Eksperymentalne modele choroby zwyrodnieniowej stawów

Chrząstka jest wysoce wyspecjalizowaną tkanką zawierającą tylko jeden rodzaj komórek (chondrocyty) i charakteryzującą się brakiem naczyń krwionośnych i limfatycznych. Chrząstka jest odżywiana głównie przez wchłanianie z płynu stawowego. Metabolizm chondrocytów jest regulowany przez szereg rozpuszczalnych czynników wytwarzanych lokalnie przez chondrocyty i otaczające tkanki. Funkcja chondrocytów zależy również od składu środowiska pozakomórkowego (napięcia tlenu, stężenia jonów, pH itp.), składu ECM, interakcji komórek i macierzy oraz sygnałów fizycznych. Głównym celem modelowania eksperymentalnego jest tworzenie kultur w środowisku pozakomórkowym bez zmiany fenotypu dojrzałych komórek. Drugim celem jest tworzenie kultur w celu zbadania przedwczesnej, opóźnionej, krótkotrwałej lub przedłużonej odpowiedzi chondrocytów na sygnały chemiczne i/lub fizyczne. Badania in vitro dają również możliwość zbadania zachowania chondrocytów w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Trzecim celem jest opracowanie systemów współhodowli, które umożliwiają badanie interakcji różnych tkanek w stawie. Czwartym zadaniem jest przygotowanie implantów chrząstki do późniejszego przeszczepu. I wreszcie piątym zadaniem jest badanie czynników wzrostu, cytokin lub środków terapeutycznych, które są zdolne do stymulowania naprawy i/lub hamowania resorpcji chrząstki.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci stworzono różne modele kultur komórek chrząstki stawowej, w tym kultury monowarstwowe, kultury zawieszone, kultury chondronów, eksplantaty, współkultury i kultury komórek nieśmiertelnych. Każda kultura ma swoje zalety i wady i każda nadaje się do badania jednego konkretnego aspektu metabolizmu chondrocytów. Tak więc eksplantaty chrząstki są doskonałym modelem do badania obrotu elementów macierzy, co wymaga prawdziwych receptorów powierzchniowych komórek i normalnych interakcji komórka-macierz i macierz-komórka. Jednocześnie zaleca się badanie depozytów macierzy lub mechanizmów regulujących metabolizm chondrocytów w hodowli izolowanych komórek. Do badania procesu różnicowania komórek niezbędna jest kultura monowarstwowa o niskiej gęstości. Kultury zawieszone w naturalnej lub syntetycznej macierzy są modelem do analizy adaptacyjnej odpowiedzi chondrocytów na stres mechaniczny.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Hodowle chondrocytów

Należy wziąć pod uwagę kilka ważnych punktów przy wyborze tkanki chrzęstnej do badań in vitro. Skład macierzy i aktywność metaboliczna chondrocytów różnią się w zależności od stawów, a ta ostatnia zależy również od głębokości umiejscowienia chondrocytów w tkance. Dane te uzyskano w kilku eksperymentach, w których badano izolowane subpopulacje chondrocytów z warstw chrząstki o różnej głębokości. Stwierdzono szereg różnic morfologicznych i biochemicznych między hodowanymi chondrocytami zlokalizowanymi w powierzchownych i głębokich warstwach chrząstki stawowej. Komórki powierzchniowe syntetyzują rzadką, ubogą w proteoglikany macierz włóknistą, podczas gdy komórki głębsze wytwarzają macierz bogatą we fibryle i proteoglikany. Ponadto komórki powierzchniowe wytwarzają stosunkowo więcej małych, niezagregowanych proteoglikanów i kwasu hialuronowego oraz stosunkowo mniej agrekanu i siarczanu keratanu niż głębsze chondrocyty. Inną ważną cechą charakterystyczną metabolizmu chondrocytów izolowanych z warstw chrząstki o różnej głębokości jest reakcja na bodziec zewnętrzny. Według M. Aydelotte i in. chondrocyty bydlęce pochodzące z powierzchniowej warstwy chrząstki były bardziej wrażliwe na IL-1 niż komórki ze strefy głębokiej.

Zachowanie komórek zależy również od lokalizacji tkanki. Chondrocyty z chrząstki żebrowej i usznej tego samego zwierzęcia reagują inaczej na czynniki wzrostu, takie jak czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) i TGF-beta. FGF zwiększył wbudowywanie tymidyny, proliny i leucyny do hodowanych chondrocytów żebrowych, ale nie usznych. TGF-beta zwiększył wbudowywanie tymidyny do chondrocytów chrząstki żebrowej i usznej, ale nie miał wpływu na wbudowywanie tymidyny i proliny do chondrocytów usznych. Komórki chrząstki z obszarów dużego naprężenia różnią się od komórek z obszarów małego naprężenia chrząstki. Tak więc chondrocyty dojrzałej chrząstki stawu kolanowego owcy z centralnego obszaru powierzchni stawowej kości piszczelowej niepokrytej łąkotką, która ponosi największe obciążenie in vivo, syntetyzują mniej agrekanu, ale więcej dekorinu niż komórki ze stref pokrytych łąkotką. Autorzy podkreślają również znaczenie wykorzystywania chrząstki pochodzącej z identycznych obszarów stawowych podczas badania syntetycznej funkcji stawów.

Metabolizm chondrocytów i ich reakcja na czynniki regulacyjne zależą również w znacznym stopniu od wieku dawcy, jego rozwoju szkieletowego i stanu stawów, z których pobrano komórki. W ludzkich chondrocytach obserwuje się znaczny spadek odpowiedzi proliferacyjnej wraz z wiekiem. Największy spadek obserwuje się u dawców w wieku 40-50 lat i powyżej 60 lat. Ponadto nasilenie odpowiedzi proliferacyjnej na czynniki wzrostu (np. FGF i TGF-beta) zmniejsza się wraz z wiekiem. Oprócz ilościowych zmian w proliferacji chondrocytów występują również zmiany jakościowe. Komórki od młodych dawców (10-20 lat) lepiej reagują na płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) niż na TGF-beta, podczas gdy w komórkach od dorosłych dawców obserwuje się odwrotną reakcję. Kilka mechanizmów jest wykorzystywanych do wyjaśnienia zależnych od wieku zmian w syntetycznej funkcji chondrocytów i ich reakcji na czynniki wzrostu. Należą do nich zmniejszenie liczby i powinowactwa receptorów komórek powierzchniowych, zmiany w syntezie i bioaktywności czynników wzrostu i cytokin oraz modyfikacja sygnałów postreceptorowych.

Stan patologiczny stawów zmienia również morfologię i aktywność metaboliczną chondrocytów. Tak więc J. Kouri i in. (1996) zidentyfikowali trzy subpopulacje chondrocytów w chrząstce w osteoartrozie. Chondrocyty z powierzchniowej i górnej części środkowej chrząstki tworzą skupiska i syntetyzują większą ilość proteoglikanów i kolagenu. TGF-beta i insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF) są w stanie stymulować syntezę proteoglikanów przez chondrocyty i częściowo neutralizować działanie IL-1 i TNF-a. Eksplanty chrząstki dotkniętej osteoartrozą i chondrocyty wyizolowane z chrząstki pacjenta z osteoartrozą są bardziej wrażliwe na stymulację TGF-beta niż chondrocyty zdrowej chrząstki. Te różnice są najprawdopodobniej związane ze zmianami fenotypowymi chondrocytów w górnych warstwach chrząstki stawowej.

Izolację pojedynczych chondrocytów uzyskuje się poprzez sekwencyjne traktowanie ECM enzymami proteolitycznymi. Po uwolnieniu z ECM wyizolowane komórki są idealne do badania de novo syntezy składników macierzy. Niektórzy autorzy stosują wyłącznie kolagenazę Clostridium, podczas gdy inni wstępnie inkubują chrząstkę z trypsyną, pronazą, DNAzą i/lub hialuronidazą. Liczba wyizolowanych komórek zależy od użytych enzymów. Tak więc, przy traktowaniu samą kolagenazą, można uzyskać 1,4-10 ⁶ chondrocytów z 1 g tkanki, podczas gdy przy użyciu pronazy, hialuronidazy i kolagenazy - 4,3-10 ⁶. Przy traktowaniu kolagenazą, agrekan, białka, IL-6 i IL-8 pozostają w hodowli komórkowej w znacznie większych ilościach niż przy sekwencyjnym traktowaniu różnymi enzymami. Istnieje kilka wyjaśnień tych różnic między dwiema hodowlami komórkowymi:

• Receptory komórkowe są uszkadzane lub hamowane przez enzymy, TGF-beta hamuje syntezę DNA i proteoglikanu w świeżo izolowanych chondrocytach (dzień 1), podczas gdy synteza DNA i proteoglikanu w chondrocytach hodowanych w monowarstwie (7 dni) jest stymulowana przez TGF-beta. Jednak przed rozpoczęciem eksperymentu wymagany jest odpowiedni okres na ponowną ekspresję tych składników błony.
• Egzogenne proteazy mogą zaburzyć interakcję komórka-macierz zależną od integryny. Rodzina integryny promuje przyłączanie chondrocytów do cząsteczek ECM (Shakibaei M. i in., 1997). To zakłócenie może wpływać na ekspresję genów macierzy.
• Pozostałości składników macierzy mogą regulować funkcję syntetyczną chondrocytów. Integryny są w stanie rozpoznawać produkty degradacji ECM, odgrywając w ten sposób ważną rolę w naprawie tkanek po działaniu enzymów proteolitycznych. T. Larsson i in. (1989) donieśli, że dodanie nienaruszonych lub pofragmentowanych proteoglikanów do hodowli komórkowej stymuluje syntezę białek i proteoglikanów. Jednak wysoki poziom kwasu hialuronowego powoduje znaczny spadek włączania siarczanów do syntezy proteoglikanów przez chondrocyty zarodka kurczęcia, dojrzałe chondrocyty świńskich i szczurzych komórek chrzęstniakomięsaka. Ponadto kwas hialuronowy jest inhibitorem uwalniania proteoglikanów z komórek nawet w obecności IL-1b, TNF-a, FGF, co wskazuje na przeciwdziałanie pierwszej aktywności biologicznej czynników wzrostu i cytokin. Dokładny mechanizm leżący u podstaw działania kwasu hialuronowego pozostaje niejasny; Wiadomo, że chondrocyty zawierają receptor kwasu hialuronowego związany z włóknami aktynowymi cytozolu. Wiązanie kwasu hialuronowego z jego receptorem stymuluje fosforylację białek. Zatem dane te wykazują modulację funkcji metabolicznej chondrocytów przez pofragmentowane lub natywne cząsteczki białek macierzy poprzez aktywację receptorów błony komórkowej.
• Szybka stymulacja syntezy białek macierzy przez chondrocyty przez enzymy może być konsekwencją zmian kształtu chondrocytów i/lub reorganizacji cytoszkieletu.
• Niektóre cytokiny (np. IL-8) i czynniki wzrostu (np. IGF-1, TGF-β) są sekwestrowane w ECM. Najbardziej znanym przykładem jest wiązanie TGF-β przez dekorynę, co powoduje zmniejszenie zdolności tego pierwszego do indukowania wzrostu komórek w komórkach jajnika chomika chińskiego. Odkrycie, że zawartość dekoryny w chrząstce wzrasta wraz z wiekiem, sugeruje zmniejszenie biodostępności TGF-β wraz z wiekiem. Czynniki wzrostu i cytokiny mogą być uwalniane z resztek macierzy podczas hodowli i następnie modulować funkcję chondrocytów.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Hodowla monowarstwowa chondrocytów

Zróżnicowany fenotyp chondrocytów charakteryzuje się przede wszystkim syntezą kolagenu typu II i tkankowo specyficznych proteoglikanów, a także niskim poziomem aktywności mitotycznej. Istnieją dowody na to, że przy przedłużonej hodowli komórek w monowarstwie, a także po kilku powtórzonych pasażach komórkowych, chondrocyty tracą swoje kuliste zarysy i przyjmują wydłużony, fibroblastyczny kształt. Przy takiej metaplazji fibroblastycznej funkcja syntetyczna komórek ulega również modyfikacji, charakteryzując się postępującym spadkiem syntezy kolagenów typu II, IX i XI oraz wzrostem syntezy kolagenów typu I, III i Y. Małe niezagregowane proteoglikany są syntetyzowane dzięki funkcjonalnemu agrekanowi. Synteza katepsyny B i L jest wyjątkowo niska w zróżnicowanych komórkach, ale wzrasta w procesie utraty różnicowania. Kolagenaza-1 jest ekspresowana w zróżnicowanych chondrocytach; w przypadku długotrwałej hodowli jego ekspresja spada, natomiast produkcja tkankowych inhibitorów metaloproteaz (TIMP) wzrasta.

Zróżnicowane chondrocyty ponownie ekspresują kolagen zróżnicowanego fenotypu po przeniesieniu z hodowli monowarstwowej do zawieszonej. Proces różnicowania jest prawdopodobnie związany z kształtem komórki. Ta właściwość jest regularnie wykorzystywana przez naukowców badających wadliwe przeszczepy z autologicznymi chondrocytami. Niewielką liczbę komórek uzyskanych z materiału biopsyjnego można rozszerzyć w hodowli monowarstwowej, a następnie ponownie wprowadzić do trójwymiarowej macierzy przed przeszczepem. Ponowna ekspresja określonego fenotypu przez odróżnicowane chondrocyty przeniesione do hodowli agarozowej może być stymulowana przez TGF-β, kompleks osseiny-hydroksyapatytu i kwas askorbinowy.

W odpowiedzi na czynniki wzrostu i cytokiny, chondrocyty są modyfikowane podczas procesu różnicowania. Odpowiedź komórkowa na cytokiny i czynniki wzrostu różni się między niezróżnicowanymi i zróżnicowanymi chondrocytami. IL-1 stymuluje proliferację fibroblastów, podczas gdy wzrost niezróżnicowanych chondrocytów jest hamowany przez IL-1. Synteza DNA jest stymulowana przez IGF-1 w wydłużonych, ale nie spłaszczonych chondrocytach. W zróżnicowanych chondrocytach stymulujące efekty IL-1beta i TNF-a na produkcję prokolagenazy są bardziej wyraźne niż w niezróżnicowanych chondrocytach.

Hodowla chondrocytów

Hodowla chondrocytów w zawiesinie w środowisku płynnym lub w naturalnej lub syntetycznej trójwymiarowej matrycy stabilizuje fenotyp chondrocytów. Komórki zachowują swój kulisty kształt i syntetyzują białka specyficzne dla tkanek. Zawieszona hodowla chondrocytów jest zwykle zalecana do badania tworzenia nowej macierzy okołokomórkowej. Hodowle chondrocytów w syntetycznych lub naturalnych polimerach absorbujących są stosowane do implantacji komórek do ubytków chrząstki w celu stymulacji regeneracji tkanki chrzęstnej stawu. Syntetyczne lub naturalne medium dla wszczepianych komórek musi spełniać szereg wymagań:

• implanty muszą mieć porowatą strukturę, aby umożliwić przyleganie i wzrost komórek,
• ani sam polimer, ani produkty jego degradacji nie powinny powodować stanów zapalnych ani reakcji toksycznych po wszczepieniu in vivo,
• nośnik przeszczepu musi mieć zdolność łączenia się z sąsiadującą chrząstką lub kością podchrzęstną,
• naturalna lub syntetyczna matryca musi mieć zdolność wchłaniania, jej degradacja musi być równoważona przez regenerację tkanek,
• aby ułatwić naprawę chrząstki, struktura chemiczna i architektura porów macierzy muszą ułatwiać utrzymanie fenotypu komórkowego i syntezę białek specyficznych dla tkanek przez umieszczone w niej chondrocyty,
• Podczas implantacji in vivo konieczne jest zbadanie właściwości mechanicznych matrycy syntetycznej lub naturalnej.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Zawiesina chondrocytów w fazie płynnej

Przyczepianiu się komórek do naczyń z tworzywa sztucznego, w których hodowane są chondrocyty, można zapobiec, pokrywając ich ściany roztworem metylocelulozy, agarozy, hydrożelu (poli-2-hydroksyetylometakrylanu) lub mieszaniną kolagenu i agarozy. W tych warunkach chondrocyty tworzą skupiska i syntetyzują głównie agrekan i kolageny specyficzne dla tkanek (typy II, IX, XI). Zazwyczaj występują dwa typy komórek. Komórki zlokalizowane w centrum zachowują kształt kulisty i są otoczone dobrze rozwiniętą ECM, co potwierdzają badania histochemiczne i ultrastrukturalne. Na obwodzie chondrocyty mają dyskoidalne zarysy i są otoczone rzadką ECM; niewiele wiadomo o cechach funkcjonalnych takich komórek.

Możliwe jest hodowanie chondrocytów na mikronośnikach utrzymywanych w zawiesinie; jako mikronośniki stosuje się kulki dekstranu (cytodex), kulki dekstranu pokryte kolagenem (cytodex III) i nieporowate mikrosfery kolagenu typu I (cellagen). W tych warunkach hodowli chondrocyty przyczepiają się do powierzchni mikronośnika, zachowują swój kulisty kształt i wytwarzają materiał przypominający macierz. Ponadto stosowanie cellagenów promuje proliferację chondrocytów i ponowną ekspresję normalnego fenotypu. Dlatego też hodowla chondrocytów na mikrosferach cellagen może być stosowana w celu przywrócenia fenotypu komórek przed przeszczepem.

Inną metodą hodowli zawiesiny chondrocytów w środowisku płynnym jest ich hodowla w postaci gęstych kulek składających się z komórek (0,5-1 * 10 ^b ), uzyskanych przez wirowanie. Takie chondrocyty są zdolne do produkcji macierzy zawierającej dużą ilość proteoglikanów, kolagenu typu II, ale nie kolagenu typu I, co potwierdzają metody histologiczne, immunohistochemiczne i ilościowe.

Zawieszenie chondrocytów w naturalnej ECM

Chondrocyty można hodować w zawiesinie w trójwymiarowej matrycy (miękki agar, agaroza, żel kolagenowy lub gąbka, kwas hialuronowy, klej fibrynowy, kulki alginianowe).

Chondrocyty hodowane w agarozie zachowują swój normalny fenotyp i syntetyzują kolagen typu II oraz tkankowo specyficzne agregaty agrekanów. W hodowli w agarozie proteoglikany syntetyzowane przez komórkę są uwalniane do podłoża przez 50 dni. Dla porównania, w hodowli monowarstwowej faza komórkowa jest przepełniona glikozaminoglikanami już w pierwszych 5-6 dniach hodowli; w hodowli w podłożu, po zwiększonej syntezie i uwalnianiu glikozaminoglikanów w pierwszych 8-10 dniach, następuje ich zależny od czasu spadek. Niemniej jednak zachowanie chondrocytów hodowanych w agarozie różni się od tego in vivo. W agarozie duża liczba syntetyzowanych agregatów agrekanów zawiera mniejsze cząsteczki i mniej cząsteczek niż in vivo. TGF-β stymuluje syntezę proteoglikanów w eksplantacie, ale zmniejsza syntezę agrekanów w agarozie.

Alginian jest liniowym polisacharydem otrzymywanym z brunatnych wodorostów. W obecności dwuwartościowych kationów, takich jak jony Ca2 ⁺, polimer ten staje się żelem. Każdy chondrocyt uwięziony w alginianie jest otoczony macierzą ujemnie naładowanych polisacharydów, których pory są porównywalne z porami w chrząstce szklistej. Macierz utworzona przez chondrocyty w kulkach alginianu składa się z dwóch przedziałów - cienkiej warstwy macierzy związanej z komórkami odpowiadającej macierzy okołokomórkowej i terytorialnej chrząstki stawowej oraz bardziej odległej macierzy odpowiadającej międzyterytorialnej w tkance rodzimej. W 30. dniu hodowli względna i bezwzględna objętość zajmowana przez komórki i każdy z dwóch przedziałów w kulce alginianu są prawie całkowicie identyczne z tymi w chrząstce rodzimej. Przez prawie 30 dni chondrocyty zachowują swój kulisty kształt i produkują agrekan, którego właściwości hydrodynamiczne są podobne do cząsteczek agrekanu w macierzy chrząstki stawowej, a także cząsteczek kolagenu typu II, IX i XI. Jednocześnie, podobnie jak w przypadku innych kultur zawiesinowych, na powierzchni kulek alginianu obecne są spłaszczone komórki, które produkują niewielką ilość cząsteczek kolagenu typu I, które są bezpośrednio uwalniane do medium i nie są włączane do ECM. W kulkach alginianu obserwuje się umiarkowaną proliferację chondrocytów. Po 8 miesiącach hodowli w żelu alginianowym dojrzałe chondrocyty nie tracą aktywności metabolicznej i kontynuują syntezę tkankowo specyficznego kolagenu typu II i agrekanu.

H. Tanaka i in. (1984) zbadali właściwości dyfuzyjne różnych naturalnych cząsteczek w alginianie i odkryli, że cząsteczki większe niż 70 kDa nie dyfundowały przez alginian. Zatem hodowla komórek w alginianie nadaje się do badania regulacji biosyntezy macierzy i organizacji ECM. Dostępność komórek hodowanych w alginianie pozwala na badanie działania czynników regulacyjnych peptydów i środków farmakologicznych na poziomie transkrypcyjnym, posttranskrypcyjnym i translacyjnym.

Chondrocyty hoduje się również w matrycy włókien kolagenowych typu I i II. S. Nehrer i in. (1997) porównali funkcjonowanie psich chondrocytów w porowatych matrycach polimerowych kolagenowo-proteoglikanowych zawierających kolageny różnych typów. Stwierdzili istotne różnice w morfologii funkcji biosyntetycznej chondrocytów hodowanych w matrycach kolagenowych zawierających kolagen typu I i II. Komórki w matrycy kolagenu typu II zachowały swój kulisty kształt, podczas gdy w kolagenie typu I miały morfologię podobną do fibroblastów. Ponadto w matrycy kolagenu typu II chondrocyty produkowały większą ilość glikozaminoglikanów. J. van Susante i in. (1995) porównali właściwości chondrocytów hodowanych w żelu alginianowym i kolagenowym (typu I). Autorzy stwierdzili znaczny wzrost liczby komórek w żelu kolagenowym, ale od 6 dnia hodowli komórki utraciły swój charakterystyczny fenotyp, przekształcając się w komórki podobne do fibroblastów. W żelu alginianowym zaobserwowano spadek liczby komórek, ale chondrocyty zachowały swój normalny fenotyp. W żelu kolagenowym liczba proteoglikanów na komórkę była istotnie wyższa niż w alginianie, ale w żelu zaobserwowano spadek syntezy elementów macierzy, począwszy od 6 dnia hodowli, podczas gdy w alginianie synteza nadal wzrastała.

Stała trójwymiarowa macierz fibrynowa jest naturalną substancją, która podtrzymuje zawieszone w niej chondrocyty w zróżnicowanym fenotypie. Trójwymiarowa macierz fibrynowa może być również stosowana jako nośnik w transplantacji chondrocytów. Zaletami fibryny są brak cytotoksyczności, zdolność do wypełniania przestrzeni i zdolność adhezyjna. Badania histologiczne i biochemiczne, autoradiografia i mikroskopia elektronowa wykazały, że chondrocyty w żelu fibrynowym zachowują swoją morfologię, proliferują i wytwarzają macierz nawet po 2 tygodniach hodowli. Jednak G. Homminga i in. (1993) podali, że rozpad fibryny rozpoczyna się po 3 dniach hodowli, a dedyferencjacja chondrocytów postępuje.

Zawiesina chondrocytów w sztucznej (syntetycznej) ECM

Implanty chrząstki do zabiegów rekonstrukcyjnych lub ortopedycznych można uzyskać poprzez hodowlę izolowanych chondrocytów in vitro w syntetycznej, biozgodnej matrycy.

Chondrocyty hodowane w kwasie poliglikolowym proliferują i zachowują prawidłową morfologię i fenotyp przez 8 tygodni. Kompleks chondrocytów i kwasu poliglikolowego składa się z komórek, glikozaminoglikanów, kolagenów i ma zewnętrzną otoczkę kolagenową. Jednak takie implanty zawierają dwa rodzaje cząsteczek kolagenu - I i II. Implanty z chondrocytów odróżnicowanych przez serię pasaży mają większą ilość glikozaminoglikanów i kolagenów niż implanty z pierwotnie niezróżnicowanych chondrocytów.

L. Freed i in. (1993b) porównali zachowanie kultur ludzkich i bydlęcych chondrocytów w włóknistym kwasie poliglikolowym (FPGA) i porowatym kwasie polimlekowym (PPLA). Po 6-8 tygodniach hodowli bydlęcych chondrocytów w FPGA lub PPLA autorzy zaobserwowali proliferację komórek i regenerację macierzy chrząstki. W FPGA chondrocyty miały kształt kulisty i były zlokalizowane w szczelinach otoczonych macierzą chrząstki. Po 8 tygodniach hodowli in vitro zregenerowana tkanka zawierała do 50% suchej masy (4% masy komórkowej, 15% glikozaminoglikanów i 31% kolagenów). W PPLA komórki miały kształt wrzecionowaty i niewielką ilość glikozaminoglikanów i kolagenu. W FPGA wzrost komórek był 2 razy intensywniejszy niż w PPLA. In vivo chondrocyty hodowane w VPGK i PPLC wytwarzały tkankę histologicznie podobną do chrząstki w ciągu 1-6 miesięcy. Implanty zawierały glikozaminoglikany, kolageny typu I i II.

Chondrocyty płodów bydlęcych hodowano w porowatym, hydrofobowym i hydrofilowym polietylenie o wysokiej gęstości. Po 7 dniach inkubacji w obu podłożach komórki zachowały kulisty kształt i zawierały głównie kolagen typu II. Po 21 dniach hodowli stwierdzono, że matryca hydrofilowa zawiera więcej kolagenu typu II niż matryca hydrofobowa.

Tkankę chrzęstną można również uzyskać poprzez hodowlę w monowarstwie na filtrach Millicell-CM. Wstępne pokrycie filtrów kolagenem jest konieczne do przyłączenia chondroityny. Badanie histologiczne hodowli wykazuje akumulację chondrocytów w ECM zawierającej proteoglikany i kolagen typu II. Kolagenu typu I nie wykryto w takiej hodowli. Chondrocyty w uzyskanej tkance chrzęstnej mają kształt kulisty, ale na powierzchni tkanki są nieco spłaszczone. Grubość nowo utworzonej tkanki zwiększała się z czasem i zależała od początkowej gęstości monowarstwy komórek. W optymalnych warunkach hodowli grubość tkanki chrzęstnej osiągnęła 110 μm, organizacja jej komórek i kolagenu w warstwy powierzchowne i głębokie jest podobna do chrząstki stawowej. ECM zawiera około 3 razy więcej kolagenu i proteoglikanów. Po 2 tygodniach hodowli zaobserwowano akumulację macierzy, co pozwoliło na wydobycie tkanki z filtra i wykorzystanie jej do przeszczepu.

Sims i in. (1996) badali hodowlę chondrocytów w żelu polietylenowym, otoczonej polimerowej matrycy, która umożliwia transfer dużej liczby komórek poprzez wstrzyknięcie. Sześć tygodni po wstrzyknięciu do tkanki podskórnej myszy bezgrasiczych utworzyła się nowa chrząstka, która morfologicznie charakteryzowała się białą opalescencją podobną do chrząstki szklistej. Dane histologiczne i biochemiczne wskazywały na obecność aktywnie proliferujących chondrocytów produkujących ECM.

Eksplantacja

Eksplantacja tkanki chrzęstnej służy do badania procesów ana- i katabolizmu w niej, utrzymania homeostazy, resorpcji i naprawy. Chondrocyty w eksplantatach chrząstki zachowują normalny fenotyp i skład ECM podobny do tych w chrząstce stawowej in vivo. Po 5 dniach hodowli w obecności surowicy osiąga się stały poziom syntezy i naturalnych procesów degradacji. Resorpcję tkanki można przyspieszyć w hodowli głównej i w hodowli z dodatkiem surowicy przy użyciu szeregu czynników, takich jak IL-IB, TNF-a, lipopolisacharydy bakteryjne, pochodne kwasu retinowego lub aktywne rodniki tlenowe. Aby zbadać naprawę chrząstki, jej uszkodzenie jest indukowane przez rozpuszczalne mediatory zapalne (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) lub fizyczne pęknięcie macierzy.

Metoda hodowli organotypowej jest modelem do badań in vitro wpływu izolowanych czynników zewnętrznych na chondrocyty i otaczającą macierz. In vivo chondrocyty są rzadko rozmieszczone w ECM i nie stykają się ze sobą. Hodowla eksplantatu chrząstki stawowej zachowuje tę organizację strukturalną, a także specyficzne interakcje między chondrocytami a otaczającym środowiskiem pozakomórkowym. Model ten jest również stosowany do badania wpływu stresu mechanicznego, środków farmakologicznych, czynników wzrostu, cytokin i hormonów na metabolizm chrząstki.

Inną zaletą eksplantacji tkanki chrzęstnej jest brak uszkodzeń chondrocytów pod wpływem enzymów proteolitycznych lub czynników mechanicznych, co jest nieuniknione podczas izolowania komórek. Receptory i inne białka błonowe oraz glikoproteiny są chronione przed czynnikami uszkadzającymi.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Kultura chondronowa

Chondron jest strukturalną, funkcjonalną i metaboliczną jednostką chrząstki stawowej składającą się z chondrocytu, jego macierzy okołokomórkowej i zwartej torebki włóknistej, odpowiedzialną za homeostazę macierzy. Chondrony są mechanicznie ekstrahowane z chrząstki i zbierane za pomocą kilku kolejnych homogenizacji wolnoobrotowych. Chondrony izolowane ze stref o różnej głębokości chrząstki można podzielić na cztery kategorie: pojedynczy chondron, sparowane chondrony, wiele (trzy lub więcej) liniowo ułożonych chondronów (kolumny chondronów) i skupiska chondronów.

Pojedyncze chondrony zazwyczaj znajdują się w środkowych warstwach nienaruszonej chrząstki, sparowane chondrony znajdują się na granicy środkowej i głębokiej warstwy, liniowo ułożone liczne chondrony są typowe dla głębokich warstw nienaruszonej chrząstki. Wreszcie, skupiska chondronów składają się z losowo zorganizowanych grup pojedynczych i sparowanych chondronów, które zachowują stan zagregowany po homogenizacji. Skupiska chondronów to duże fragmenty chrząstki, zwykle zawierające kilka chondronów i promieniowo ułożone włókienka kolagenowe, tj. typową organizację charakterystyczną dla głębokich warstw macierzy. Chondrony są unieruchomione w przezroczystej agarozie, co pozwala na badanie ich struktury, składu molekularnego i aktywności metabolicznej. Układ chondron-agaroza jest uważany za mikromodel chrząstki, który różni się od tradycyjnego układu chondrocyt-agaroza tym, że naturalne mikrośrodowisko jest zachowane i nie ma potrzeby jego syntezy i montażu. Hodowla chrząstki stanowi model umożliwiający badanie oddziaływań komórek i macierzy w chrząstce stawowej w warunkach prawidłowych i patologicznych.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Hodowla nieśmiertelnych chondrocytów

Rekombinowane DNA lub wirusy zawierające onkogeny, które są w stanie uczynić komórkę „nieśmiertelną”, są używane do tworzenia stałych linii komórkowych. Nieśmiertelne chondrocyty mają zdolność do niekończącej się proliferacji przy jednoczesnym zachowaniu stabilnego fenotypu. F. Mallein-Gerin i in. (1995) wykazali, że onkogen SV40T indukuje proliferację mysich chondrocytów, które nadal stabilnie wyrażają kolagen typu II, IX i XI, a także agrekan stawowy i białko wiążące. Jednak taka linia komórkowa nabywa zdolność do syntezy kolagenu typu I podczas hodowli w hodowli monowarstwowej lub w żelu agarozowym.

W. Horton i in. (1988) opisali linię nieśmiertelnych komórek z niskim poziomem ekspresji mRNA kolagenu typu II. Komórki te uzyskano poprzez transformację za pomocą retrowirusa myszy zawierającego I-myc- i y-ra-oncogeny. Ten typ komórek stanowi unikalny model do badania interakcji macierzy stawowej w nieobecności kolagenu typu II, a także regulacji syntezy kolagenu typu II.

Hodowla chondroprytów ze zmutowanymi lub usuniętymi genami jest wygodnym modelem do badania ich funkcji fizjologicznej. Model ten jest szczególnie odpowiedni do badania roli określonych cząsteczek w organizacji macierzy chrząstki lub do badania wpływu różnych czynników regulacyjnych na metabolizm chrząstki. Chondrocyty z usuniętym genem kolagenu typu IX syntetyzują fibryle kolagenowe, które są szersze niż normalnie, co wskazuje, że kolagen typu IX reguluje średnicę fibryli. Jak zauważono w rozdziale 1, mutacja w genie COLAI kodującym kolagen typu II została niedawno odkryta u rodzin z pierwotną uogólnioną chorobą zwyrodnieniową stawów. Aby zbadać wpływ zmutowanego kolagenu typu II na macierz stawową, R. Dharmrvaram i in. (1997) dokonali transfekcji (zainfekowania obcym kwasem nukleinowym) wadliwego COL ₂ AI (arginina w pozycji 519 jest zastąpiona cysteiną) do ludzkich chondrocytów płodowych in vitro.

System współhodowli. W stawie chrząstka wchodzi w interakcje z innymi typami komórek zawartymi w błonie maziowej, płynie stawowym, więzadłach i kości podchrzęstnej. Metabolizm chondrocytów może być modyfikowany przez różne rozpuszczalne czynniki syntetyzowane przez wymienione komórki. Tak więc w zapaleniu stawów chrząstka stawowa jest niszczona przez enzymy proteolityczne i wolne rodniki wytwarzane przez komórki błony maziowej. Dlatego opracowano modele do badania złożonych interakcji między chrząstką a otaczającymi ją tkankami, które są nazywane współhodowlami.

S. Lacombe-Gleise i in. (1995) hodowali chondrocyty i osteoblasty królika w systemie współhodowli (COSTAR), w którym komórki były rozdzielone mikroporowatą membraną (0,4 μm), co umożliwiało wymianę między dwoma typami komórek bez bezpośredniego kontaktu. Badanie to wykazało zdolność osteoblastów do stymulowania wzrostu chondrocytów za pośrednictwem rozpuszczalnych mediatorów.

AM Malfait i współautorzy (1994) badali związek między monocytami krwi obwodowej a chondrocytami. Model ten jest wygodny do badania procesów pośredniczonych przez cytokiny w artropatiach zapalnych (reumatoidalne zapalenie stawów, seronegatywne zapalenia stawów kręgosłupa itp.). Autorzy modelu oddzielili komórki błoną wiążącą białka o porach o średnicy 0,4 μm. Badanie wykazało, że monocyty stymulowane lipopolisacharydem wytwarzały IL-1 i TNF-a, które hamowały syntezę agrekanu przez chondrocyty i przyczyniały się do degradacji już zsyntetyzowanych agregatów agrekanu.

K. Tada i in. (1994) stworzyli model współhodowli, w którym komórki śródbłonka w żelu kolagenowym (typu I) umieszczono w komorze wewnętrznej oddzielonej od komory zewnętrznej z chondrocytami umieszczonymi w niej filtrem o wielkości porów 0,4 μm. W stanie całkowitej izolacji od komory zewnętrznej ludzkie komórki śródbłonka utworzyły rurki w żelu kolagenowym w obecności EGF lub TGF-a. Gdy oba typy komórek hodowano jednocześnie, zależne od TGF-a tworzenie rurek przez komórki śródbłonka zostało zahamowane. Hamowanie tego procesu przez chondrocyty zostało częściowo wyeliminowane przez przeciwciała anty-TGF-beta. Można założyć, że TGF-beta wytwarzany przez chondrocyty hamuje unaczynienie samej chrząstki.

S. Groot i in. (1994) hodowali jednocześnie chondrocyty ze stref hipertroficznej i proliferacyjnej kości 16-dniowego płodu myszy z fragmentami tkanki mózgowej. Po 4 dniach hodowli zaobserwowano transdyferencjację chondrocytów w osteoblasty i początek formowania osteoidów. Po 11 dniach hodowli część chrząstki została zastąpiona tkanką kostną, a macierz kostna uległa częściowemu zwapnieniu. Niektóre neuropeptydy i neuroprzekaźniki wytwarzane przez tkankę mózgową wpływają na metabolizm osteoblastów lub mają dla nich receptory. Należą do nich noradrenalina, wazoaktywny peptyd jelitowy, peptyd związany z genem kalcytoniny, substancja P i somatostatyna. Fragmenty tkanki mózgowej hodowane razem z chondrocytami mogą wytwarzać niektóre z wymienionych czynników zdolnych do indukowania procesu transdyferencjacji chondrocytów w osteoblasty.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Wpływ czynników zewnętrznych na hodowlę chondrocytów

Wpływ napięcia tlenu na metabolizm chondrocytów

W większości przypadków kultury chondrocytów rozwijają się w warunkach napięcia tlenu atmosferycznego. Wiadomo jednak, że chondrocyty in vivo istnieją w warunkach niedotlenienia, a napięcie tlenu zmienia się w zależności od różnych stanów patologicznych. Podczas procesu dojrzewania obserwuje się znaczące zmiany w ukrwieniu nasad kości. Ponieważ waskularyzacja zmienia się w różnych strefach płytki wzrostowej, napięcie tlenu w nich również się zmienia. C. Brighton i R. Heppenstall (1971) wykazali, że w płytce piszczelowej królików napięcie tlenu w strefie przerostowej jest niższe niż w otaczającej chrząstce. Pomiary niektórych parametrów metabolicznych wykazały, że chondrocyty są w stanie szybko reagować na lokalne zmiany stężenia tlenu. Przede wszystkim przy niskim napięciu tlenu jego zużycie przez chondrocyty maleje. Wraz ze spadkiem napięcia tlenu z 21 do 0,04% wzrasta wykorzystanie glukozy, wzrasta aktywność enzymów glikolitycznych i synteza kwasu mlekowego. Nawet przy niskim napięciu tlenu, bezwzględna ilość ATP, ADP i AMP pozostaje stabilna. Dane te wskazują, że metabolizm chondrocytów jest ukierunkowany na maksymalną oszczędność energii. Jednak aktywność syntetyczna, a zatem procesy naprawcze, zmieniają się w warunkach niedotlenienia.

Wysokie napięcie tlenu wpływa również na metabolizm chondrocytów, powodując spadek syntezy proteoglikanu i DNA oraz degradację macierzy chrząstki. Efekty te zwykle towarzyszą produkcji wolnych rodników tlenowych.

Wpływ stężenia jonów i ciśnienia osmotycznego środowiska na funkcję chondrocytów

W chrząstce natywnej stężenie jonów różni się znacząco od stężenia w innych tkankach: zawartość sodu w środowisku pozakomórkowym wynosi 250-350 mmol, a jego osmolarność 350-450 mosmol. Gdy chondrocyty są izolowane z ECM i inkubowane w standardowych mediach (DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium), osmolarność 250-280,7 mosmol), środowisko otaczające komórki zmienia się dramatycznie. Ponadto stężenie wapnia i potasu w standardowych mediach jest znacznie niższe niż w tkance natywnej, a stężenie anionów jest znacznie wyższe.

Dodanie sacharozy do medium zwiększa jego osmolarność i wywołuje przejściowy wewnątrzkomórkowy wzrost stężenia anionów H ⁺ i wapnia w cytozolu. Takie wewnątrzkomórkowe zmiany mogą wpływać na procesy różnicowania chondrocytów i ich aktywność metaboliczną. J. Urban i in. (1993) stwierdzili, że włączenie ³⁵ 8-siarczanu i ³ H-proliny przez izolowane chondrocyty inkubowane w standardowym DMEM przez 2-4 godziny stanowiło zaledwie 10% w porównaniu z tkanką natywną. Intensywność syntezy osiągnęła maksimum przy osmolarności medium pozakomórkowego wynoszącej 350-400 mosmol zarówno w świeżo izolowanych chondrocytach, jak i w eksplantatach tkanki chrzęstnej. Ponadto objętość chondrocytów wzrosła o 30-40% po umieszczeniu izolowanych komórek w standardowym DMEM o określonej osmolarności. Jednakże, gdy hoduje się chondrocyty w warunkach osmolarności niefizjologicznej przez 12-16 godzin, komórki przystosowują się do nowych warunków, zmniejszając intensywność biosyntezy proporcjonalnie do zmiany osmolarności środowiska pozakomórkowego.

P. Borgetti i in. (1995) badali wpływ osmolarności środowiska pozakomórkowego na wzrost, morfologię i biosyntezę chondrocytów świni. Autorzy wykazali podobne cechy biochemiczne i morfologiczne chondrocytów hodowanych w mediach o osmolarności 0,28 i 0,38 mosmol. Przy osmolarności medium 0,48 mosmol zaobserwowano spadek proliferacji komórek i syntezy białek w ciągu pierwszych 4-6 godzin hodowli, ale parametry te następnie powróciły do normy i ostatecznie osiągnęły wartości kontrolne. Gdy chondrocyty hodowano w medium o osmolarności 0,58 mosmol, komórki utraciły zdolność do utrzymania fizjologicznej intensywności procesów proliferacyjnych, a po 6 dniach liczba chondrocytów uległa znacznemu zmniejszeniu. Przy osmolarności medium 0,58 mosmol zaobserwowano głębokie zahamowanie syntezy białek. Ponadto, gdy hodowane są w mediach o osmolarności 0,28-0,38 mOsm, chondrocyty zachowują swój fizjologiczny fenotyp; przy wyższej osmolarności (0,48-0,58 mOsm) zachodzą istotne zmiany w morfologii komórek, co objawia się utratą charakterystycznego fenotypu, przekształceniem chondrocytów w komórki podobne do fibroblastów i utratą zdolności komórek do składania proteoglikanów macierzy. Wyniki tego badania wskazują na zdolność chondrocytów do reagowania na ograniczone wahania osmolarności środowiska pozakomórkowego.

Zmiany w stężeniu innych jonów mogą również wpływać na procesy biosyntezy w chondrocytach. Tak więc stopień wbudowania ³⁵ S (siarczanu) wzrasta o połowę wraz ze wzrostem stężenia jonów potasu z 5 mmol (stężenie w standardowym podłożu DM EM) do 10 mmol (stężenie w ECM in vivo). Stężenia wapnia poniżej 0,5 mmol promowały produkcję kolagenu przez dojrzałe chondrocyty bydlęce, podczas gdy stężenie 1-2 mmol (odpowiadające stężeniu w standardowym podłożu DM EM) powodowało znaczny spadek syntezy kolagenu. Umiarkowany wzrost biosyntezy obserwowano przy wysokich poziomach wapnia (2-10 mmol). Różne kationy uczestniczą w przyłączaniu chondrocytów do białek ECM. Tak więc jony magnezu i manganu zapewniają przyłączanie do fibroniektyny i kolagenu typu II, podczas gdy jony wapnia nie uczestniczą w przyłączaniu chondrocytów do białek. Wyniki opisanych badań wskazują zatem na wpływ zmian stężenia pozakomórkowych jonów potasu, sodu, wapnia oraz osmolarności podłoża na funkcję biosyntetyczną chondrocytów inkubowanych w standardowych podłożach.

Wpływ stresu mechanicznego na metabolizm chondrocytów

Unieruchomienie stawu powoduje odwracalny zanik chrząstki, co wskazuje na potrzebę bodźców mechanicznych dla normalnych procesów metabolicznych w ECM. W większości przypadków używane modele hodowli komórkowych istnieją w normalnym ciśnieniu atmosferycznym. M. Wright i in. (1996) wykazali, że środowisko mechaniczne wpływa na metabolizm chondrocytów, odpowiedź komórek zależy od intensywności i częstotliwości obciążenia ściskającego. Eksperymenty z obciążeniem na eksplantatach nienaruszonej chrząstki stawowej in vitro wykazały spadek syntezy białek i proteoglikanów pod wpływem obciążenia statycznego, podczas gdy obciążenie dynamiczne stymuluje te procesy. Dokładne mechanizmy wpływu obciążenia mechanicznego na chrząstkę są złożone i prawdopodobnie są związane z deformacją komórek, ciśnieniem hydrostatycznym, ciśnieniem osmotycznym, potencjałem elektrycznym i powierzchniowymi receptorami komórkowymi dla cząsteczek macierzy. Aby zbadać wpływ każdego z tych parametrów, konieczne jest stworzenie systemu, w którym jeden parametr może być zmieniany niezależnie. Na przykład kultura eksplantatu nie nadaje się do badania deformacji komórek, ale może być używana do badania ogólnego wpływu ciśnienia na aktywność metaboliczną chondrocytów. Kompresja chrząstki prowadzi do deformacji komórek i towarzyszy jej również pojawienie się gradientu ciśnienia hydrostatycznego, potencjału elektrycznego, przepływu płynu i zmian takich parametrów fizykochemicznych, jak zawartość wody w matrycy, gęstość ładunku elektrycznego i poziom ciśnienia osmotycznego. Deformację komórek można badać, używając izolowanych chondrocytów zanurzonych w żelu agarozowym lub kolagenowym.

Opracowano kilka systemów do badania wpływu stymulacji mechanicznej na hodowlę chondrocytów. Niektórzy badacze wykorzystują systemy, w których ciśnienie jest przykładane do hodowli komórkowej przez fazę gazową. Tak więc JP Veldhuijzen i in. (1979), stosując ciśnienie 13 kPa powyżej ciśnienia atmosferycznego z niską częstotliwością (0,3 Hz) przez 15 min, zaobserwowali wzrost syntezy cAMP i proteoglikanów oraz spadek syntezy DNA. R. Smith i in. (1996) wykazali, że okresowe narażenie hodowli pierwotnych chondrocytów bydlęcych na ciśnienie hydrostatyczne (10 MPa) z częstotliwością 1 Hz przez 4 h spowodowało wzrost syntezy agrekanu i kolagenu typu II, podczas gdy stałe ciśnienie nie miało wpływu na te procesy. Używając podobnego systemu, Wright i in. (1996) donieśli, że cykliczne ciśnienie na hodowlę komórkową jest związane z hiperpolaryzacją błony komórkowej chondrocytów i aktywacją kanałów potasowych zależnych od Ca2 ⁺. W ten sposób skutki ciśnienia cyklicznego są pośredniczone przez kanały jonowe aktywowane rozciąganiem w błonie chondrocytów. Odpowiedź chondrocytów na ciśnienie hydrostatyczne zależy od warunków hodowli komórkowej i częstotliwości stosowanego obciążenia. W ten sposób cykliczne ciśnienie hydrostatyczne (5 MPa) zmniejsza wbudowywanie siarczanów do monowarstwy chondrocytów przy częstotliwości 0,05, 0,25 i 0,5 Hz, podczas gdy przy częstotliwości większej niż 0,5 Hz wbudowywanie siarczanów do eksplantatu chrząstki wzrasta.

M. Bushmann i in. (1992) donieśli, że chondrocyty w żelach agarozowych zmieniają biosyntezę w odpowiedzi na statyczne i dynamiczne obciążenie mechaniczne w taki sam sposób, jak hodowany nienaruszony organ. Autorzy odkryli, że obciążenie mechaniczne generuje bodziec hiperosmotyczny z późniejszym spadkiem pH w chondrocytach.

Efekt rozciągania mechanicznego można badać na hodowli komórkowej zanurzonej w żelu. Siłę rozciągającą można wytworzyć za pomocą sterowanej komputerowo próżni. Gdy układ znajduje się pod pewnym stopniem próżni, dno szalki Petriego z hodowlą komórkową wydłuża się o znaną wartość, odkształcenie jest maksymalne na krawędziach dna szalki i minimalne w środku. Rozciągnięcie jest również przekazywane do chondrocytów hodowanych na szalce Petriego. Stosując tę metodę, K. Holm-vall i in. (1995) wykazali, że w komórkach chrzęstniakomięsaka hodowanych w żelu kolagenowym (typu II) wzrasta ekspresja mRNA 2-integryny _{. 2 β-integryna} jest _{w stanie} wiązać się z kolagenem typu II. Jest uważana za mechanoreceptor, ponieważ oddziałuje z białkami wiążącymi aktyny, łącząc w ten sposób ECM i cytoszkielet.

Wpływ pH na metabolizm chondrocytów

PH płynu śródmiąższowego ECM tkanki chrzęstnej jest bardziej kwaśne niż w innych tkankach. A. Maroudas (1980) określił pH macierzy chrząstki stawowej na 6,9. B. Diamant i in. (1966) stwierdzili pH 5,5 w warunkach patologicznych. Wiadomo, że chondrocyty żyją przy niskim PO2, co wskazuje na ważną rolę glikolizy (95% całego metabolizmu glukozy) w metabolizmie tych komórek; glikolizie towarzyszy produkcja dużej ilości kwasu mlekowego.

Oprócz zakwaszenia środowiska przez produkty glikolizy, same składniki macierzy mają duże znaczenie. Duża ilość stałego ładunku ujemnego na proteoglikanach modyfikuje pozakomórkowy skład jonowy: obserwuje się wysokie stężenie wolnych kationów (np. H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) i niskie stężenie anionów (np. O2, HCO3 ). Ponadto pod wpływem obciążenia mechanicznego woda jest wydalana z ECM, co prowadzi do wzrostu stężenia stałych ładunków ujemnych i przyciągania większej ilości kationów do macierzy. Towarzyszy temu spadek pH środowiska pozakomórkowego, co wpływa na pH wewnątrzkomórkowe, modyfikując w ten sposób metabolizm chondrocytów. R. Wilkin i A. Hall (1995) badali wpływ pH środowiska pozakomórkowego i wewnątrzkomórkowego na biosyntezę macierzy przez izolowane chondrocyty bydlęce. Zaobserwowali podwójną modyfikację syntezy macierzy wraz ze spadkiem pH. Nieznaczne obniżenie pH (7,435SO4 i ^3H proliny do chondrocytów, podczas gdy głębsze zakwaszenie środowiska (pH<7,1) zahamowało syntezę o 75% w porównaniu z kontrolą. Stworzenie niskiego pH (6,65) przy użyciu jonów amonowych spowodowało spadek syntezy macierzy tylko o 20%. Uzyskane wyniki wskazują, że modyfikacja pH środowiska pozakomórkowego syntezy macierzy nie może być wyjaśniona wyłącznie przez zmiany pH środowiska wewnątrzkomórkowego. Ponadto chondrocyty mają zdolność do regulacji pH wewnątrzkomórkowego za pomocą wymiennika Na ⁺, H ⁺, zależnego od Ka ⁺ transportera Cl ^_ -НСОС3 i H ⁺ /ATPazy.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

Wpływ składu podłoża hodowlanego na metabolizm chondrocytów

Medium do hodowli chondrocytów musi odpowiadać warunkom eksperymentalnym. W ostatnich latach do optymalizacji warunków hodowli stosowano surowicę cielęcą. Jednak przy stosowaniu surowicy należy wziąć pod uwagę szereg ważnych punktów:

• wzrost komórek na zewnątrz z obwodu tkanki w hodowlach narządów,
• zmienność składu serum różnych serii,
• obecność w nich nieznanych składników,
• zwiększone ryzyko zakłóceń i artefaktów przy badaniu wpływu różnych czynników biologicznych na aktywność metaboliczną komórek.

Przykładem tego ostatniego jest badanie wpływu EGF na chondrocyty chrząstki u szczurów. EGF stymulował włączanie ³ H-tymidyny i wzrost zawartości DNA w hodowli. Efekt ten był bardziej wyraźny przy niskich stężeniach w surowicy (<1%), ale przy wysokich stężeniach (>7,5%) efekt zanikał.

Dobrze wiadomo, że poziomy syntezy i degradacji w DMEM uzupełnionym surowicą cielęcą są znacznie zwiększone w porównaniu z warunkami in vivo. Różnice między metabolizmem in vivo i in vitro mogą wynikać z różnic między płynem stawowym a podłożem, w którym hodowane są komórki. Lee i in. (1997) hodowali młode chondrocyty bydlęce w agarozie, używając podłoża odżywczego zawierającego DMEM uzupełnionego 20% surowicą cielęcą i dużą ilością normalnego allogenicznego płynu stawowego. Obecność płynu stawowego w podłożu wywołała wzrost ilości proteoglikanów, do 80% całkowitej ilości płynu stawowego. Wyniki te wskazują, że płyn stawowy w hodowli wywołuje poziom metabolizmu podobny do tego in vivo, z wysokim poziomem syntezy glikozaminoglikanów i niskim poziomem podziału komórek.

G. Verbruggen i in. (1995) wykazali, że synteza ³⁵ S-arrpeKaHa przez ludzkie chondrocyty hodowane w agarozie w DMEM bez surowicy stanowiła 20-30% poziomu syntezy obserwowanego w DMEM uzupełnionym 10% surowicy cielęcej. Autorzy określili, w jakim stopniu IGF-1, IGF-2, TGF-R lub insulina przywróciły produkcję agrekanu w medium bez surowicy. Autorzy doszli do wniosku, że 100 ng/ml insuliny, IGF-1 lub IGF-2 częściowo przywróciło syntezę agrekanu do 39-53% poziomu kontrolnego. Nie zaobserwowano synergii ani kumulacji przy połączeniu wymienionych czynników. Jednocześnie 10 ng/ml TGF-R w obecności 100 ng/ml insuliny stymulowało syntezę agrekanu do 90% lub więcej poziomu referencyjnego. Wreszcie, transferyna surowicy ludzkiej, sama lub w połączeniu z insuliną, nie wpłynęła na syntezę agrekanu. Gdy surowicę cielęcą zastąpiono albuminą surowicy bydlęcej, zawartość agregatów agrekanu znacznie spadła. Wzbogacenie podłoża hodowlanego insuliną, IGF lub TGF-R częściowo przywróciło zdolność komórek do wytwarzania agregatów agrekanu. Ponadto IGF-1 i insulina są w stanie utrzymać homeostazę w hodowlach komórkowych. Po 40 dniach hodowli w podłożu wzbogaconym o 10-20 ng/ml IGF-1, synteza proteoglikanów utrzymywała się na tym samym poziomie lub nawet wyższym w porównaniu do podłoża zawierającego 20% surowicy cielęcej. Procesy kataboliczne przebiegały wolniej w podłożu wzbogaconym o IGF-1 niż w podłożu wzbogaconym o 0,1% roztwór albuminy, ale nieco szybciej w podłożu wzbogaconym o 20% surowicy. W długowiecznych hodowlach 20 ng/ml IGF-1 utrzymuje stabilny stan komórek.

D. Lee i in. (1993) porównali wpływ składu podłoża hodowlanego (DMEM, DMEM + 20% surowicy cielęcej, DMEM + 20 ng/ml IGF-1) na syntezę DNA w hodowli eksplantatu tkanki chrzęstnej, hodowli monowarstwowej i w zawiesinie agarozowej. Podczas hodowli w agarozie w obecności surowicy autorzy zaobserwowali tendencję chondrocytów do grupowania się w duże skupiska. Komórki hodowane bez surowicy lub z IGF-1 zachowały okrągły kształt w agarozie, zebrane w małe grupy, ale nie tworzyły dużych agregatów. W monowarstwie synteza DNA była istotnie wyższa w podłożu zawierającym surowicę niż w podłożu wzbogaconym IGF-1; synteza DNA w tym ostatnim była istotnie wyższa niż w podłożu niewzbogaconym. Nie stwierdzono różnic w syntezie DNA, gdy chondrocyty hodowano w zawiesinie agarozowej w podłożu niewzbogaconym i w podłożu z IGF-1. Jednocześnie hodowla zawiesin chondrocytów w agarozie w podłożu wzbogaconym surowicą wiązała się ze zwiększonym wbudowywaniem radionukleotydu ³ H-tymidyny w porównaniu z innymi podłożami.

Witamina C jest niezbędna do aktywacji enzymów biorących udział w tworzeniu stabilnej helisy włókienek kolagenowych. Chondrocyty z niedoborem kwasu askorbinowego syntetyzują niedohydroksylowane niehelisy prekursorów kolagenu, które są wydzielane powoli. Podanie kwasu askorbinowego (50 μg/ml) powoduje hydroksylację kolagenów typu II i IX oraz ich wydzielanie w normalnych ilościach. Dodanie witaminy C nie wpłynęło na poziom syntezy proteoglikanów. Dlatego wydzielanie kolagenu jest regulowane niezależnie od wydzielania proteoglikanów.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]