Diagnostyka laboratoryjna choroby zwyrodnieniowej stawów

W większości przypadków u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów nie stwierdza się zmian w wynikach badań krwi i moczu, z wyjątkiem przypadków zapalenia błony maziowej ze znacznym wysiękiem, kiedy może wystąpić wzrost OB, hipergammaglobulinemii, wzrost poziomu wskaźników ostrej fazy - CRP, fibrynogenu itp. Podczas badania płynu stawowego nie stwierdza się istotnych odchyleń od prawidłowych wskaźników.

W ostatnich latach trwają intensywne poszukiwania możliwych biologicznych markerów (BM) degradacji i naprawy tkanek stawowych (głównie chrząstki i kości). BM powinny odzwierciedlać te dynamiczne zmiany, służyć jako predyktory prognozy osteoartrozy i markery skuteczności leczenia patogenetycznego. Odkrycie nowych i bardziej dogłębnych badań znanych markerów biologicznych pozwoli na lepsze zrozumienie mechanizmów patogenezy osteoartrozy. Jednak głównym zadaniem wykorzystania biologicznych markerów metabolizmu chrząstki jest ocena właściwości chondroprotekcyjnych leków i monitorowanie leczenia lekami należącymi do grupy DMO AD - „modyfikujących przebieg choroby”.

W przypadku choroby zwyrodnieniowej stawów zmiany patologiczne występują głównie w chrząstce stawowej, a także w kości podchrzęstnej, błonie maziowej i innych miękkich tkankach stawu. Ponieważ nasza zdolność do bezpośredniego badania tych struktur jest ograniczona, najważniejszymi źródłami do zbierania markerów biologicznych są krew, mocz i płyn stawowy.

Badanie moczu jest najbardziej preferowane, ponieważ nie wiąże się z żadnymi inwazyjnymi procedurami. Naszym zdaniem idealnym materiałem do badania jest codzienny mocz. Bardziej odpowiednia byłaby analiza porannej porcji moczu, ale możliwość jej wykorzystania opiera się jedynie na fakcie, że tego typu analiza jest stosowana do określania biologicznych markerów metabolizmu kostnego w osteoporozie: wiadomo, że biologiczne markery podlegają rytmom dobowym, a szczytowe stężenie biologicznych markerów metabolizmu kostnego występuje w nocy. Obecnie w literaturze nie ma informacji na temat rytmów dobowych biologicznych markerów tkanek miękkich, chrząstki, dlatego ostateczna decyzja o wyborze odpowiedniego badania moczu zostanie podjęta po przeprowadzeniu odpowiednich badań.

Badania krwi są rutynowymi badaniami klinicznymi. Niektóre markery biologiczne są już oznaczane we krwi, takie jak wskaźniki fazy ostrej, podczas gdy inne mogą zostać włączone do standardowej listy testów biochemicznych w niedalekiej przyszłości. Dla każdego markera biologicznego konieczne jest określenie, w którym składniku krwi powinien zostać oznaczony - osoczu czy surowicy. Wyniki badań wskazują, że stężenie markerów biologicznych w osoczu krwi różni się znacząco od stężenia w surowicy. Markery biologiczne są zwykle oznaczane w surowicy krwi. Według V. Rayana i in. (1998) stężenia markerów biologicznych we krwi pobranej z żyły w pobliżu chorego stawu i z bardziej odległej żyły są różne. Dane te wskazują na potrzebę standaryzacji pobierania próbek krwi do badania markerów biologicznych.

Według LJ Attencia i in. (1989), chrząstka stawów maziowych dorosłego człowieka stanowi zaledwie 10% całkowitej masy chrząstki szklistej w organizmie, w tym krążków międzykręgowych. Tak więc określenie markerów biologicznych we krwi i moczu odzwierciedla metabolizm systemowy, a nie lokalne zmiany w stawie dotkniętym chorobą zwyrodnieniową stawów. Płyn stawowy jest najbliżej ogniska patologicznego w chorobie zwyrodnieniowej stawów i prawdopodobnie najdokładniej odzwierciedla procesy zachodzące w dotkniętym stawie. Stężenie markerów biologicznych w płynie stawowym może być znacznie wyższe niż we krwi, co oznacza, że łatwiej je określić. Przykłady obejmują epitop 846 agrekanu - w płynie stawowym jest go 40 razy więcej niż w surowicy krwi, oligomeryczne białka macierzy chrząstki (COMP) - 10 razy więcej niż w surowicy krwi. Produkty degradacji w płynie stawowym dokładniej odzwierciedlają procesy kataboliczne w chrząstce stawowej. Odpływ cząsteczek z płynu stawowego poprzez lokalny układ limfatyczny może prowadzić do zmniejszenia ich rozmiaru, a nawet zniszczenia.

Mimo inwazyjności techniki pobierania płynu stawowego, związanej z szeregiem możliwych powikłań, wartość oznaczania w niej markerów biologicznych jest oczywista. Aby uniknąć problemów z tzw. suchym stawem, można wstrzyknąć do stawu 20 ml izotonicznego roztworu NaCl bezpośrednio przed pobraniem płynu. Bezpośrednio po wstrzyknięciu izotonicznego roztworu pacjent powinien 10 razy zgiąć i wyprostować kończynę w stawie, a następnie szybko odessać rozcieńczony płyn stawowy. Według EM-JA Thonar (2000) takie rozcieńczenie błony maziowej wpływa na metabolizm w chrząstce stawowej. Jednak wyniki badania FC Robiona i in. (2001) wskazują, że wielokrotne płukanie stawów kolanowych u koni nie powoduje istotnych zmian w metabolizmie chrząstki. Dane te z pewnością wymagają potwierdzenia. Dlatego dla każdego markera biologicznego wpływ płukania stawu na zmiany jego stężenia należy określić na etapie badań przedklinicznych na zwierzętach.

Kolejnym ważnym punktem jest określenie okresu półtrwania w płynie stawowym i krwi dla każdego markera biologicznego. Bez takich danych interpretacja wyników testu będzie trudna. Zazwyczaj okres półtrwania substancji biologicznie czynnych we krwi jest krótszy niż w innych płynnych mediach ze względu na skuteczne oczyszczanie przez wątrobę i nerki. Zatem dla każdego markera biologicznego konieczne jest również określenie ścieżki eliminacji. Zatem N-propeptyd kolagenu typu III jest wydalany przez wątrobę poprzez endocytozę zależną od receptora, a nieglikozylowane fragmenty kolagenu są wydalane głównie z moczem, podobnie jak osteokalcyna. Na komórkach śródbłonka zatok zrazików wątroby znajdują się receptory dla glikozaminoglikanów, więc kwas hialuronowy i proteoglikany są eliminowane przez wątrobę. Okres półtrwania kwasu hialuronowego we krwi wynosi 2-5 minut. Obecność zapalenia błony maziowej może przyspieszyć usuwanie markerów biologicznych ze stawów, chociaż badanie na królikach nie wykazało istotnych różnic w usuwaniu proteoglikanów z zapaleniem błony maziowej lub bez niego. Dlatego też należy zbadać wpływ stanu zapalnego na zmiany stężenia markerów biologicznych w płynach ustrojowych.

Nerki selektywnie filtrują markery biologiczne. W ten sposób glikozaminoglikany, które mają duży ładunek ujemny, mogą nie przenikać przez błonę podstawną nerek, podczas gdy glikozaminoglikany, takie jak siarczan chondroityny-6 i siarczan chondroityny-4, są wykrywane w moczu.

Oprócz patologii (w szczególności choroby zwyrodnieniowej stawów) na stężenie markerów biologicznych w płynach ustrojowych może wpływać szereg czynników:

1. Rytmy dobowe badano tylko dla niewielkiej liczby markerów biologicznych. Badano je pod kątem markerów metabolizmu kości. Tak więc szczytowe stężenie osteokalcyny występuje w nocy, a szczytowe stężenie wiązań poprzecznych kolagenu rano - o godzinie 8. W reumatoidalnym zapaleniu stawów szczytowa aktywność IL-6 występuje również w nocy (około godziny 2) i wcześniej niż osteokalcyna. Dane te są interesujące w odniesieniu do udziału IL-6 w zapaleniu i fizjologii tkanki kostnej. TNF-a natomiast nie ma rytmów dobowych. Jednak receptory tej cytokiny mogą im podlegać.
2. Perystaltyka. Kwas hialuronowy jest syntetyzowany przez komórki błony maziowej (jak również przez wiele innych komórek) i jest potencjalnym markerem zapalenia błony maziowej w chorobie zwyrodnieniowej stawów i reumatoidalnym zapaleniu stawów. Jednak najwyższe stężenie hialuronianu występuje w układzie limfatycznym jelit. Nic dziwnego, że stężenie krążącego kwasu hialuronowego może wzrosnąć po jedzeniu. Dlatego pobieranie próbek krwi w celu określenia markerów biologicznych powinno odbywać się na czczo lub 3 godziny po jedzeniu. A wpływ perystaltyki na poziom markerów biologicznych we krwi wymaga zbadania.
3. Aktywność fizyczna rano po śnie prowadzi do wzrostu stężenia kwasu hialuronowego we krwi, MMP-3 i epitopu siarczanu keratanu u zdrowych osób. Aktywność fizyczna może zmieniać stężenie niektórych markerów zarówno w płynie stawowym, jak i w surowicy krwi. Taki wzrost jest bardziej wyraźny u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów, ponadto stężenie markerów biologicznych koreluje ze stanem klinicznym tych pacjentów.
4. Choroby wątroby i nerek. Marskość wątroby powoduje znaczny wzrost stężenia kwasu hialuronowego w surowicy i prawdopodobnie wpływa na eliminację proteoglikanów. Wiadomo, że choroby nerek wpływają na stężenia osteokalcyny. Ta kwestia wymaga również bardziej dogłębnych badań.
5. Wiek i płeć. Podczas wzrostu wzrasta aktywność komórek płytki wzrostowej, czemu towarzyszy wzrost stężenia biologicznych markerów szkieletowych w surowicy krwi. Przykładem jest wzrost stężenia fragmentów agrekanu i kolagenu typu II we krwi obwodowej i moczu rosnących zwierząt. Stąd interpretacja analiz markerów biologicznych u dzieci i młodzieży z chorobami układu mięśniowo-szkieletowego jest trudna. W przypadku wielu markerów biologicznych stwierdzono wzrost stężenia wraz z wiekiem. U mężczyzn stężenie markerów biologicznych znacznie przewyższa stężenie u kobiet w tkance chrzęstnej i kostnej. Ponadto u kobiet w okresie menopauzy i pomenopauzalnym można spodziewać się zmian w stężeniu markerów biologicznych metabolizmu chrząstki, podobnych do tych obserwowanych w tkance kostnej.
6. Zabiegi chirurgiczne mogą również wpływać na poziom markerów biologicznych, a efekt ten może utrzymywać się przez kilka tygodni.

Koncepcja biologicznych markerów osteoartrozy opiera się na założeniu, że odzwierciedlają one pewne aspekty procesów metabolicznych w tkankach stawowych. Jednakże związek między stężeniami biologicznych markerów w płynach ustrojowych a metabolizmem chrząstki, błony maziowej i innych tkanek okazał się bardzo złożony.

Przykładowo stężenie markerów degradacji ECM chrząstki stawowej w płynie stawowym może zależeć nie tylko od stopnia degradacji samej macierzy, ale także od innych czynników, takich jak stopień eliminacji fragmentów molekularnych z błony maziowej, o czym wspomniano powyżej, a także od ilości tkanki chrzęstnej pozostałej w stawie.

Pomimo powyższych faktów, stężenie markerów biologicznych w płynie stawowym ogólnie koreluje z metabolizmem cząsteczek ECM chrząstki stawowej. Na przykład zmiany w stężeniu fragmentów agrekanu, epitopu 846, COMB i C-propeptydu kolagenu II w płynie stawowym po urazie stawu i podczas rozwoju osteoartrozy są zgodne ze zmianami w intensywności metabolizmu agrekanu, COMB i kolagenu II w eksperymentalnych modelach osteoartrozy u zwierząt/i in vivo oraz w chrząstce stawowej pacjentów z osteoartrozą/i in vitro.

Identyfikacja konkretnych źródeł fragmentów molekularnych jest złożonym procesem. Zwiększone uwalnianie fragmentów molekularnych może nastąpić zarówno z powodu ogólnego wzrostu procesów degradacji, które nie są kompensowane przez procesy syntezy, jak i z powodu zwiększonej degradacji przy jednoczesnym wzroście intensywności syntezy tych samych cząsteczek ECM; w drugim przypadku stężenie cząsteczek ECM nie ulega zmianie. Dlatego konieczne jest poszukiwanie markerów specyficznych dla degradacji i syntezy. Przykładem pierwszych są fragmenty agrekanu, a drugim jest C-propeptyd kolagenu 11.

Nawet jeśli marker biologiczny jest związany ze specyficznym aspektem metabolizmu, konieczne jest uwzględnienie specyficznych cech tego procesu. Na przykład zidentyfikowane fragmenty mogą powstawać w wyniku degradacji de novo syntetyzowanej cząsteczki, która nie została jeszcze zintegrowana z funkcjonalną ECM, cząsteczki, która właśnie została zintegrowana z ECM, i wreszcie trwałej cząsteczki ECM, która jest ważną funkcjonalną częścią dojrzałej macierzy. Innym problemem jest definicja specyficznej strefy macierzy (matrycy okołokomórkowej, terytorialnej i międzyterytorialnej), która służyła jako źródło markerów biologicznych wykrywanych w płynie stawowym, krwi lub moczu. Badania in vitro wskazują, że intensywność metabolizmu w poszczególnych strefach ECM chrząstki stawowej może być różna. Badanie niektórych epitopów związanych z siarkowaniem siarczanu chondroityny może pomóc w zidentyfikowaniu populacji de novo syntetyzowanych cząsteczek agrekanu.

Można założyć, że pojawienie się fragmentów cząsteczek normalnie obecnych w chrząstce ECM w płynie stawowym jest związane z metabolizmem macierzy chrząstki. Jednak nie zawsze tak jest, ponieważ zależy to od szeregu czynników, w szczególności od tego, o ile stężenie danej cząsteczki w chrząstce stawowej przewyższa stężenie w innych tkankach stawowych i o ile intensywność jej metabolizmu w chrząstce przewyższa stężenie w innych tkankach stawowych. Tak więc całkowita masa agrekanu w chrząstce stawowej znacznie przewyższa masę na przykład w łąkotce stawu kolanowego, podczas gdy całkowita masa COMB w łąkotce praktycznie nie różni się od masy w chrząstce stawowej. Zarówno chondrocyty, jak i synowocyty wytwarzają stromelizynę-1, ale całkowita liczba komórek w błonie maziowej przewyższa liczbę komórek w chrząstce, więc znaczna część stromelizyny-1 znajdującej się w płynie stawowym jest najprawdopodobniej pochodzenia maziowego. W związku z tym identyfikacja konkretnego źródła markerów biologicznych jest niezwykle trudna, a często wręcz niemożliwa.

Podczas badania markerów biologicznych w surowicy krwi i moczu pojawia się problem określenia ich potencjalnego pozastawowego źródła. Ponadto w przypadku uszkodzenia jednostawowego markery biologiczne wydzielane przez dotknięty chorobą staw mogą mieszać się z markerami wydzielanymi przez nieuszkodzone stawy, w tym stawy przeciwległe. Chrząstka stawowa stanowi mniej niż 10% całkowitej masy chrząstki szklistej w organizmie. Oznaczanie markerów biologicznych we krwi i moczu może być zatem uzasadnione raczej w chorobach wielostawowych, czyli układowych (w odniesieniu do osteoartrozy - w osteoartrozie uogólnionej).

Wymagania dotyczące markerów biologicznych zależą od tego, czy są one stosowane jako test diagnostyczny, prognostyczny czy ewaluacyjny. Na przykład test diagnostyczny określa różnice między zdrowymi osobami a pacjentami z chorobą zwyrodnieniową stawów, co wyraża się w czułości i swoistości testu. Test prognostyczny identyfikuje osoby w kohorcie, u których najprawdopodobniej nastąpi szybki postęp choroby. Wreszcie test ewaluacyjny opiera się na zdolności markera do monitorowania zmian w czasie u indywidualnego pacjenta. Ponadto markery biologiczne mogą być używane do określania wrażliwości pacjentów na konkretny lek.

Początkowo zakładano, że markery biologiczne mogą służyć jako testy diagnostyczne, które pomogą odróżnić staw dotknięty chorobą zwyrodnieniową stawów od stawu nieuszkodzonego, a także prowadzić diagnostykę różnicową z innymi chorobami stawów. Tak więc oznaczenie stężenia siarczanu keratanu w surowicy krwi uznano za test diagnostyczny uogólnionej choroby zwyrodnieniowej stawów. Jednak późniejsze badania wykazały, że ten marker biologiczny może odzwierciedlać degradację proteoglikanów chrząstki tylko w niektórych sytuacjach. Okazało się, że stężenia markerów biologicznych w surowicy krwi zależą od wieku i płci badanej osoby.

Przypuszczalne markery biologiczne metabolizmu tkanki stawowej w płynie stawowym i surowicy krwi u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów

Marker biologiczny	Proces	W płynie stawowym (linki)	W surowicy krwi (linki)
1. Chrząstka
Agrekański
Fragmenty rdzeniowego białka	Degradacja Aggrekanu	Lohmander LS. i in., 1989; 1993	Thonar EJMA i in., 1985; Campion GV i wsp., 1989; Mehraban F. i in., 1991; Spector TD i in., 1992; Lohmander LS., Thonar EJ-MA, 1994; Poole AR i in., 1994) t (Poole AR i in., 1994)
Epitopy rdzeniowego białka (neoepitopy specyficzne dla strefy rozszczepienia)	Degradacja Aggrekanu	Sandy JD i in., 1992; LohmanderLS. i in., 1993; LarkM.W. i in., 1997
Epitopy siarczanów keratonowych	Degradacja Aggrekanu	Campion GV i in., 1989; Belcher C i in., 1997
Epitopy siarczanów chondroityny (846, ЗВЗ, 7D4 i DR.)	Synteza/degradacja agrekanu	Poole AR i wsp., 1994; HazellP.K. i in., 1995; Slater RR Jr. i wsp., 1995; Plaas AHK i in., 1997; 1998; Lohmander LS. i in., 1998
Stosunek siarczanów chondroityny-6 i chondroityny-4	Synteza/degradacja agrekanu	Shinme iM. i in. 1993
Małe proteoglikany	Degradacja małych proteoglikanów	Witsch-PrehmP. i in., 1992
Białka macierzy chrząstki
SKOK	Degradacja HOMP	Saxne T., Heinegerd D., 1992”; LohmanderLS. i in., 1994; Petersson IF i in., 1997	Sharif M. i in., 1995
Kolageny chrząstki
C-propeptyd kolagenu typu II	Synteza kolagenu II	ShinmeiM. i in., 1993; YoshiharaY. i in., 1995; LohmanderLS. i in., 1996
Fragmenty łańcucha alfa kolagenu typu II	Degradacja kolagenu II	Hollander AP i in., 1994; Billinghurst RC i in., 1997; AtleyLM. i in., 1998
MMP i ich inhibitory	Synteza i wydzielanie	Z błony maziowej czy chrząstki stawowej?
II. Łąkotki
SKOK	Degradacja HOMP	Z chrząstki stawowej, łąkotki czy błony maziowej?
Małe proteoglikany	Degradacja małych proteoglikanów
III. Błona maziowa
Kwas hialuronowy	Synteza kwasu hialuronowego		Goldberg RL i in., 1991; Hedin P.-J. i in., 1991; Sharif M. i in., 1995
MMP i ich inhibitory
Stromelizyna (MMP-3)	Synteza i wydzielanie MMP-3	LohmanerLS i in., 1993	ZuckerS. i in., 1994; YoshiharaY. i in., 1995
Kolagenaza śródmiąższowa (MMP-1)	Synteza i wydzielanie MMP-1	Clark IM i in., 1993; LohmanderLS i in., 1993	Manicourt DH i in., 1994
TIMP	Synteza i wydzielanie TIMP	Lohmander LS. i in., 1993; Manicourt DH i wsp., 1994	Yoshihara Y. i in., 1995
N-propeptyd kolagenu typu III	Synteza/degradacja kolagenu III	Sharif M. i in., 1996	Sharif M. i in., 1996

Wiele badań wykazało różnice w stężeniach fragmentów agrekanu, HOMP i MMP oraz ich inhibitorów w płynie stawowym stawów kolanowych zdrowych ochotników, pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów, reaktywnym zapaleniem stawów lub chorobą zwyrodnieniową stawów. Pomimo faktu, że autorzy wykazują istotne różnice w średnich stężeniach markerów biologicznych, interpretacja danych jest trudna, ponieważ analiza porównawcza miała charakter profilowy i retrospektywny. Właściwości prognostyczne tych testów muszą zostać potwierdzone w badaniach prospektywnych.

Markery biologiczne mogą być używane do oceny ciężkości choroby lub stopnia zaawansowania procesu patologicznego. W przypadku osteoartrozy ciężkość choroby i jej stadia ocenia się na podstawie wyników badań rentgenowskich, artroskopii, a także ciężkości zespołu bólowego, ograniczenia funkcji dotkniętych stawów i wydolności funkcjonalnej pacjenta. L. Dahlberg i in. (1992) oraz T. Saxne i D. Heinegard (1992) zaproponowali wykorzystanie niektórych markerów molekularnych metabolizmu chrząstki stawowej w celu dodatkowej charakterystyki stadiów osteoartrozy. Jednak konieczne są dalsze badania w tym kierunku, aby wprowadzić takie markery biologiczne do praktyki medycznej.

Istnieją doniesienia o możliwym wykorzystaniu markerów biologicznych jako testów prognostycznych. Na przykład wykazano, że stężenie kwasu hialuronowego (ale nie siarczanu keratanu) w surowicy pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego na początku badania wskazuje na postęp choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego w ciągu 5 lat obserwacji. W tej samej populacji pacjentów wykazano, że zwiększona zawartość COMB w surowicy pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego w pierwszym roku po rozpoczęciu badania była związana z postępem radiograficznym w ciągu 5 lat obserwacji. Badania markerów biologicznych u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów wykazały, że stężenie COMB, epitopu 846, siarczanu chondroityny w surowicy jest związane z szybszym postępem choroby. Wyniki te, uzyskane w małych grupach pacjentów, często nie wykazują siły związku między poziomem markerów biologicznych a postępem choroby, tj. konieczne są dalsze badania, prospektywne i na większych kohortach pacjentów.

TD Spector i in. (1997) stwierdzili niewielki wzrost stężenia CRP w surowicy u pacjentów z wczesną chorobą zwyrodnieniową stawów i donieśli, że CRP może być czynnikiem prognostycznym postępu choroby zwyrodnieniowej stawów. W tym przypadku wzrost stężenia CRP odzwierciedla procesy uszkodzenia tkanki stawowej i może być związany ze wzrostem stężenia kwasu hialuronowego, co również wskazuje na postęp choroby. Możliwe, że błona maziowa odpowiada za większość kwasu hialuronowego oznaczanego w surowicy, co wskazuje na obecność łagodnego zapalenia błony maziowej. Zwiększone stężenia stromelizyny MMP w płynie stawowym i surowicy pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów i po urazie stawu mogą być również związane z łagodnym zapaleniem błony maziowej.

Wreszcie, markery biologiczne mogą być używane jako kryteria skuteczności w badaniach klinicznych leków, jak również do monitorowania leczenia patogenetycznego. Istnieją jednak dwa powiązane ze sobą problemy: brak leków o udowodnionych właściwościach „modyfikujących strukturę” lub „modyfikujących chorobę” wynika w dużej mierze z braku wiarygodnych markerów biologicznych i odwrotnie, brak specyficznych markerów metabolizmu tkanki stawowej wynika w dużej mierze z braku kontrolowanych badań leków w tych grupach.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]