzo pracochłonna. Dlatego też, jak dotąd, jedyną dopuszczalną reakcją immunologiczną jest metoda analizy immunosorbentowej fazy stałej w postaci IFM lub RIM, zwłaszcza w modyfikacji „wychwytu” immunoglobulin klasy M. W naszym kraju zaproponowano w tym celu system testowy - „DIAGN-A-HEP”. Zasada działania tego systemu testowego jest następująca. Najpierw przeciwciała przeciwko immunoglobulinom klasy M (antyimmunoglobuliny M) są sorbowane na ściankach studzienek polistyrenowych, następnie dodawana jest surowica pacjenta, która ma być badana. Jeśli zawiera ona przeciwciała IgM, to wiążą się one z przeciwciałami przeciwko przeciwciałom klasy M, następnie dodawany jest specyficzny antygen wirusowy (wirus zapalenia wątroby typu A), który uzyskuje się poprzez hodowlę w hodowli komórkowej. Układ jest płukany, a do niego dodawane są przeciwciała przeciwwirusowe znakowane peroksydazą chrzanową. Jeśli wszystkie cztery składniki układu wchodzą ze sobą w interakcję, powstaje czterowarstwowa „kanapka”:

• antyimmunoglobuliny M,
• immunoglobuliny M (przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu A - w surowicy badanego pacjenta),
• antygen wirusowy,
• przeciwciała przeciwwirusowe znakowane enzymem.

Aby wykryć ten kompleks, do studzienek dodaje się substrat dla enzymu. Pod wpływem enzymu ulega on zniszczeniu, a powstaje barwny produkt. Intensywność koloru można zmierzyć ilościowo za pomocą spektrofotometru lub fotokolorymetru.

Zaletą metody „wychwytywania” IgM jest to, że przeciwciała tej klasy immunoglobulin pojawiają się podczas pierwotnej odpowiedzi immunologicznej i wskazują na aktywną fazę zakażenia, znikają po przebyciu choroby. Przeciwciała przeciwwirusowe należące do klasy IgG natomiast utrzymują się przez długi czas po przebyciu choroby, zapewniając nabytą odporność. Do wykrywania wirusa zapalenia wątroby typu A zaproponowano metodę sondy DNA: jako sondę stosuje się komplementarne DNA vRNA.

Leczenie zapalenia wątroby typu A

Ponieważ w zapaleniu wątroby wywołanym wirusem dochodzi do zaburzenia produkcji interferonu, leczenie zapalenia wątroby typu A opiera się na stosowaniu interferonu i induktora jego endogennej syntezy – amiksyny.

Profilaktyka specyficzna zapalenia wątroby typu A

Wcześniej szeroko stosowana seroprofilaktyka zapalenia wątroby typu A z gamma-globuliną nie sprawdziła się, dlatego główny nacisk położono na prowadzenie profilaktyki szczepienia, przeprowadza się szczepienia przeciwko zapaleniu wątroby typu A. W tym celu opracowywane są różne rodzaje szczepionek, które są już stosowane. W Rosji skuteczną szczepionkę przeciwko zapaleniu wątroby typu A uzyskano już w 1995 roku i jest ona obecnie z powodzeniem stosowana.