Eksperymentalne modele choroby zwyrodnieniowej stawów

Chrząstka jest wysoce wyspecjalizowaną tkanką zawierającą tylko jeden typ komórek (chondrocytów), charakteryzującą się brakiem naczyń krwionośnych i limfatycznych. Odżywianie chrząstki odbywa się głównie poprzez absorpcję z płynu maziowego. Metabolizm chondro-cytów jest regulowany przez wiele rozpuszczalnych czynników wytwarzanych lokalnie przez chondrocyty i otaczające tkanki. Funkcja chondrocytów zależy również od składu środowiska zewnątrzkomórkowego (napięcie tlenu, stężenie jonów, pH itp.), Składu VCM, interakcji komórka-matryca, sygnałów fizycznych. Głównym zadaniem modelowania eksperymentalnego jest tworzenie kultur w środowisku zewnątrzkomórkowym bez zmiany fenotypu dojrzałych komórek. Drugim zadaniem jest stworzenie kultur do badania przedwczesnej, opóźnionej, krótko- lub długoterminowej odpowiedzi chondrocytów na sygnały chemiczne i / lub fizyczne. Badania in vitro również okazją do zbadania zachowania chondrocytów w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Trzecie zadanie polega na opracowaniu wspólnie działających systemów, które umożliwiają badanie interakcji różnych tkanek w stawie. Czwartym zadaniem jest przygotowanie implantów chrzęstnych do późniejszego przeszczepienia. Wreszcie, piątym zadaniem jest zbadanie czynników wzrostu, cytokin lub środków terapeutycznych, które są zdolne do stymulacji naprawy i / lub hamowania resorpcji chrząstki.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano różne modele hodowli komórek chrząstki stawowej, w tym hodowle monowarstwowe, hodowle zawiesinowe, hodowle chondronowe, eksplanty, współhodowle, nieśmiertelne hodowle komórkowe. Każda kultura ma swoje zalety i wady, a każda z nich jest odpowiednia do badania jednego konkretnego aspektu metabolizmu chondrocytów. Tak więc, chrząstkowe eksplanty są doskonałym modelem do badania obrotu elementów macierzy, co wymaga autentycznych receptorów na powierzchni komórki i normalnych oddziaływań między komórkami macierzowymi i matrycowo-komórkowymi. Jednocześnie zaleca się badanie osadów w macierzy lub mechanizmów regulacji metabolizmu chondrocytów w hodowli izolowanych komórek. Jednowarstwowa kultura o niskiej gęstości jest niezbędna do badania procesu różnicowania komórek. Hodowle zawieszone w naturalnej lub syntetycznej matrycy są modelem do analizy odpowiedzi adaptacyjnej chondrocytów na naprężenia mechaniczne.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]

Hodowle chondrocytów

Wybierając tkankę chrzęstną do badań in vitro, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych punktów. Skład macierzy i aktywność metaboliczna chondrocytów różnią się w różnych stawach, a drugi zależy również od głębokości chondrocytów w tkance. Dane te uzyskano w kilku eksperymentach, w których badano izolowane subpopulacje chondrocytów ze stref chrząstki o różnych głębokościach. Stwierdzono szereg różnic morfologicznych i biochemicznych między hodowanymi chondrocytami zlokalizowanymi w powierzchni i głębokimi warstwami chrząstki stawowej. Komórki powierzchniowe syntetyzują rzadką, zubożoną fibrylarną matrycę proteoglikanu, podczas gdy głębsze komórki wytwarzają matrycę bogatą w fibryle i proteoglikany. Co więcej, komórki powierzchniowe wytwarzają względnie więcej małych niezagregowanych proteoglikanów i kwasu hialuronowego oraz względnie mniej agrekanu i siarczanu keratanu niż głębiej położone chondrocyty. Inną ważną cechą odróżniającą metabolizm chondrocytów izolowanych ze stref chrząstki o różnej głębokości jest odpowiedź na bodziec egzogenny. Według M. Aydelotte'a i współautorów, chondrocyty byka ze strefy powierzchniowej chrząstki były bardziej wrażliwe na IL-1 niż komórki strefy głębokiej.

Zachowanie komórek zależy również od umiejscowienia tkanki. Chondrocytów z chrząstki ucha i krawędzie, z tych samych zwierząt, które reagują w inny sposób na działanie czynników wzrostu, takich jak czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) i TGF-beta. FGF zwiększona tymidyny, prolinę i leucyny do hodowli chondrocytów żebra, ale nie ucha. TGF-P zwiększone wbudowywanie tymidyny do chondrocytów z chrząstki żebra ucha, ale nie miał żadnego wpływu na tymidyny do komórek chrzęstnych i proliny ucha. Komórki chrząstki uzyskane ze stref o największym obciążeniu różnią się od komórek z miejsc o małym obciążeniu chrząstki. Na przykład, dojrzałych chondrocytów z chrząstki stawu kolanowego od centralnego obszaru owce powierzchni stawowej kości piszczelowej nieobjęte łąkotki, która prowadzi do największego obciążenia w warunkach in vivo, mniejsze syntetyzowany agrekanu, dekorinu ale większe niż komórki w obszarach objętych menisku. Autorzy podkreślają również znaczenie stosowania chrząstki z identycznych stref stawowych podczas badania syntetycznej funkcji stawów.

Metabolizm chondrocytów i ich reakcja na czynniki regulatorowe również znacząco zależy od wieku dawcy, rozwoju jego szkieletu i stanu stawów, z których pobrano komórki. W ludzkich chondrocytach obserwuje się znaczny spadek wraz z wiekiem odpowiedzi proliferacyjnej. Największy spadek obserwuje się u dawców w wieku 40-50 lat i powyżej 60 lat. Co więcej, nasilenie odpowiedzi proliferacyjnej na czynniki wzrostu (np. FGF i TGF-beta) zmniejsza się podczas starzenia. Oprócz zmian ilościowych w proliferacji chondrocytów, istnieją również zmiany jakościowe. Młode komórki dawcy (w wieku 10-20 lat) lepiej odpowiadają na czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF) niż na TGF-beta, podczas gdy w komórkach dawcy dorosłego obserwuje się odwrotną sytuację. Aby wyjaśnić zależne od wieku zmiany w syntetycznej funkcji chondrocytów i ich odpowiedzi na działanie czynników wzrostu, stosuje się kilka mechanizmów. Wśród nich spadek liczby i powinowactwa powierzchniowych receptorów komórkowych, zmiana w syntezie i bioaktywności czynników wzrostu i cytokin, modyfikacja sygnałów postrecepcyjnych.

Stan patologiczny stawów również zmienia morfologię i aktywność metaboliczną chondrocytów. Tak więc J. Kouri i współautorzy (1996) zidentyfikowali trzy subpopulacje chondrocytów w chrząstce z chorobą zwyrodnieniową stawów. Chondrocyty z powierzchniowej i górnej połowy chrząstki tworzą skupiska i syntetyzują więcej proteoglikanów i kolagenu. TGF-beta i insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF) są w stanie stymulować syntezę proteoglikanów przez chondrocyty i częściowo neutralizować działanie IL-1 i TNF-a. Chrząstki eksplantaty dotknięty chorobą zwyrodnieniową stawów i chondrocyty izolowane z chrząstki u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów, są bardziej wrażliwe na bodźce TGF-beta niż zdrowe chondrocytów chrząstki. Różnice te są najprawdopodobniej związane ze zmianami fenotypowymi w chondrocytach w górnych warstwach chrząstki stawowej.

Izolację poszczególnych chondrocytów osiąga się przez sekwencyjne traktowanie enzymami proteolitycznymi ECM. Po ich uwolnieniu z ECM wyizolowane komórki idealnie nadają się do badania syntezy składników macierzy de novo. Niektórzy autorzy używają tylko kolagenazy Clostridium, inni preinkubują chrząstkę z trypsyną, pronazą, DNazą i / lub hialuronidazą. Liczba izolowanych komórek zależy od zastosowanych enzymów. Tak więc, w trakcie przetwarzania jeden z 1 g tkanki kolagenazy można uzyskać 1,4T0 ⁶ chondrocyty, podczas gdy przy użyciu pronazy hialuronidazy i kolagenazy - 4,3-10 ⁶. Podczas przetwarzania za pomocą kolagenazy, agrekan, białka, IL-6, IL-8 pozostają w hodowli komórkowej znacznie bardziej niż w przypadku sekwencyjnego traktowania różnymi enzymami. Istnieje kilka wyjaśnień tych różnic między dwiema kulturami komórkowymi:

• Receptory komórkowe uszkodzone lub depresji w wyniku działania enzymów, TGF-beta hamuje syntezę DNA proteoglikanów w świeżo wyizolowanych komórek chrzęstnych (dzień 1), podczas gdy DNA i proteoglikanów syntezy chondrocytów hodowanych w pojedynczej warstwie (7 dni) stymulowane przez TGF-beta. Jednakże, aby ponownie przeprowadzić ekspresję tych składników błony, wymagany jest odpowiedni okres przed rozpoczęciem eksperymentu.
• Egzogenne proteazy mogą rozrywać interakcje między komórkami i matrycą, w której pośredniczą integryny. Rodzina integryny promuje przyłączanie chondrocytów do cząsteczek VKM (Shakibaei M. I wsp., 1997) .Pęknięcie to może wpływać na ekspresję genów macierzy.
• Resztki składników matrycy mogą regulować funkcję syntetyczną chondrocytów. Integryny są w stanie rozpoznać produkty degradacji ECM, odgrywając w ten sposób ważną rolę w naprawie tkanek po ekspozycji na enzymy proteolityczne. T. Larsson i współautorzy (1989) donoszą, że dodanie nienaruszonych lub fragmentarycznych pro-theoglikanów do hodowli komórkowej stymuluje syntezę białek i proteoglikanów. Jednakże wysokie stężenie kwasu hialuronowego powoduje znaczne zmniejszenie włączeniem syntezy proteoglikanów siarczanu chondrocytów przez chondrocyty zarodków kurczaka dojrzałe komórki świńskie, a chrzęstniakomięsaka szczura. Ponadto, kwas hialuronowy - inhibitor proteoglikanów uwalnianiem się z komórek, nawet w obecności IL-lb, TNF-a, FGF, co wskazuje, że pierwszy przeciwdziałania biologiczną aktywność czynników wzrostowych i cytokin. Dokładny mechanizm leżący u podstaw działania kwasu hialuronowego pozostaje niejasny; Wiadomo, że chondrocyty zawierają receptor kwasu hialuronowego, związany z filamentami aktynowymi cytosolu. Wiązanie kwasu hialuronowego z jego receptorem stymuluje fosforylację białek. Tak więc, dane te demonstrują modulację funkcji metabolicznej chondrocytów przez fragmentację lub natywne cząsteczki białek macierzy przez aktywację komórek receptorów błonowych.
• Szybka stymulacja przez enzymy syntezy białek macierzy przez chondrocyty może być konsekwencją zmiany kształtu chondrocytów i / lub reorganizacji cytoszkieletu.
• Niektóre cytokiny (np. IL-8) i czynniki wzrostu (np. IGF-1, TGF-P) są utrwalone w ECM. Najbardziej znanym przykładem jest wiązanie TGF-beta z decorem, co prowadzi do zmniejszenia zdolności pierwszego do indukowania wzrostu komórkowego w komórkach jajnika u chomików chińskich. Dane, że zawartość dekoracji chrząstki wzrasta wraz z wiekiem, wskazują na spadek biodostępności TGF-beta w procesie starzenia. Czynniki wzrostu i cytokiny mogą być uwalniane z pozostałości matryc podczas hodowli, a następnie modulować funkcję chondrocytów.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]

Monowarstwowa kultura chondrocytów

Zróżnicowany fenotyp chondrocytów charakteryzuje się przede wszystkim syntezą kolagenu typu II i proteoglikanów tkankowych, a także niskim poziomem aktywności mitotycznej. Istnieją dowody na to, że długoterminowej hodowli komórek w jednej warstwie i po kilku powtarzających się fragmentów komórek chondrocytów tracą kształt kulisty, stają się wydłużone, fibroblastów podobny kształt. Przy takim fibroblastów metaplazja funkcję syntetyczną również zmodyfikowane komórki, charakteryzuje się postępującym spadkiem syntezy kolagenu II, IX i XI i typy ulepszone syntezę kolagenu I, III i Utipov. Małe niezgregowane proteoglikany syntetyzuje się za pomocą funkcjonalnego agrekanu. Synthetzepepsyna B i L jest niezwykle niska w zróżnicowanych komórkach, ale w procesie utraty różnicowania wzrasta. Kolagenaza-1 ulega ekspresji w zróżnicowanych chondrocytach, z przedłużoną hodowlą, jej ekspresja maleje, podczas gdy wzrasta wytwarzanie tkankowych inhibitorów metaloproteaz (TIMP).

Zróżnicowane chondrocyty ponownie eksprymują kolagen zróżnicowanego fenotypu, gdy są przenoszone z hodowli monowarstwowej do zawieszonej. Proces różnicowania jest prawdopodobnie związany z kształtem komórek. Właściwość ta jest regularnie wykorzystywana przez naukowców, którzy badają uszkodzone przeszczepy za pomocą autologicznych chondrocytów. Niewielką liczbę komórek uzyskanych z materiału z biopsji można pomnożyć w hodowli monowarstwowej, a następnie ponownie umieścić w trójwymiarowej matrycy przed przeszczepieniem. Ponowną ekspresję określonego fenotypu przez odróżnicowane chondrocyty przeniesione do hodowli agarozowej można stymulować za pomocą TGF-p, kompleksu hydroksyapatytu osseiny i kwasu askorbinowego.

W odpowiedzi na działanie czynników wzrostu i cytokin, chondrocyty są modyfikowane podczas procesu różnicowania. Komórkowa odpowiedź na cytokiny i czynniki wzrostu różni się między niezróżnicowanymi i zróżnicowanymi chondrocytami. IL-1 stymuluje proliferację fibroblastów, podczas gdy wzrost niezróżnicowanych chondrocytów jest hamowany przez IL-1. Synteza DNA jest stymulowana przez IGF-1 w wydłużonych, ale nie spłaszczonych chondrocytach. W zróżnicowanych chondrocytach stymulujące działanie IL-1β i TNF-α na produkty prokolagenazy są bardziej wyraźne niż w niezróżnicowanych.

Hodowanie chondrocytów

Hodowanie chondrocytów w zawiesinie w ciekłym ośrodku lub w naturalnej lub syntetycznej trójwymiarowej matrycy stabilizuje fenotyp chondrocytów. Komórki zachowują sferyczny kształt, syntetyzują białka specyficzne tkankowo. Ważona hodowla chondrocytów jest zwykle zalecana do badania tworzenia nowej macierzy okołokomórkowej. Hodowle chondrocytów w syntetycznych lub naturalnych polimerach chłonnych stosuje się do wszczepiania komórek w defekty chrząstki w celu stymulacji regeneracji tkanki chrzęstnej stawu. Środowisko syntetyczne lub naturalne dla komórek wszczepialnych musi spełniać szereg wymagań:

• Implanty powinny mieć porowatą strukturę dla adhezji i wzrostu komórek,
• ani sam polimer, ani produkty jego degradacji nie powinny wywoływać stanów zapalnych lub toksycznych podczas implantacji in vivo,
• nosiciel przeszczepu powinien być zdolny do wiązania sąsiadującej chrząstki lub kości podchrzęstnej,
• naturalna lub syntetyczna matryca musi być zdolna do absorpcji, jej degradacja musi być zrównoważona przez regenerację tkanek,
• Aby ułatwić naprawę chrząstki, struktura chemiczna i struktura macierzy matrycy powinny pomóc w zachowaniu fenotypu komórki kodowanej przez chondrocyty i syntezę białek specyficznych tkankowo,
• podczas implantacji in vivo konieczne jest zbadanie właściwości mechanicznych syntetycznej lub naturalnej matrycy.

[18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]

Zawiesina chondrocytów w fazie ciekłej

Przyleganie komórek do naczynia z tworzyw sztucznych, w którym hodowla chondrocytów można zapobiec ich ściany pokryte metylo roztwór celulozy, agaroza, hydrożel (poli-2-hydroksyetylu) lub mieszaniny kolagenu-agarozy. W tych warunkach chondrocyty tworzą klastery i syntetyzują głównie agrekan i kolageny specyficzne tkankowo (typy II, IX, XI). Zwykle znajdują się dwa typy komórek. Komórki zlokalizowane w centrum zachowują sferyczny kształt otoczony dobrze rozwiniętą ECM, co potwierdzają badania histochemiczne i ultrastrukturalne. Na obrzeżach chondrocytów mają obrysy konturów, otoczone są rzadkim ECM; Niewiele wiadomo na temat cech funkcjonalnych takich komórek.

Możliwe jest hodowanie chondrocytów na mikronośnikach wspomaganych w zawiesinie; Perełki dekstranowe (cytodeks), powlekane kolagenem perełki dekstranowe (cytodeks III), mikrokulki kolagenowe typu I (kolagen) bez mikroskopijności stosuje się jako mikronośniki. W tych warunkach hodowli chondrocyty przyczepiają się do powierzchni mikronośnika, zachowują sferyczny kształt i wytwarzają materiał podobny do matrycy. Ponadto zastosowanie kolagenu sprzyja proliferacji chondrocytów i ponownej ekspresji normalnego fenotypu. W związku z tym hodowlę chondrocytów na mikrosferach kolagenu można wykorzystać do przywrócenia fenotypu komórki przed przeszczepieniem.

Inną metodą hodowli zawiesiny chondrocytów w ciekłym środowisku jest ich hodowla w postaci gęstych perełek składających się z komórek (0,5-1 * 10 ^b ) otrzymanych przez odwirowanie. Takie chondrocyty są zdolne do wytworzenia matrycy zawierającej dużą liczbę proteoglikanów, kolagenu typu II, ale nie kolagenu typu I, co potwierdzają metody histologiczne, immunohistochemiczne i ilościowe.

Zawiesina chondrocytów w naturalnym ECM

Chondrocyty można hodować w zawiesinie w trójwymiarowej matrycy (miękki agar, agaroza, żel kolagenowy lub gąbka, kwas hialuronowy, klej fibrynowy, kulki alginianowe).

Hodowane chondrocyty z agarozą zachowują swój normalny fenotyp i syntezują kolagen typu II oraz nowe agregaty specyficzne tkankowo. Hodowane w komórce proteoglikany po hodowli w agarozie są uwalniane do pożywki przez 50 dni. Dla porównania - w hodowli monowarstwowej faza komórkowa jest przepełniona glikozoaminoglikanami już w pierwszych 5-6 dniach uprawy; kiedy jest hodowany w pożywce po nasileniu syntezy i uwalniania glikozoaminoglikanów, zależne od czasu zmniejszenie glikozoaminoglikanów zachodzi w ciągu pierwszych 8-10 dni. Niemniej jednak zachowanie chondrocytów podczas ich hodowli w agarozie różni się od zachowania w warunkach in vivo. W agarozie duża liczba zsyntetyzowanych agregatów Aggregan zawiera mniejsze i mniejsze cząsteczki niż in vivo. TGF-P stymuluje syntezę proteoglikanów w eksplantacie, ale zmniejsza syntezę agrekanu w agarozie.

Alginian jest liniowym polisacharydem pochodzącym z brązowych wodorostów. W obecności dwuwartościowych kationów, takich jak ^jony Ca ²⁺, ten polimer staje się żelem. Każdy chondrocytów złowione w alginian, otoczony przez matrycę z ujemnie naładowanymi polisacharydami, pory, które są porównywalne z tymi z chrząstki szklistej. Matryca, która jest utworzona z kulek alginianowych chondrocytów, składający się z dwóch segmentów - cienką warstwą matrycy komórkowej związane odpowiadającej okołokomórkowych i terytorialnych macierzy chrząstki stawowej, bardziej odległy matrycy międzyterytorialnej ekwiwalentu tkanki natywnej. W 30 dniu hodowli, względna i bezwzględna objętości zajmowanej przez komórki, a każdy z dwóch działów zgrubienia alginianu jest prawie całkowicie identyczne z natywną chrząstką. Prawie 30 dni chondrocyty zachowują swój kształt kulisty i wytwarzają agrekanu hydrodynamiczne właściwości, które są podobne do tych z agrekanu cząsteczek macierzy chrząstki stawowej, a cząsteczki kolagenu II, IX i XI types. W tym samym czasie jak inne kultur, zawiesiny kulek alginianowych na powierzchni spłaszczone komórki są obecne, że generuje małą ilość kolagenu typu I cząsteczki uwalnianej bezpośrednio do środowiska, nie wprowadzonego do magnetowidu. W perełkach alginianu obserwuje się umiarkowaną proliferację chondrocytów. Po 8 miesiącach hodowli w żelu alginianu dojrzałych chondrocytów nie tracą aktywność metaboliczną i nadal syntezy tkankowo specyficzne kolagenu typu II oraz agrekan.

N. Tanaka i współautorzy (1984) zbadali właściwości dyfuzji różnych naturalnych cząsteczek w alginacie i odkryli, że cząsteczki większe niż 70 kD nie rozpraszają się przez alginian. Tak więc, hodowla komórek w alginacie jest odpowiednia do badania regulacji biosyntezy matrycy i organizacji ECM. Dostępność komórek hodowanych w alginacie pozwala na zbadanie wpływu czynników regulujących peptydy i środków farmakologicznych na poziomy transkrypcji, potransskrypcji i translacji.

Chondrocyty są również hodowane w matrycy włókien kolagenowych typu I i II. S. Nehrer i współautorzy (1997) porównali funkcjonowanie chondrocytów dla psów w porowatych matrycach kolagenowo-proteoglikanowych zawierających kolageny różnych typów. Stwierdzili istotne różnice w morfologii funkcji biosyntezy chondrocytów hodowanych w matrycach kolagenowych zawierających kolagen typu I i II. Komórki w matrycy kolagenu typu II zwijały swój sferyczny kształt, natomiast w kolagenie typu I miały morfologię podobną do fibroblastów. Ponadto w macierzy kolagenu typu II chondrocyty wytwarzały więcej glikozoaminoglikanów. J. Van Susante i wsp. (1995) porównali właściwości chondrocytów hodowanych w alginacie i żelu kolagenowym (typ I). Autorzy stwierdzili znaczny wzrost liczby komórek w żelu kolagenowym, ale od szóstego dnia hodowli komórki utraciły charakterystyczny fenotyp, przekształcając się w komórki podobne do fibroblastów. W żelu alginianowym zaobserwowano zmniejszenie liczby komórek, ale chondrocyty zachowały swój normalny fenotyp. Ilość kolagenu, proteoglikany żelu na komórki były znacząco wyższe niż w alginianu, ale zaobserwowano spadek syntezy elementów macierzy żelu, wychodząc z 6 dnia hodowli, natomiast w syntezie alginianu nadal rośnie.

Solidna trójwymiarowa matryca fibryny jest naturalną substancją, która wspiera chondrocyty zważone w niej w zróżnicowanym fenotypie. 3D macierzy fibrynowej można również stosować jako nośnik do transplantacji chondrocytów. Zaletą fibryny jest brak cytotoksyczności, zdolność do wypełnienia przestrzeni, zdolność adhezyjna. W badaniach histologicznych i biochemicznych stwierdzono, że autoradiografia, mikroskopia elektronowa, chondrocyty w żelu fibrynowym zachowują swoją morfologię, rozmnażają się i wytwarzają matrycę nawet po 2 tygodniach hodowli. Jednak G. Homminga i współautorzy (1993) podali, że po 3 dniach uprawy rozpoczyna się rozpad fibryny, zmienia się odróżnicowanie chondrocytów.

Zawieszenie chondrocytów w sztucznym (syntetycznym) ECM

Implanty chrząstki do operacji rekonstrukcyjnej lub ortopedycznej można uzyskać przez hodowanie izolowanych chondrocytów in vitro w syntetycznej biokompatybilnej matrycy.

Hodowane poliglikolowe chondrocyty proliferują i zachowują prawidłową morfologię i fenotyp w ciągu 8 tygodni. Kompleks chondrocyt-kwas poliglikolowy składa się z komórek, glikozoaminoglikanów, kolagenów i posiada zewnętrzną kapsułkę kolagenu. Jednak w takich implantach istnieją dwa rodzaje cząsteczek kolagenu - I i II. Implanty odróżnicowane serią pasaży chondrocytów mają większą liczbę glikozoaminoglikanów i kolagenów niż implanty z pierwotnie niezróżnicowanych chondrocytów.

L. Freed i współautorzy (1 993b) porównali zachowanie kultur ludzkich chondrocytów i byków w włóknistym kwasie poliglikolowym (HPHC) i kwasie polimlekowym (PPLC). Po 6-8 tygodniach hodowli chondrocytów byków w HSVG lub PPLC, autorzy obserwowali proliferację komórek i regenerację macierzy chrząstki. W HSBC chondrocyty były sferyczne, zlokalizowane w luce otoczonej chrząstkowatą matrycą. Po 8 tygodniach hodowli in vitro, zregenerowana tkanka zawierała do 50% suchej masy (4% masy komórek, 15% glikozoaminoglikanów i 31% kolagenu). W komórkach PPLK miały kształt wrzeciona, niewielką ilość glikozoaminoglikanów i kolagenu. W HSBC wzrost komórek był 2 razy bardziej intensywny niż w PTCA. W warunkach in vivo, chondrocyty hodowane w HPVC i PPLC przez 1 do 6 miesięcy wytworzyły tkankę histologicznie podobną do chrząstki. Implanty zawierały glikozoaminoglikany, kolageny typu I i typu II.

Płodowe chondrocyty hodowano w porowatym hydrofobowym i hydrofilowym polietylenie o dużej gęstości. Po 7 dniach inkubacji w obu podłożach komórki zachowały kulisty kształt, głównie zawierający kolagen typu II. Po 21 dniach hodowli okazało się, że matryca hydrofilowa zawiera więcej kolagenu typu II niż matryca hydrofobowa.

Tkanka chrzęstna może być również uzyskana przez hodowlę w monowarstwie na filtrach Millicell-CM. Wstępne powlekanie filtrów kolagenem jest niezbędne do zamocowania chondroitów. Badanie histologiczne hodowli wykazuje gromadzenie się chondrocytów w ECM zawierających proteoglikany i kolagen typu II. Kolagen typu I w takiej hodowli nie jest wykrywany. Chondrocyty w powstałej tkance chrzęstnej mają kulisty kształt, ale na powierzchni tkanki są nieco spłaszczone. Grubość nowo powstałej tkanki wzrastała z czasem i zależała od początkowej gęstości pojedynczej warstwy komórek. W optymalnych warunkach hodowli grubość tkanki chrzęstnej osiągnęła 110 μm, a organizacja komórek i kolagenu w powierzchni i głębokich warstwach jest podobna do chrząstki stawowej. VKM zawiera około 3 razy więcej kolagenu i proteoglikanów. Po 2 tygodniach hodowli odnotowano akumulację matrix-sa, co umożliwiło ekstrakcję tkanki z filtra i wykorzystanie jej do przeszczepu.

Sims i wsp. (1996) badali hodowlę chondrocytów w matrycy polimerowej otoczonej żelem poli (tlenek etylenu), która umożliwia transport dużej liczby komórek przez wstrzyknięcie. Sześć tygodni po wstrzyknięciu do tkanki podskórnej myszy bezgrasiczych, powstała nowa chrząstka, która morfologicznie charakteryzowała się białą opalizacją podobną do chrząstki szklistej. Dane z badań histologicznych i biochemicznych wskazują na obecność aktywnie proliferujących chondrocytów, które wytwarzają ECM.

Explanation

Badanie tkanki chrzęstnej służy do badania procesów ana- i katabolizmu w nim, homeostazy, resorpcji i naprawy. Chondrocyty w eksplantach tkanki chrzęstnej wspierają normalny fenotyp i skład ECM, podobny do chrząstki stawowej in vivo. Po 5 dniach hodowli w obecności surowicy uzyskuje się stały poziom syntezy i naturalną degradację. Resorpcję tkanki można przyspieszyć w hodowli głównej i hodowli z dodatkiem surowicy przez szereg czynników, na przykład IL-1B, TNF-α, lipopolisacharydy bakteryjne, pochodne kwasu retinowego lub aktywne rodniki tlenowe. Aby zbadać naprawę chrząstki, jej uszkodzenie wywoływane jest przez rozpuszczalne mediatory stanu zapalnego (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) lub fizyczne rozerwanie matrycy.

Metoda hodowli organotypowych jest modelem do badania efektów in vitro wyodrębnionych czynników zewnętrznych na chondrocytach i otaczającej osnowie. In vivo, chondrocyty są rzadko zlokalizowane w ECM i nie kontaktują się ze sobą. Kultura eksplantacyjnej chrząstki stawowej zachowuje tę strukturę strukturalną, jak również szczególne interakcje między chondrocytami i otaczającym je środowiskiem zewnątrzkomórkowym. Model ten jest również wykorzystywany do badania wpływu stresu mechanicznego, środków farmakologicznych, czynników wzrostu, cytokin, hormonów na metabolizm chrząstki.

Inną zaletą eksplantacji tkanki chrzęstnej jest brak uszkodzenia chondrocytów przez enzymy proteolityczne lub czynnik mechaniczny, co jest nieuniknione, gdy komórki są izolowane. Receptory i inne białka błonowe i glikoproteiny są chronione przed szkodliwymi czynnikami.

[26], [27], [28], [29], [30]

Kultura chondronów

Chondron to strukturalna, funkcjonalna i metaboliczna jednostka chrząstki stawowej, składająca się z chondrocytu, jego macierzy okołokomórkowej i zwartej kapsułki filamentowej, odpowiedzialna za homeostazę macierzy. Chondrony są mechanicznie ekstrahowane z chrząstki i zbierane przez kilka kolejnych homogenizacji o niskiej prędkości. Odizolowany od strefy o różnych głębokościach hondrony chrząstki może być podzielona na cztery kategorie: pojedynczy hondron, podwójne hondrony, kilka (trzy lub więcej) rozmieszczone liniowo hondrony (kolumna hondronov) przeszkody hondronov.

Pojedyncze chondrony zwykle znajdują się w środkowych warstwach nienaruszonej chrząstki, w połączeniu - na granicy warstw środkowych i głębokich, liniowo rozmieszczone liczne chondrony są typowe dla głębokich warstw nienaruszonej chrząstki. Wreszcie, skupiska chondronów składają się z losowo zorganizowanych grup pojedynczych i sparowanych chondronów, które zachowują stan skupienia po homogenizacji. Akumulacje chondronów to duże fragmenty chrząstki, zawierające zwykle kilka chondronów i promieniowo rozmieszczone włókienka kolagenowe, tj. Typową organizację charakterystyczną dla głębokich warstw macierzy. Chondrony są unieruchamiane w przezroczystej agarozie, co pozwala badać ich strukturę, skład molekularny i aktywność metaboliczną. Chondron - układ agarozowy jest uważany za mikromodel chrząstki, który różni się od tradycyjnego układu chondrocyt - agaroza tym, że zachowane jest naturalne mikrośrodowisko, nie ma potrzeby wykonywania jego syntezy i montażu. Kultura chondronów jest modelem do badania interakcji komórek i macierzy w chrząstce stawowej w warunkach normalnych i patologicznych.

[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]

Kultura nieśmiertelnych chondrocytów

Aby utworzyć trwałe linie komórkowe, stosuje się rekombinowane DNA lub wirusy zawierające onkogen, które mogą uczynić komórkę "nieśmiertelną". Nieśmiertelne chondrocyty mają zdolność do niekończącej się proliferacji, utrzymując stabilny fenotyp. F. Mallein-Gerin et al (1995) wykazali, że onkogenu jest proliferacja SV40T wywołane chondrocytów myszy, które w ten sposób nadal stabilnie wyrażają kolagen II, IX i X typów, jak również wspólne i agrekanu białka wiążącego. Jednakże taka linia komórkowa nabywa zdolność do syntezy kolagenu typu I, gdy jest hodowana w hodowli monowarstwowej lub w żelu agarozowym.

W. Horton i współautorzy (1988) opisali linię nieśmiertelnych komórek o niskim poziomie ekspresji mRNA kolagenu typu II. Komórki te uzyskano przez transformację ich retrowirusem myszy zawierającym kationy I-myc- i y-ra-onkogenów. Ten rodzaj komórek jest unikalnym modelem do badania interakcji matrycy stawowej w nieobecności kolagenu typu II, a także regulacji syntezy kolagenu typu II.

Hondropitov kultura genem zmutowanym lub usunięty - wygodnym modelem do badania ich funkcji fizjologicznych. Model ten jest szczególnie przydatny do badania roli konkretnych cząsteczek w organizacji macierzy chrząstki lub badanie wpływu różnych czynników regulacyjnych na metabolizm chrząstki. Chondrocyty genu zdalnego syntetyzowany kolagen typu IX włókienka kolagenowe większy niż normalne, wskazując, że kolagen typu IX reguluje średnicę włókien. Jak już wspomniano w rozdziale 1, nowo znalezionego mutacja genu COLAI typ kodowania II kolagenu w rodzinach z pierwotną uogólnioną chorobą zwyrodnieniową stawów. W celu zbadania wpływu zmutowanych kolagenu typu II w stawowej matrycy R. Dharmrvaram et al (1997) Do wykonania transfekcji ( „zanieczyszczenie” obcy kwas nukleinowy) wadliwy COL ₂ AI (arginina w pozycji 519 jest zastąpiony przez cysteinę) w ludzkich chondrocytach płodowych in vitro.

System współhodowli. W stawie chrząstka oddziałuje z komórkami innych typów zawartych w błonie maziowej, mazi stawowej, więzadłach, kości podchrzęstnej. Na metabolizm chondrocytów mogą wpływać różne rozpuszczalne czynniki syntetyzowane przez te komórki. Tak więc, chrząstka stawowa stawowa jest niszczona przez enzymy proteolityczne i wolne rodniki, które są wytwarzane przez komórki maziowe. Dlatego opracowano modele do badania złożonych interakcji między chrząstkami i otaczającymi tkankami, które nazywane są kulturą.

S-Lacombe Gleise et al (1995) były hodowane osteoblasty i chondrocyty królika w systemie jednoczesnej hodowli (Costar), w którym komórki zostały rozdzielone mikroporowatej membrany (0,4 mikrometra) umożliwia wymianę między dwoma typami komórek, bez bezpośredniego kontaktu. Badanie to wykazało zdolność osteoblastów do stymulacji wzrostu chondrocytów poprzez rozpuszczalne mediatory.

A.M. Malfait i współautorzy (1994) badali związek między monocytami krwi obwodowej i chondrocytami. Model ten jest wygodny do badania procesów, w których pośredniczą cytokiny, w stanach zapalnych artropatii (reumatoidalne zapalenie stawów, seronegatywne zapalenie stawów kręgosłupa, itp.). Autorzy modelu oddzieliły komórki przez błonę wiążącą białko o średnicy porów 0,4 μm. Badania wykazały, że monocytów stymulowanych lipopolisacharydem opracowano iFNO IL-1 a, który hamuje syntezę chondrocytów agrekanu, przyczyniając się do pogorszenia już syntetyzowanych agregatów agrekanu.

K. Tada i inni (1994), utworzony wzór współhodowli w którym komórki śródbłonka w kolagen (I typu) żel wprowadzono do komory wewnętrznej do komory zewnętrznej oddzielonej od niej chondrocytów umieszczonych na filtrze o wielkości porów wynoszącej 0,4 mikronów. W stanie całkowitej izolacji od zewnętrznej komory ludzkie komórki śródbłonka utworzyły probówki w żelu kolagenowym w obecności EGF lub TGF-a. Przy równoczesnej hodowli obu typów komórek TGF zahamowano zależne tworzenie się rur przez komórki śródbłonka. Hamowanie chondrocytami tego procesu zostało częściowo wyeliminowane przez przeciwciała anty-TGF-beta. Można założyć, że TGF-beta wytwarzany przez chondrocyty obniża unaczynienie samej chrząstki.

S. Groot i współautorzy (1994) jednocześnie hodowali chondrocyty z hipertroficznych i proliferacyjnych stref kości 16-dniowej myszy płodowej z kawałkami tkanki mózgowej. Po 4 dniach hodowli zaobserwowano transróżnicowanie chondrocytów do osteoblastów i początek tworzenia się osteoid. Po 11 dniach uprawy część chrząstki zastąpiono tkanką kostną, a macierz kostną częściowo zwapniała. Niektóre neuropeptydy i neuroprzekaźniki wytwarzane przez tkankę mózgową wpływają na metabolizm osteoblastów lub mają na nich receptory. Wśród nich można wyizolować norepinefrynę, wazoaktywny peptyd jelitowy, peptyd związany z genem kalcytoniny, substancję P i somatostatynę. Hodowane w chondrocytach fragmenty tkanki mózgowej mogą wytwarzać niektóre z tych czynników, które mogą indukować proces transdyferencjacji chondrocytów do osteoblastów.

[42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49]

Wpływ czynników zewnętrznych na kulturę chondrocytów

Wpływ napięcia tlenu na metabolizm chondrocytów

W większości przypadków kultury chondrocytów rozwijają się w warunkach atmosferycznego ciśnienia tlenu. Niemniej jednak dobrze wiadomo, że chondrocyty in vivo istnieją w warunkach niedotlenienia, a napięcie tlenu zmienia się w różnych stanach patologicznych. Podczas dojrzewania obserwuje się znaczące zmiany w dopływie krwi w okolicy nasadki. Ponieważ unaczynienie zmienia się w różnych obszarach płytki wzrostowej, napięcie tlenu w nich również się zmienia. C. Brighton i R. Heppenstall (1971) wykazali, że w płytce piszczeli u królików, napięcie tlenu w strefie hipertroficznej jest mniejsze niż w otaczającej chrząstce. Pomiary niektórych parametrów metabolicznych wykazały, że chondrocyty są w stanie szybko reagować na lokalne zmiany stężenia tlenu. Przede wszystkim przy niskim napięciu tlenu zmniejsza się jego zużycie chondrocytów. Wraz ze spadkiem ciśnienia tlenu z 21 do 0,04%, wzrasta wykorzystanie glukozy, zwiększa się aktywność enzymatyczna glikolizy i synteza kwasu mlekowego. Nawet przy niskim napięciu tlenu absolutna ilość ATP, ADP i AMP pozostaje stabilna. Dane te wskazują kierunkowość metabolizmu chondrocytów w celu maksymalizacji oszczędności energii. Niemniej jednak aktywność syntetyczna, a zatem i procesy reparacji, zmieniają się w warunkach niedotlenienia.

Wysokie napięcie tlenu wpływa również na metabolizm chondrocytów, powodując zmniejszenie syntezy proteoglikanów i DNA, degradację macierzy chrząstki. Efektom tym z reguły towarzyszy wytwarzanie wolnych rodników tlenowych.

Wpływ stężenia jonów i ciśnienia osmotycznego środowiska na funkcję chondrocytów

Stężenia jonów natywną chrząstka jest znacząco różny od innych tkanek: zawartość sodu w środowisku pozakomórkowym 250 - 350 mmoli i jego osmolarność - 350-450 mOsm. Kiedy izolowanie chondrocytów z magnetowidu i inkubację w standardowym nośniku (DMEM (Minimal Essential Medium Dulbecco - Minimum Essential Medium Dulbecco) osmolarność - 250-280,7 mOsm) Zmienia ostro otaczającego środowiska komórki. Ponadto stężenie wapnia i potasu w standardowych podłożach jest znacznie niższe niż w tkance natywnej, a stężenie anionów jest znacznie wyższe.

Dodanie sacharozy do pożywki prowadzi do zwiększenia jej osmolarności i indukuje przejściowy wewnątrzkomórkowy wzrost stężenia H ⁺ i anionów wapnia w cytozolu. Takie wewnątrzkomórkowe zmiany mogą wpływać na procesy różnicowania chondrocytów i ich metaboliczną aktywność. J. Miejskie i inni (1993) stwierdził, że włączenie do ³⁵ 8-siarczanu i ³ 'H-proliny izolowanych chondrocytów inkubowanych w standardowej pożywce DMEM przez 2-4 godzin tylko 10% masy w natywnej tkanki. Intensywność syntezy osiągnęła maksimum przy osmolarności pozakomórkowego ośrodka 350-400 mosmolu zarówno w nowo wyizolowanych chondrocytach, jak iw eksplantatach tkanki chrzęstnej. Ponadto objętość chondrocytów zwiększyła się o 30-40% po umieszczeniu izolowanych komórek w standardowej pożywce DMEM o wspomnianej osmolarności. Jednak w hodowli chondrocytów w osmolarności niefizjologicznej przez 12-16 h komórki adaptują się do nowych warunków, zmniejszając intensywność biosyntezy proporcjonalnie do osmolarności ośrodka pozakomórkowego.

Borgetti P. I współpracownicy, (1995) badali wpływ osmolarności pozakomórkowego w rozwoju, morfologii i biosyntezę świń chondrocytów. Autorzy wykazały podobne właściwości biochemiczne i morfologiczne chondrocyty w hodowli w pożywce o osmolarności mOsm 0,28 i 0,38. Gdy 0,48 mOsm osmolarność ośrodka w czasie pierwszych 4-6 godzinach hodowli zaobserwowano zmniejszenie proliferacji komórek i syntezy białka, a następnie doszło przywrócić te parametry, które ostatecznie osiągniętych wartości kontrolnych. Gdy hodowlę chondrocytów w podłożu z komórkami osmolarności 0,58 mOsm tracą zdolność do wspierania intensywności fizjologicznych procesów proliferacji i po 6 dniach liczby chondrocytów jest znacznie zmniejszona. Przy osmolarności ośrodka, 0,58 mosmolu, obserwuje się głębokie zahamowanie syntezy białka. Ponadto, gdy hoduje się je w pożywce z osmolarności mOsm 0,28-0,38 chondrocyty zachowują fenotyp fizjologicznego w większym osmolarności (mOsm 0,48-0,58) znaczące zmiany w morfologii komórki, co przejawia się straty cecha fenotypowa chondrocytów konwersji w komórki podobne do fibroblastów, jak również utratę komórek, zdolność do składania proteoglikanów macierzy. Wyniki tego badania wskazują na zdolność chondrocytów do reagowania na ograniczone oscylacje osmolalności w środowisku zewnątrzkomórkowym.

Zmiana stężenia innych jonów może również wpływać na procesy biosyntezy w chondrocytach. Tak więc stopień włączenia ^35S (siarczanu) zwiększa się o połowę przy wzroście stężenia jonów potasu z 5 mmol (stężenie w standardowej pożywce DM DM) do 10 mmol (stężenie w VKM in vivo). Stężenie wapnia poniżej 0,5 mmol przyczyniło się do produkcji kolagenu przez dojrzałe chondrocyty byka, podczas gdy stężenie 1-2 mmol (odpowiadające stężeniu w standardowym podłożu DM DM) spowodowało znaczne zmniejszenie syntezy kolagenu. Umiarkowany wzrost biosyntezy obserwowano przy wysokich stężeniach wapnia (2-10 mmol). Różne kationy uczestniczą w przyłączaniu chondrocytów do białek VKM. Zatem jony magnezu i manganu zapewniają przyłączenie do fibronektyny i kolagenu typu II, podczas gdy jony wapnia nie uczestniczą w przyłączaniu chondrocytów do białek. Tak więc, wyniki opisanych badań wskazują na wpływ zmian jonów pozakomórkowych potasu, sodu, wapnia i osmolarności pożywki na biosyntetyczną funkcję chondrocytów inkubowanych w standardowych podłożach.

Wpływ nacisku mechanicznego na metabolizm chondrocytów

Immobilizacja stawu powoduje odwracalną atrofię chrząstki, co wskazuje na potrzebę mechanicznych bodźców do prawidłowego przebiegu procesów metabolicznych w ECM. W większości przypadków stosowane modele hodowli komórkowych istnieją w normalnych warunkach ciśnienia atmosferycznego. M. Wright i współautorzy (1996) wykazali, że środowisko mechaniczne wpływa na metabolizm chondrocytów, odpowiedź komórek zależy od intensywności i częstotliwości obciążenia kompresją. Eksperymenty z ładowaniem eksplantów nienaruszonej chrząstki stawowej in vitro wykazały spadek syntezy białek i proteoglikanów pod działaniem obciążenia statycznego, podczas gdy ładowanie dynamiczne stymuluje te procesy. Dokładne mechanizmy uzyskiwania efektu obciążenia mechanicznego na chrząstce są złożone i są prawdopodobnie związane z deformacją komórek, ciśnieniem hydrostatycznym, ciśnieniem osmotycznym, potencjałem elektrycznym i powierzchniowymi receptorami komórkowymi dla cząsteczek macierzy. Aby zbadać wpływ każdego z tych parametrów, konieczne jest stworzenie systemu, w którym jeden parametr może być niezależnie zmieniany. Na przykład, kultura eksplantacyjna nie jest odpowiednia do badania deformacji komórek, ale może być wykorzystana do badania ogólnego wpływu ciśnienia na aktywność metaboliczną chondrocytów. Kompresja chrząstki prowadzi do odkształcenia komórek, a także wraz z wystąpieniem gradientu ciśnienia hydrostatycznego, potencjał elektryczny, i zmiany fizykochemicznych przepływu płynu od takich czynników jak zawartość wody w matrycy, gęstość ładunku elektrycznego na poziomie ciśnienia osmotycznego. Odkształcenie komórek można badać przy użyciu izolowanych chondrocytów zanurzonych w żelu agarozowym lub kolagenowym.

Opracowano kilka systemów do badania wpływu mechanicznej stymulacji na hodowlę chondrocytów. Niektórzy badacze używają w tym celu systemów, w których ciśnienie jest doprowadzane do hodowli komórkowej przez fazę gazową. Na przykład w JP Veldhuijzen i inni (1979), stosując ciśnienie powyżej ciśnienia atmosferycznego o 13 kPa przy niskiej częstotliwości (0,3 Hz), przez 15 minut, obserwowano wzrost syntezy cAMP i proteoglikanów i obniżenie syntezy DNA. R. Smith i inni (1996) pokazał, że przerywane wystawienie pierwotnych hodowli chondrocytów byka ciśnienia hydrostatycznego (10 MPa) przy częstotliwości 1 Hz w ciągu 4 godzin spowodowała wzrost syntezy agrekanu oraz kolagenu typu II, natomiast stałe ciśnienie nie ma wpływu na te procesy. Stosując podobny układ Wright M. I wsp (1996) podali, że cykliczny ciśnienie w hodowli komórkowej jest związany z hiperpolaryzacji błony komórkowej chondrocytów i aktywacji Ca ²⁺ ina- czej kanały potasowe. Tak więc, w wyniku działania cyklicznego ciśnienia pośredniczą kanały jonowe aktywowane przez rozciąganie w błonie chondrocytowej. Odpowiedź chondrocytów na ciśnienie hydrostatyczne zależy od warunków hodowli komórek i częstotliwości przyłożonego obciążenia. Tak więc, cykliczne ciśnienia hydrostatycznego (5 MPa) obniża wbudowanie siarczanu do chondrocytów monowarstwy przy częstotliwości 0,05, 0,25 i 0,5 Hz, podczas gdy dla częstotliwości powyżej 0,5 Hz siarczanem włączenia chrząstki zwiększa eksplantu.

M. Bushmann i wsp. (1992) donoszą, że chondrocyty w żelu agarozowym zmieniają biosyntezę w odpowiedzi na statyczne i dynamiczne obciążenia mechaniczne w ten sam sposób, co hodowany nietknięty narząd. Autorzy stwierdzili, że obciążenie mechaniczne wytwarza bodziec hiperosmotyczny, po którym następuje spadek pH w chondrocytach.

Efekt mechanicznego rozciągania można badać na hodowli komórek zanurzonych w żelu. Siła rozciągająca może zostać wytworzona przy użyciu sterowanego komputerowo podciśnienia. Kiedy układ znajduje się w próżni w pewnym stopniu, dno szalki Petriego z kulturą komórkową jest przedłużane o pewną ilość, odkształcenie jest maksymalne na krawędziach dna kubka i jest minimalne w środku. Rozciąganie przenosi się i hoduje w płytce Petriego chondrocytów. Dzięki tej metodzie, Holm-Vall K. I inni (1995) pokazał, że hodowane kolagenu (typu II) komórki żel chrzęstniakomięsak zwiększyło ekspresję mRNA i ₂ -integrina. A integryna ₂ p _g jest zdolna do wiązania kolagenu typu II. Uważa się go za mechanoreceptor, ponieważ oddziałuje on z białkami wiążącymi aktynę, tym samym łącząc ECM i cytoszkielet.

Wpływ pH na metabolizm chondrocytów

Wartość pH płynu śródmiąższowego ECM tkanki chrzęstnej jest bardziej kwaśna niż w innych tkankach. A. Maroudas (1980) określił pH chrząstki stawowej na 6,9. W. Diamant i współautorzy (1966) stwierdzili pH 5,5 w warunkach patologicznych. Wiadomo, że chondrocyty żyją przy niskim PO2, co wskazuje na ważną rolę glikolizy (95% całkowitego metabolizmu glukozy) w metabolizmie tych komórek; glikolizie towarzyszy wytwarzanie dużej ilości kwasu mlekowego.

Oprócz zakwaszania środowiska przez produkty glikolizy, same składniki matrycy mają ogromne znaczenie. Duża liczba stałych ładunku ujemnym zewnątrzkomórkowych proteoglikanów modyfikuje skład jonowy: jest wysokie stężenie wolnych kationów (na przykład oznacza H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ), a niskie stężenie anionów (na przykład, O2 NPHS). Ponadto, pod wpływem obciążenia mechanicznego, woda jest usuwana z ECM, co prowadzi do wzrostu stężenia ustalonych ładunków ujemnych i przyciągania większej liczby kationów do matrycy. Towarzyszy temu obniżenie pH pozakomórkowego środowiska, które wpływa na wewnątrzkomórkowe pH, tym samym modyfikując metabolizm chondrocytów. R. Wilkin i A. Hall (1995) badali wpływ pH pozakomórkowego i wewnątrzkomórkowego ośrodka na biosyntezę matrycy przez izolowane chondrocyty buhajów. Zaobserwowali podwójną modyfikację syntezy macierzy ze spadkiem pH. Nieznaczny spadek pH (7,4 35 S0 ₄ i ³ H-proliny w chondrocytach, podczas gdy głębsze zakwaszenia (pH <7,1) hamuje syntezę o 75% w porównaniu z kontrola. Stworzenie takiego samego niskiego pH (6,65) z jonami amonowymi spowodowało zmniejszenie syntezy matrycy tylko o 20%. Uzyskane wyniki wskazują, że modyfikacji pH podłoża syntezy zewnątrzkomórkowej nie można wytłumaczyć jedynie zmianami pH ośrodka wewnątrzkomórkowego. Ponadto chondrocyty mają zdolność regulowania pH wewnątrzkomórkowe w Na ⁺, H ⁺ wymiennika, Ca ⁺ -zależną C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS i H ⁺ / ATPazy.

[50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]

Wpływ składu podłoża do hodowli na metabolizm chondrocytów

Pożywka do hodowli chondrocytów musi odpowiadać warunkom eksperymentalnym. W ostatnich latach do optymalizacji warunków hodowli zastosowano surowicę cielęcą. Jednak przy stosowaniu surowicy należy wziąć pod uwagę kilka ważnych punktów:

• zewnętrzny wzrost komórek z obrzeża tkanki w hodowlach organów,
• zmienność składu surowic różnych serii,
• obecność w nich nieznanych składników,
• zwiększone ryzyko interferencji, artefakty w badaniu wpływu różnych czynników biologicznych na metaboliczną aktywność komórek.

Przykładem tego ostatniego jest badanie wpływu EGF na chondrocyty chrząstki u szczurów. EGF stymuluje wbudowanie ³ H-tymidyny i zwiększyć zawartość DNA w hodowli. Efekt ten był wyraźniejszy przy niskim stężeniu w surowicy (<1%), ale przy wysokich stężeniach (> 7,5%) efekt zniknął.

Jest dobrze znane, że poziomy syntezy i degradacji w DMEM wzbogaconej w surowicę cielęcą są znacznie zwiększone w porównaniu do warunków in vivo. Różnice między metabolizmem in vivo i in vitro mogą być spowodowane różnicami między mazi stawowej a środowiskiem, w którym komórki są hodowane. D. Lee i inni (1997) były hodowane chondrocyty młodych byków agarozowym przy użyciu pożywki zawierającej DMEM, wzbogacone 20% surowicy cielęcej i wielu allogenicznego normalnego płynu maziowego. Obecność płynu maziowego w pożywce spowodowała wzrost liczby proteoglikanów, aż do 80% całkowitej ilości płynu maziowego. Otrzymane wyniki wskazują, że płyn stawowy w hodowli indukuje szybkość metabolizmu podobną do tej w warunkach in vivo, z wysokim poziomem syntezy glikozoaminoglikanów i niskim poziomem podziału komórkowego.

G. Verbruggen et al (1995) wykazali, że synteza ³⁵ S-arrpeKaHa ludzkich chondrocytów hodowane w agarozie w DMEM bez surowicy wynosiła 20-30% poziomu syntezy obserwowanej w DMEM uzupełnionej 10% surowicą cielęcą. Autorzy określili, w jakim stopniu IGF-1, IGF-2, TGF-P lub insulina przywracają produkcję agrekanu w pożywkach wolnych od surowicy. Autorzy doszli do wniosku, że 100 ng / ml insuliny, IGF-1 lub IGF-2 częściowo zmniejszyło syntezę agrekanu do 39-53% poziomu kontrolnego. Po połączeniu tych czynników nie zidentyfikowano zjawisk synergicznych ani kumulacyjnych. Jednocześnie 10 ng / ml TGF-P w obecności 100 ng / ml insuliny stymulowało syntezę agrekanu do 90% lub więcej z poziomu odniesienia. Wreszcie, transferyna w surowicy, sama lub w połączeniu z insuliną, nie miała wpływu na syntezę agrekanu. Gdy surowica cielę została zastąpiona albuminą z surowicy bydlęcej, łączna zawartość agrekanu została znacznie zmniejszona. Wzbogacenie podłoża do hodowli insuliny, IGF lub TGF-P częściowo przywróciło zdolność komórek do wytwarzania agregatów agrekanu. W tym przypadku IGF-1 i insulina są w stanie utrzymać homeostazę w hodowlach komórkowych. Po 40 dniach hodowli na pożywce zawierającej 10-20 ng / ml IGF-1, syntezę proteoglikanów była utrzymywana na tym samym poziomie lub nawet więcej, w porównaniu z medium zawierającym 20% surowicy cielęcej. Procesy kataboliczne przebiegały wolniej w pożywce wzbogaconej w IGF-1 niż w pożywce wzbogaconej w 0,1% roztwór albuminy, ale nieco szybciej w pożywce wzbogaconej w 20% surowicy. W długo żyjących hodowlach, 20 ng / ml IGF-1 utrzymuje stabilny stan komórek.

D. Lee i inni (1993) w stosunku do wpływu kompozycji pożywce hodowlanej (DMEM z DMEM + 20% cielęcej surowicy DMEM + 20 ng / ml IGF-1) na syntezę DNA kultury eksplantacji chrząstki, hodowli jednowarstwowej, w zawiesinie w żelu agarozowym . Hodowane w agarozie w obecności surowicy autorzy obserwowali tendencję do grupowania chondrocytów w duże skupiska. Komórki hodowane bez surowicy lub z IGF-1 przechowywano w okrągłym kształcie agarozy, zmontowano w małe grupy, ale nie tworzyły dużych agregatów. W monowarstwie synteza DNA była znacznie wyższa w podłożach zawierających surowicę niż w pożywce wzbogaconej w IGF-1; Synteza DNA w tym ostatnim była znacznie wyższa niż w nieużywanym środowisku. W hodowli chondrocytów w zawiesinie w agarozie w nieużywanej pożywce i w pożywce z IGF-1 nie zaobserwowano różnic w syntezie DNA. Jednocześnie zawiesinę hodowli chondrocytów w agarozy w pożywce uzupełnionej surowicą towarzyszy zwiększone włączenie radionuklidu ³ H-tymidyny w porównaniu do innych środowisk.

Witamina C jest niezbędna do aktywacji enzymów zaangażowanych w tworzenie stabilnej spiralnej struktury włókienek kolagenowych. Chondrocyty, z niedoborem kwasu askorbinowego, syntetyzują nie hydroksylowane niehelikalne prekursory kolagenu, które są powoli wydzielane. Wprowadzenie kwasu askorbinowego (50 μg / ml) powoduje hydroksylację kolagenu typu II i IX oraz ich wydzielanie w normalnych ilościach. Dodatek witaminy C nie wpłynął na poziom syntezy proteoglikanów. W związku z tym wydzielanie kolagenu jest regulowane niezależnie od sekrecji proteoglikanów.

[58], [59], [60], [61], [62], [63], [64], [65]