Diagnostyka laboratoryjna gruźlicy

Gruźlica jest chorobą, którą łatwo zdiagnozować w nowoczesnych warunkach i osiągnięciach naukowych. Diagnostyka laboratoryjna gruźlicy zajmuje centralne miejsce wśród innych metod diagnostycznych, ustępując jedynie metodom badań rentgenowskich.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Badanie krwi klinicznej

U chorych na gruźlicę zmiany w ogólnym badaniu krwi nie są patognomoniczne. W ograniczonych i niskoaktywnych postaciach gruźlicy charakterystyczna jest hipochromia erytrocytów o prawidłowej liczbie. W masywnych naciekach lub serowatym zapaleniu płuc, przy rozległym serowatym zapaleniu węzłów chłonnych, specyficznym uszkodzeniu jelit, a także przy dużych krwotokach płucnych lub pooperacyjnych, obserwuje się erytropenię i mikrocytozę, oligochromazję, polichromazję. Makrocytoza, a zwłaszcza poikilocytoza, występują znacznie rzadziej, zwykle przy ciężkiej niedokrwistości. Liczba retikulocytów w skompensowanym stadium gruźlicy waha się od 0,1 do 0,6%, w stadium subkompensowanym - od 0,6 do 1,0%, a dla stadium dekompensowanego charakterystyczny jest 1% retikulocytów.

W niektórych przypadkach gruźlicy obserwuje się umiarkowaną leukocytozę (do 15 tys. leukocytów), rzadziej leukopenię, która występuje w 2-7% przypadków u chorych z ograniczoną i łagodną postacią procesu i w 12,5% przy niszczącej i postępującej gruźlicy płuc.

Najczęściej przesunięcia występują we wzorze leukocytów. Obserwuje się zarówno względną, jak i bezwzględną neutrofilię, umiarkowane przesunięcie we wzorze leukocytów w lewo w kierunku promielocytów. Mielocyty występują bardzo rzadko w przypadkach niepowikłanej gruźlicy. Wzrost liczby neutrofili o patologicznej ziarnistości w hemogramie pacjenta z gruźlicą zawsze wskazuje na czas trwania procesu: u pacjentów z ciężką gruźlicą prawie wszystkie neutrofile zawierają patologiczną ziarnistość. Gdy ognisko gruźlicy ustępuje, przesunięcie jądrowe stosunkowo szybko wraca do normy. Patologiczna ziarnistość neutrofili zwykle utrzymuje się dłużej niż inne zmiany w hemogramie.

Zawartość eozynofilów we krwi obwodowej również waha się w zależności od fazy procesu i stanu alergicznego organizmu. Ich liczba zmniejsza się do aneozynofili w ciężkich i przewlekłych zaostrzeniach choroby, a odwrotnie, wzrasta w czasie resorpcji nacieków i wysięku opłucnowego, a także we wczesnych postaciach gruźlicy pierwotnej.

Większości form gruźlicy pierwotnej towarzyszy limfopenia, którą czasami obserwuje się przez kilka lat, nawet po bliznowaceniu się określonych zmian. Gruźlicy wtórnej w fazie ostrej, w zależności od nasilenia procesu, może towarzyszyć albo normalna liczba limfocytów, albo limfopenia.

Wśród testów oceniających proces gruźlicy szczególne miejsce zajmuje określenie szybkości sedymentacji erytrocytów (OB), która jest ważna w ocenie przebiegu procesu gruźliczego i identyfikacji jego aktywnych form. Wzrost OB wskazuje na obecność procesu patologicznego (zakaźnego i zapalnego, ropnego, septycznego, hemoblastozy, limfogranulomatozy itp.) i służy jako wskaźnik jego ciężkości, ale prawidłowe wartości OB nie zawsze wskazują na brak patologii. Przyspieszenie sedymentacji erytrocytów ułatwia wzrost zawartości globulin, fibrynogenu, cholesterolu we krwi i spadek lepkości krwi. Spowolnienie sedymentacji erytrocytów jest charakterystyczne dla stanów, którym towarzyszy hemokoncentracja, wzrost zawartości albumin i kwasów żółciowych.

Hemogram chorych na gruźlicę zmienia się w trakcie leczenia. Im skuteczniejsza interwencja terapeutyczna, tym szybciej zanikają zmiany hematologiczne. Jednocześnie należy pamiętać o wpływie różnych leków przeciwbakteryjnych na hematopoezę. Często powodują one eozynofilię, w niektórych przypadkach - leukocytozę, a częściej leukopenię aż do agranulocytozy i reakcji limfoidalno-siatkowej. Systematyczne monitorowanie hematologiczne i prawidłowa analiza uzyskanych danych są niezbędne do oceny stanu klinicznego pacjenta, dynamiki procesu i skuteczności leczenia.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Analiza kliniczna moczu

W przypadku gruźlicy dróg moczowych, analiza moczu jest główną laboratoryjną metodą diagnostyczną. Można zaobserwować leukocyturię, erytrocyturię, białkomocz, hipoizostenurię, gruźliczą mykobakteriurię, nieswoistą bakteriurię.

Leukocyturia jest najczęstszym objawem gruźlicy dróg moczowych przed chemioterapią swoistą i nie występuje tylko w wyjątkowych przypadkach, takich jak całkowite zarośnięcie światła moczowodu. Test Nechiporenko (określenie liczby leukocytów w 1 ml moczu) pomaga bardziej obiektywnie ocenić stopień leukocyturii w nefrotuberkulozie, a w niektórych przypadkach wykryć ją przy normalnej ogólnej analizie moczu. Należy jednak wziąć pod uwagę, że leukocyturia może wystąpić w ostrym i przewlekłym odmiedniczkowym zapaleniu nerek, zapaleniu pęcherza moczowego, zapaleniu cewki moczowej, kamieniach nerkowych i moczowodach.

Erytrocyturia, podobnie jak leukocyturia, jest uważana za jeden z najczęstszych objawów laboratoryjnych gruźlicy układu moczowo-płciowego. Częstotliwość występowania krwiomoczu zależy od częstości występowania procesu; wzrasta ona w miarę rozwoju niszczącego procesu gruźliczego w nerce. Erytrocyturia bez leukocyturii jest bardziej typowa dla wczesnych stadiów gruźlicy nerek. Krwiomocz, przeważający nad leukocyturią, jest ważnym argumentem na rzecz gruźlicy nerek przy różnicowaniu jej z nieswoistym odmiedniczkowym zapaleniem nerek.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Badanie biochemiczne krwi

W gruźlicy zmiany niektórych wskaźników biochemicznych zależą przede wszystkim od fazy procesu, powikłań i różnych chorób współistniejących. U chorych z nieaktywną gruźlicą płuc i innych narządów całkowite białko i frakcje białkowe surowicy krwi nie ulegają zmianie i określają ich prawidłową zawartość.

W ostrych postaciach choroby, a także w zaostrzeniu i postępie przewlekłych postaci gruźlicy, współczynnik albuminy-globuliny ulega obniżeniu.

Istotne znaczenie w ocenie stanu czynnościowego i uszkodzeń organicznych wątroby w gruźlicy i jej powikłaniach ma oznaczanie bilirubiny bezpośredniej i całkowitej, aminotransferazy asparaginianowej (AST), aminotransferazy alaninowej (ALT) w surowicy krwi. Dynamiczne oznaczanie poziomu aminotransferaz. Bilirubina w leczeniu chorych na gruźlicę, zwłaszcza w jej ciężkich postaciach, jest obowiązkowym składnikiem badania biochemicznego chorych na gruźlicę i jest przeprowadzane co miesiąc.

Ocena stanu czynnościowego nerek obejmuje oznaczenie stężenia kreatyniny w surowicy i obliczenie współczynnika filtracji kłębuszkowej za pomocą wzoru Cockcrofta-Gaulta. Obliczenie współczynnika filtracji kłębuszkowej za pomocą testu Reberga daje mniej dokładne wyniki.

Głównym celem dynamicznych badań biochemicznych u chorych na gruźlicę jest monitorowanie przebiegu procesu, terminowe wykrywanie działań niepożądanych leków i odpowiednia korekcja powstających zaburzeń homeostazy.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Zastosowanie metod badawczych biochemicznych w gruźlicy pozapłucnej

Za najbardziej informatywny wskaźnik uważa się zawartość kwasu tuberkulostearynowego w płynach biologicznych, jednak jego oznaczenie wiąże się z trudnościami technicznymi (konieczność wykorzystania chromatografii gazowej i spektrometrii mas).

Obiecujące jest zmierzenie aktywności deaminazy adenozyny - enzymu oznaczanego w płynach: maziowym, osierdziowym, otrzewnowym lub mózgowo-rdzeniowym. Głównymi producentami deaminazy adenozyny są limfocyty i monocyty. Oznaczanie aktywności deaminazy adenozyny w płynach biologicznych ułatwia diagnostykę gruźliczego zapalenia błony maziowej, gruźlicy węzłów chłonnych, gruźliczego zapalenia opon mózgowych, gruźliczego zapalenia błon surowiczych.

Niektóre wskaźniki biochemiczne, ze względu na ich niespecyficzność, są oznaczane tylko w płynach biologicznych znajdujących się w pobliżu zmiany chorobowej. Poziom wskaźników mierzony jest w odpowiedzi na podskórne lub śródskórne podanie tuberkulinu (zwykle przed podaniem oraz 48 i 72 godziny po nim). Następnie oblicza się stopień wzrostu poziomu markera (w %) w stosunku do poziomu początkowego.

Optymalnie aktywność narządowo-specyficznego enzymu transamidynazy oznacza się w moczu; jego występowanie odnotowuje się w uszkodzeniach nerek różnego pochodzenia. Badanie transamidynazy jest uzasadnione tylko w warunkach podskórnego podania tuberkuliny w celu zaostrzenia miejscowego procesu zapalnego. Aktywność transamidynazy oznacza się w moczu początkowo i 24-72 godziny po podaniu 50 TE tuberkuliny. Wzrost fermenturii o 2 lub więcej razy pozwala w 82% przypadków odróżnić aktywną gruźlicę nerek od zaostrzenia przewlekłego odmiedniczkowego zapalenia nerek.

W przypadku gruźlicy żeńskich narządów płciowych stężenia haptoglobiny i malondialdehydu we krwi oznacza się w warunkach prowokacyjnej próby tuberkulinowej. Tuberkulinę podaje się podskórnie w dawce 50 TE, a powtórne badanie biochemiczne wykonuje się po 72 godzinach. W przypadku etiologii gruźliczej stopień wzrostu poziomu haptoglobiny wynosi co najmniej 28%, a poziom malondialdehydu wynosi 39% lub więcej. Stosuje się również oznaczenie aktywności deaminazy adenozyny w płynie otrzewnowym pobranym z kieszonki Douglasa. Nakłucie bada się ponownie 72 godziny po śródskórnym podaniu tuberkuliny w dawkach 0,1 TE i 0,01 TE w okolicy projekcji wewnętrznych narządów płciowych na przednią ścianę jamy brzusznej. Wzrost aktywności deaminazy adenozyny o 10% lub więcej w porównaniu do wartości początkowej świadczy o procesie gruźliczym.

W przypadku uszkodzenia oka bada się reakcję ogniskową zachodzącą w oku w odpowiedzi na stymulację antygenem. W tym przypadku niepożądany jest rozwój ostro wyrażonej reakcji z towarzyszącym spadkiem funkcji wzrokowych. Ponieważ ocena minimalnych reakcji ogniskowych jest często trudna, zaleca się równoległe skupienie się na stopniu wzrostu haptoglobiny lub deaminazy adenozyny w surowicy krwi, aby zobiektywizować wniosek.

Wszystkie badania biochemiczne należy przeprowadzać w połączeniu z innymi metodami.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Badanie układu krzepnięcia krwi

Znaczenie badania stanu układu krzepnięcia krwi w ftyzjologii wynika z obecności krwioplucia lub krwotoków płucnych u wielu pacjentów z gruźlicą płuc, a także powikłań hemokoagulacji w leczeniu operacyjnym gruźlicy. Ponadto naturalnie towarzysząca utajona wewnątrznaczyniowa hemokoagulacja wpływa na przebieg choroby i skuteczność chemioterapii.

U chorych na gruźlicę płuc z dominującym wysiękowym składnikiem zapalenia obserwuje się spadek aktywności przeciwzakrzepowej krwi. U chorych z niską częstością występowania swoistych uszkodzeń płuc z dominującym wytwórczym składnikiem zapalenia wewnątrznaczyniowa hemokoagulacja jest wyrażona nieznacznie. U chorych na gruźlicę płuc z krwiopluciem i krwotokami płucnymi stan układu krzepnięcia krwi jest inny: u chorych z niewielką utratą krwi na wysokości krwioplucia lub bezpośrednio po jego ustaniu obserwuje się gwałtowny wzrost zdolności krzepnięcia krwi z powodu wyraźnego nasilenia procesów powstawania trombiny przy zachowaniu zwiększonej „strukturalnej” krzepliwości. U chorych z masywną utratą krwi obserwuje się spadek potencjału krzepnięcia z powodu zmniejszenia stężenia fibrynogenu, aktywności czynnika XIII i liczby płytek krwi. Na etapie leczenia operacyjnego u chorych z ograniczonymi postaciami gruźlicy płuc nie występują istotne zaburzenia układu homeostazy. U chorych z rozległymi procesami, przy wykonywaniu pneumonektomii lub pleuropneumonektomii, często rozwija się zespół DIC, który może przybrać postać „drugiej choroby”.

W celu monitorowania stanu układu krzepnięcia krwi u chorych na gruźlicę płuc konieczne jest oznaczanie czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT), fibrynogenu, czasu trombinowego, wskaźnika protrombinowego, a także czasu krwawienia i czasu krzepnięcia krwi.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Badania hormonalne

Współczesne obserwacje eksperymentalne i kliniczne wskazują na obecność zmian w stanie hormonalnym w specyficznym zapaleniu gruźliczym płuc. Udowodniono, że korekcja dysfunkcji układów przysadkowo-nadnerczowego, przysadkowo-tarczycowego i funkcji trzustki w połączeniu z terapią przeciwgruźliczą przyczynia się do aktywacji procesów fibrogenezy i naprawy w ognisku specyficznego zapalenia.

Stan czynnościowy układu przysadkowo-tarczycowego ocenia się na podstawie zawartości trójjodotyroniny (T3), tyroksyny (T4) i przysadkowego hormonu tyreotropowego (TSH) w surowicy krwi _. Ustalono _, że subkliniczną niedoczynność tarczycy wykrywa się u 38-45% chorych na gruźlicę płuc, a najczęściej diagnozuje się ją w rozsianej i włóknisto-jamistej postaci procesu. W tych postaciach poziomy zarówno T3, jak i T4 są najbardziej obniżone _, a _{nierównowaga} tych hormonów występuje w postaci wzrostu stosunku _T4/ T3.

Funkcję kory nadnerczy ocenia się na podstawie stężenia kortyzolu w surowicy, a funkcję endokrynną trzustki na podstawie stężenia immunoreaktywnej insuliny. W ostrej fazie choroby zakaźnej wzrasta zapotrzebowanie na endogenny kortyzol i insulinę. Hiperinsulinemia wskazuje również na insulinooporność tkanek organizmu, co jest typowe dla każdego aktywnego procesu zapalnego, w szczególności specyficznego. Oznaczenie funkcji glikokortykoidowej nadnerczy w aktywnej gruźlicy płuc pozwala wykryć obecność hiperkortycyzmu u większości pacjentów. Prawidłowe stężenia kortyzolu we krwi u pacjenta z infekcyjnym zapaleniem w okresie ostrym należy traktować jako względną niewydolność funkcji glikokortykoidowej kory nadnerczy, co może służyć jako podstawa do terapii zastępczej odpowiednimi dawkami glikokortykoidów.

Prawie jedna trzecia chorych na gruźlicę płuc ma niski poziom insulinemii, zbliżający się do dolnej granicy normy, podczas gdy 13-20% ma znaczny hiperinsulinizm. Zarówno względny hipo-, jak i hiperinsulinizm są czynnikami wysokiego ryzyka rozwoju zaburzeń metabolizmu węglowodanów o różnym nasileniu. Te zmiany w czynnościowej aktywności komórek B trzustki wymagają regularnego monitorowania glikemii u chorych na gruźlicę i terminowej profilaktyki cukrzycy. Ponadto stanowi to dodatkowe uzasadnienie zasadności stosowania fizjologicznych dawek insuliny w złożonej terapii gruźlicy.

Ogólnie rzecz biorąc, obniżenie poziomu hormonów tarczycy, ich zaburzenie, hiperkortyzolemia i hiperinsulinizm są najbardziej widoczne u chorych z ciężkim przebiegiem procesu gruźliczego, z rozległymi zmianami w płucach i wyraźnymi objawami zatrucia gruźliczego.

Diagnostyka mikrobiologiczna gruźlicy

Badania mikrobiologiczne są niezbędne do identyfikacji chorych na gruźlicę, weryfikacji rozpoznania, monitorowania i korygowania chemioterapii, oceny wyników leczenia, innymi słowy od momentu rejestracji pacjenta chorego na gruźlicę do momentu skreślenia go z rejestru.

Wszystkie programy i projekty epidemiologiczne opierają się na ocenie liczby bakterii wydalających, co jest niemożliwe bez stosowania laboratoryjnych metod wykrywania prątków gruźlicy. Przy badaniu atrakcyjności tzw. niezorganizowanej populacji odsetek bakterii wydalających sięga 70 i więcej, co sprawia, że metody laboratoryjne są dość skutecznym środkiem identyfikacji chorych na gruźlicę wśród tej grupy populacji.

Tradycyjne mikrobiologiczne metody diagnozowania gruźlicy to badania bakterioskopowe i kulturowe. Nowoczesne metody obejmują hodowlę prątków gruźlicy w systemach zautomatyzowanych i PCR. Jednak wszystkie te metody są koniecznie łączone z klasycznymi metodami bakteriologicznymi.

Pobieranie materiału diagnostycznego

Skuteczność badań laboratoryjnych w dużej mierze zależy od jakości materiału diagnostycznego. Przestrzeganie zasad pobierania, przechowywania i transportu materiału diagnostycznego oraz precyzyjne wykonanie algorytmu badania pacjenta bezpośrednio wpływa na wynik i zapewnia bezpieczeństwo biologiczne.

Do badania na gruźlicę stosuje się różnorodne materiały. Ponieważ gruźlica płuc jest najczęstszą postacią zakażenia gruźliczego, za główny materiał do badania uważa się plwocinę i inne rodzaje wydzieliny z drzewa tchawiczo-oskrzelowego: wydzielinę z górnych dróg oddechowych uzyskaną po inhalacji aerozolu: wody z płukania oskrzeli; płukania oskrzelowo-pęcherzykowe; materiał uzyskany podczas bronchoskopii, biopsji przeztchawkowej i śródpłucnej: aspirat oskrzelowy, rozmazy krtaniowe, wysięki, rozmazy z ran itp.

Skuteczność badań wzrasta, jeśli przeprowadza się kontrolowane pobieranie materiału od pacjenta. W tym celu przydziela się specjalnie wyposażone pomieszczenie lub kupuje się specjalne kabiny. Pobieranie materiału jest niebezpieczną procedurą, dlatego materiał do badań musi być pobierany zgodnie z zasadami bezpieczeństwa zakażeń.

Materiał do badań na obecność Mycobacterium tuberculosis pobiera się do sterylnych fiolek z szczelnie zakręconymi zakrętkami, aby zapobiec skażeniu środowiska i chronić pobrany materiał przed zanieczyszczeniem.

Fiolki do pobierania materiału diagnostycznego muszą spełniać następujące wymagania:

• muszą być wykonane z materiału odpornego na uderzenia;
• powinien łatwo topić się w autoklawie;
• mieć wystarczającą objętość (40-50 ml):
• posiadać szeroki otwór do zbierania plwociny (średnica nie mniejsza niż 30 mm);
• być łatwe w obsłudze, przezroczyste lub półprzezroczyste, tak aby można było ocenić ilość i jakość pobranej próbki bez otwierania pokrywy.

Aby uzyskać optymalne wyniki badań, muszą być spełnione następujące warunki:

• pobranie materiału powinno zostać przeprowadzone przed rozpoczęciem chemioterapii;
• materiał do badania należy pobrać rano, przed jedzeniem lub zażywaniem leków;
• Do badania zaleca się pobranie co najmniej 3 próbek plwociny rano. Plwocinę pobiera się przez 3 kolejne dni;
• Zebrany materiał musi zostać dostarczony do laboratorium możliwie jak najszybciej:
• w przypadkach, gdy nie jest możliwe natychmiastowe dostarczenie materiału do laboratorium, przechowuje się go w lodówce w temperaturze powietrza 4 °C nie dłużej niż 48 godzin;
• Podczas transportu materiału należy zwrócić szczególną uwagę na integralność butelek.

Prawidłowo zebrana plwocina ma charakter śluzowy lub śluzowo-ropny. Optymalna objętość badanej porcji plwociny wynosi 3-5 ml.

Plwocina jest zbierana pod nadzorem pracownika służby zdrowia. Osoby odpowiedzialne za zbieranie plwociny muszą upewnić się, że przestrzegane są pewne zasady:

• Należy wyjaśnić pacjentowi cel badania i konieczność odkrztuszania nie śliny lub śluzu nosogardłowego, lecz zawartości głębokich odcinków dróg oddechowych. Można to osiągnąć dzięki kaszlowi produktywnemu, który występuje po kilku (2-3) głębokich oddechach. Należy również uprzedzić pacjenta, że musi najpierw przepłukać usta przegotowaną wodą, aby usunąć główną część mikroflory zalegającej w jamie ustnej oraz resztki pokarmu, które utrudniają badanie plwociny;
• Pracownik medyczny zajmujący się zbieraniem plwociny, oprócz fartucha i czepka, musi nosić maskę, gumowe rękawiczki i gumowy fartuch;
• stojąc za pacjentem, zaleca się mu trzymanie butelki jak najbliżej ust i natychmiastowe odkrztuszanie plwociny, kierując do niej strumień powietrza, z dala od pracownika służby zdrowia:
• Po zakończeniu zbierania plwociny pracownik służby zdrowia powinien ostrożnie zamknąć butelkę pokrywką i ocenić ilość i jakość zebranej plwociny. Następnie butelka jest etykietowana i umieszczana w specjalnym pudełku w celu transportu do laboratorium.

Jeśli pacjent nie wydziela plwociny, to w nocy przed badaniem i wczesnym rankiem w dniu pobrania materiału należy podać mu środek wykrztuśny: wyciąg z korzenia prawoślazu (mucaltin), bromheksynę, ambroksol itp. - lub zastosować drażniącą inhalację, wykorzystując sprzęt zainstalowany w pomieszczeniu do pobierania plwociny. Materiał pobrany w ten sposób nie podlega konserwacji i należy go zbadać w dniu pobrania. Aby uniknąć jego „odrzucenia” w laboratorium, należy umieścić na skierowaniu specjalną adnotację.

Jeżeli w danej placówce nie wykonuje się badań mikrobiologicznych, zebrany materiał diagnostyczny musi zostać dostarczony do laboratorium centralnie, pod warunkiem, że materiał jest przechowywany w lodówce lub z konserwantami pomiędzy dostawami. Materiał jest dostarczany do laboratorium w pudełkach transportowych, które można łatwo zdezynfekować. Każda próbka musi być opatrzona odpowiednią etykietą, a cała partia musi mieć wypełniony formularz towarzyszący.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Sposoby i częstotliwość badania pacjentów

Podczas wstępnego, tzw. diagnostycznego badania pacjenta w kierunku gruźlicy, konieczne jest zbadanie co najmniej 3 porcji plwociny pobranej pod nadzorem personelu medycznego w ciągu 2-3 dni, co zwiększa skuteczność badania mikroskopowego.

Podstawowe badania przesiewowe w kierunku gruźlicy powinny być przeprowadzane przez wszystkie placówki medyczne i diagnostyczne systemu opieki zdrowotnej. Ostatnio, w celu zwiększenia skuteczności badań podstawowych, na bazie laboratoriów diagnostyki klinicznej zorganizowano tzw. centra mikroskopowe, wyposażone w nowoczesne mikroskopy i sprzęt zapewniający bezpieczeństwo epidemiologiczne.

Placówki przeciwgruźlicze stosują schemat badań ankietowych, który przewiduje co najmniej 3-krotne badanie plwociny lub innego materiału diagnostycznego w ciągu 3 dni. Podczas leczenia badania mikrobiologiczne przeprowadza się regularnie co najmniej raz w miesiącu w fazie intensywnej chemioterapii. Przechodząc do fazy obserwacji, badania przeprowadza się rzadziej – w odstępach 2-3 miesięcy, przy czym częstotliwość badań zmniejsza się do dwóch.

Charakterystyka pobierania materiału diagnostycznego w kierunku gruźlicy pozapłucnej

Cechą materiału patologicznego w pozapłucnych postaciach gruźlicy jest niskie stężenie w nim prątków gruźlicy, co wymaga stosowania bardziej czułych metod badań mikrobiologicznych, przede wszystkim metody wysiewu na pożywkę.

W przypadku gruźlicy układu moczowo-płciowego mocz jest najbardziej dostępnym materiałem do badania. Pobieranie moczu powinno być wykonywane przez specjalnie przeszkoloną pielęgniarkę.

Zewnętrzne narządy płciowe myje się wodą z mydłem lub słabym roztworem nadmanganianu potasu. Ostrożnie oczyszcza się zewnętrzny otwór cewki moczowej. Środkową część porannego moczu zbiera się do sterylnej butelki: u mężczyzn - naturalnie, u kobiet - za pomocą cewnika. Mocz z miedniczki nerkowej zbiera się do sterylnych probówek podczas cewnikowania jednej lub dwóch nerek, w tym ostatnim przypadku - koniecznie oddzielnie z każdej nerki. Niewielką ilość tego moczu odwirowuje się, bada się osad.

U mężczyzn plemniki, nakłucia jąder i wydzieliny prostaty są wirowane w celu uzyskania osadu. Przy każdej lokalizacji określonego procesu w okolicy narządów płciowych u mężczyzn masaż prostaty może promować uwalnianie wydzielin zawierających prątki gruźlicy.

Krew menstruacyjną pobiera się od kobiet przez odsysanie lub za pomocą czepka Kafki. Uzyskany materiał uwalnia się od erytrocytów przez przemycie go wodą destylowaną, a następnie odwirowanie. Osad jest badany.

Wydzielinę z kanału szyjki macicy zbiera się do jakiegoś pojemnika lub kapturka Kafki, tzn. pożądane jest, aby zebrało się 1-2 ml materiału patologicznego.

Materiał pobrany podczas zabiegów chirurgicznych na nerkach, narządach płciowych, biopsjach, zeskrobinach endometrium, jest homogenizowany. W tym celu umieszcza się go w jałowym moździerzu i dokładnie rozdrabnia jałowymi nożyczkami. Do powstałej zawiesiny dodaje się jałowy piasek rzeczny w ilości równej jego masie, następnie dodaje się 0,5-1,0 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu i wszystko rozdrabnia się do uzyskania papkowatej masy z dodatkiem izotonicznego roztworu chlorku sodu (4-5 ml). Następnie masę pozostawia się do opadnięcia na 1-1,5 minuty, bada się supernatant.

Gruźlica kości i stawów. Nakłucie (ropa z ropni) pobrane jałową strzykawką umieszcza się w jałowym pojemniku i natychmiast dostarcza do laboratorium. Za pomocą jałowej pipety, uprzednio zwilżonej jałowym izotonicznym roztworem chlorku sodu, pobiera się 2-5 ml ropy, przenosi do butelki z kulkami i dodaje kolejne 2-3 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu. Butelkę zamyka się korkiem i wstrząsa w shakerze przez 8-10 minut. Bada się zhomogenizowaną zawiesinę.

W przetokowych postaciach gruźlicy kostno-stawowej, ropa jest pobierana z przetoki. Obfita wydzielina jest zbierana bezpośrednio do probówki. W przypadkach skąpego wycieku ropy, kanał przetoki jest przemywany jałowym izotonicznym roztworem chlorku sodu, a popłuczyny zebrane w probówce lub kawałku tamponu nasączonym ropą są wysyłane do badania.

Materiał chirurgiczny uzyskany podczas zabiegów chirurgicznych na kościach i stawach może składać się z mas ropno-martwiczych, ziarnin, tkanki bliznowatej, tkanki kostnej, tkanki błony maziowej i innych substratów. Jego przetwarzanie odbywa się tak jak w przypadku gruźlicy nerek.

Bezpośrednio po nakłuciu wykonuje się badanie mikrobiologiczne płynu stawowego w 3% roztworze cytrynianu sodu (w stosunku 1:1), aby zapobiec tworzeniu się skrzepów.

Gruźlica węzłów chłonnych. Ropa pobrana podczas nakłucia węzłów chłonnych jest badana w taki sam sposób jak ropa z ropni. Tkanka węzłów chłonnych pobrana podczas interwencji chirurgicznych i biopsji jest badana tak jak w innych postaciach gruźlicy.

Badanie kału na obecność Mycobacterium tuberculosis wykonuje się niezwykle rzadko ze względu na niemal całkowity brak wyników pozytywnych.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopia mykobakterii

Mikroskopia plwociny jest stosunkowo szybką, prostą i niedrogą metodą, którą należy stosować we wszystkich przypadkach podejrzenia gruźlicy. Ponadto badanie to wykonuje się w celu oceny skuteczności chemioterapii i potwierdzenia wyzdrowienia lub niepowodzenia leczenia w przypadku braku wyników hodowli.

Do badań mikroskopowych stosuje się dwie metody:

• metoda mikroskopii bezpośredniej, w której rozmaz sporządza się bezpośrednio z materiału diagnostycznego;
• metoda mikroskopii osadu przygotowanego z materiału poddanego działaniu środków odkażających, w celu przeprowadzenia badań kulturowych.

Pierwszą metodę stosuje się w laboratoriach, w których wykonuje się wyłącznie badania mikroskopowe (laboratoria diagnostyki klinicznej ogólnej sieci medycznej).

Najlepsze wyniki badania mikroskopowego uzyskuje się poprzez zagęszczenie materiału diagnostycznego (np. poprzez wirowanie).

Aby wykryć Mycobacterium tuberculosis z 50% prawdopodobieństwem za pomocą mikroskopii, 1 ml plwociny musi zawierać ponad 5000 komórek drobnoustrojów. Plwocina od pacjentów z płucnymi postaciami gruźlicy zwykle zawiera znaczną liczbę bakterii kwasoopornych, co pozwala na ich niezawodne wykrycie za pomocą bakterioskopii. Czułość diagnostyczną tej metody można zwiększyć, badając kilka próbek plwociny od jednego pacjenta. Negatywny wynik badania bakterioskopowego nie wyklucza rozpoznania gruźlicy, ponieważ plwocina niektórych pacjentów zawiera mniej Mycobacterium niż można wykryć za pomocą mikroskopii. Niewłaściwe przygotowanie rozmazów plwociny może być również przyczyną ujemnego wyniku badania bakterioskopowego.

Najpopularniejszą metodą wykrywania kwasoodpornych prątków w rozmazie jest barwienie metodą Ziehla-Neelsena. Metoda ta opiera się na penetracji karbolfuksyny do komórki drobnoustroju przez błonę, która zawiera warstwę woskowo-lipidową, przy jednoczesnym działaniu ogrzewania i silnym działaniu trawiącym fenolu. Późniejsze odbarwienie rozmazu 25% roztworem kwasu siarkowego lub 3% alkoholem solnym prowadzi do odbarwienia wszystkich struktur niekwasoodpornych. Odbarwione elementy rozmazu barwione są 0,3% roztworem błękitu metylenowego. Prątki nie postrzegają konwencjonalnych barwników anilinowych, w wyniku czego kwasoodporne prątki barwią się na kolor malinowo-czerwony, a inne drobnoustroje i elementy komórkowe na kolor niebieski.

Do badania rozmazów barwionych metodą Ziehl-Neelsena należy użyć lekkiego mikroskopu binokularowego z obiektywem immersyjnym (powiększenie 90- lub 100-krotne) i okularu o powiększeniu 7- lub 10-krotnym. Bada się 100 pól widzenia, co wystarcza do wykrycia pojedynczych prątków w rozmazie. Jeśli wynik takiego badania jest ujemny, zaleca się zbadanie kolejnych 200 pól widzenia w celu potwierdzenia. Wyniki są rejestrowane, wskazując liczbę wykrytych prątków kwasoopornych (AFB).

Oprócz tej metody do mikroskopii luminescencyjnej stosuje się barwienie fluorochromowe, co pozwala na osiągnięcie najlepszych rezultatów. Zastosowanie tej metody zwiększa wydajność mikroskopii o 10-15%. Gdy prątki są traktowane barwnikami luminescencyjnymi (auraminą, rodaminą itp.), substancje te wiążą się również z woskowatymi strukturami komórki drobnoustrojów. Gdy barwione komórki są napromieniowywane wzbudzającym źródłem światła (pewne widmo promieniowania ultrafioletowego), zaczynają świecić na pomarańczowo lub jasnoczerwono na czarnym lub ciemnozielonym tle. Ze względu na wysoką jasność i kontrast widocznego obrazu, ogólne powiększenie mikroskopu można zmniejszyć 4-10 razy, co rozszerza pole widzenia i skraca czas oglądania preparatu. Wraz z tym, ze względu na znacznie większą głębię ostrości, można zwiększyć komfort badania.

Przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oglądanie tego samego obszaru rozmazu zajmuje znacznie mniej czasu niż mikroskopia świetlna rozmazów barwionych metodą Ziehl-Neelsena. Jeśli mikroskopista obejrzy około 20-25 takich rozmazów w ciągu dnia roboczego, to za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej może zbadać jednocześnie ponad 60-80 próbek. Doświadczeni mikroskopiści wiedzą, że barwienie komórek mieszaniną auraminy i rodaminy jest w pewien sposób specyficzne dla mykobakterii kwasoopornych, które w tym przypadku mają wygląd nawłoci. Saprofity są barwione na zielonkawo.

Kolejną ważną zaletą metody mikroskopii fluorescencyjnej jest możliwość wykrycia zmienionych prątków, które pod wpływem szeregu niekorzystnych czynników, w szczególności intensywnej chemioterapii, utraciły właściwości kwasoodporne i dlatego nie są wykrywane za pomocą barwienia Ziehla-Neelsena.

Wady metody mikroskopii fluorescencyjnej obejmują stosunkowo wysoki koszt mikroskopu i jego eksploatacji. Jednak w scentralizowanych lub innych dużych laboratoriach, gdzie obciążenie pracą przekracza normę trzech techników laboratoryjnych pracujących z trzema konwencjonalnymi mikroskopami, tańsze jest użycie jednego mikroskopu fluorescencyjnego.

Metody bakterioskopowe mają dość wysoką swoistość (89-100%). Około 97% pozytywnych wyników uzyskanych dowolną metodą mikroskopową jest wyraźnie potwierdzanych wynikami siewu.

Należy zauważyć, że mikroskopowe badanie rozmazu materiału patologicznego nie pozwala na określenie gatunku wykrytych prątków kwasoopornych. Metoda mikroskopowa pozwala na wyciągnięcie wniosku jedynie o obecności lub braku drobnoustrojów kwasoopornych w preparacie, co tłumaczy się istnieniem w naturze dużej liczby niegruźliczych drobnoustrojów kwasoopornych, morfologicznie podobnych do prątków kompleksu gruźliczego.

Ocenę wyników mikroskopii przeprowadza się w jednostkach półilościowych.

Aby móc porównywać wyniki różnych metod mikroskopowych, wprowadza się współczynniki empiryczne. Na przykład, aby porównać wyniki rozmazu barwionego barwnikami fluorescencyjnymi z danymi badania mikroskopii świetlnej (powiększenie 1000-krotne), należy podzielić liczbę wykrytych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego prątków kwasoopornych przez odpowiedni współczynnik: przy powiększeniu mikroskopu 250-krotnym – przez 10, przy powiększeniu 450-krotnym – przez 4, przy powiększeniu 630-krotnym – przez 2.

Cechy mikroskopii w gruźlicy pozapłucnej

Wykonuje się mikroskopię bezpośrednią, a także mikroskopię rozmazów przygotowanych po wzbogaceniu z późniejszym barwieniem według Ziehl-Neelsena lub barwnikami fluorescencyjnymi. Mikroskopia bezpośrednia rozmazów jest nieskuteczna ze względu na niskie stężenie prątków w materiale, dlatego bardziej racjonalne jest stosowanie metod wzbogacania. Najbardziej skuteczna jest wirowanie. Jeśli materiał biologiczny jest lepki, stosuje się wirowanie z jednoczesną homogenizacją i upłynnieniem materiału, co przeprowadza się za pomocą wirówek szybkoobrotowych o sile wirowania 3000 g i roztworów podchlorynu. Inne metody wzbogacania, takie jak mikroflotacja, nie są obecnie stosowane ze względu na powstawanie biologicznie niebezpiecznych aerozoli.

[ 37 ]

Metoda hodowli w diagnostyce gruźlicy

Metoda posiewu lub metoda hodowli jest bardziej czuła niż mikroskopia rozmazowa i ma szereg zalet w stosunku do tej drugiej. Pozwala wykryć kilkadziesiąt żywych prątków w badanym materiale i ma wysoką wartość diagnostyczną. Jest to szczególnie ważne w przypadku badania materiału od nowo zdiagnozowanych lub leczonych pacjentów, którzy wydalają niewielką liczbę prątków.

W porównaniu z mikroskopią, badania kulturowe pozwalają zwiększyć liczbę wykrytych pacjentów z gruźlicą o ponad 15-25%, a także potwierdzić gruźlicę na wcześniejszych etapach, gdy choroba jest jeszcze łatwo uleczalna. Bardzo ważną zaletą badań kulturowych jest możliwość uzyskania hodowli patogenu, którą można zidentyfikować i zbadać pod kątem wrażliwości na lek, wirulencji i innych właściwości biologicznych.

Do wad metod hodowlanych zalicza się ich trwałość (okres oczekiwania na materiał sięga nawet 10 tygodni), wyższy koszt i złożoność obróbki materiału diagnostycznego.

Zasady przedsiewnego przygotowania materiału diagnostycznego

Konwencjonalne metody mikrobiologiczne nie mogą być stosowane do przeprowadzania testów na gruźlicę. Wynika to z faktu, że prątki gruźlicy rozwijają się bardzo powoli, a większość próbek klinicznych zawiera szybko rosnące mikroorganizmy ropne i gnilne oraz grzyby. Ich szybki wzrost na bogatych podłożach odżywczych zakłóca rozwój prątków i nie pozwala na wyizolowanie patogenu gruźlicy, dlatego materiał diagnostyczny musi być wstępnie przygotowany przed wysiewem. Ponadto prątki uwolnione z dróg oddechowych pacjenta są zwykle otoczone dużą ilością śluzu, co utrudnia ich koncentrację. W związku z tym przed wysiewem plwociny i innych podobnych materiałów należy je upłynnić i odkazić.

Wszystkie detergenty i środki odkażające mają mniej lub bardziej wyraźny toksyczny wpływ na prątki. W wyniku obróbki może obumrzeć do 90% prątków. Aby zachować wystarczającą część populacji prątków, konieczne jest stosowanie delikatnych metod obróbki, które pozwalają z jednej strony stłumić szybko rosnące mikroorganizmy ropne i gnilne, a z drugiej strony maksymalnie zachować żywotność prątków obecnych w materiale.

W zależności od materiału, jego jednorodności i stopnia zanieczyszczenia, do obróbki przedsiewnej stosuje się różne środki odkażające: do plwociny - 4% roztwór wodorotlenku sodu, 10% roztwory fosforanu trójsodowego, chlorek benzalkoniowy fosforan trójsodowy, NALC-NaOH (N-acetylo-L-cysteina-wodorotlenek sodu) o końcowym stężeniu NaOH 1%, do moczu i innych materiałów płynnych - 3% roztwór kwasu siarkowego, do próbek zanieczyszczonych, materiałów zawierających tłuszcz - roztwór kwasu szczawiowego do 5%. Ponadto w niektórych przypadkach stosuje się enzymy i surfaktanty (detergenty). Stosowanie Tween i niektórych innych detergentów wiąże się z mniejszą śmiercią komórek mykobakteryjnych (przeżywa 40-50%). Mogą być one jednak stosowane tylko do materiałów płynnych. NALC-NaOH, produkowany w zestawach, jest najszerzej stosowany na świecie. Metoda ta pozwala na wyizolowanie ponad 85% populacji komórek mykobakteryjnych. Dekontaminacja materiałów stałych zawierających tkanki jest trudniejsza, ponieważ trudno jest odgadnąć stopień rozproszenia materiału podczas homogenizacji. Na przykład, przetwarzanie biopsji węzłów chłonnych często wiąże się ze zwiększoną częstością skażenia obcą florą. W takim przypadku można użyć 1% etonium.

Materiał niejednorodny jest homogenizowany za pomocą szklanych kulek w obecności środków odkażających. Materiały płynne są wstępnie odwirowywane, a przetwarzany jest tylko osad.

Technika siewu i inkubacji

Po wstępnym przetworzeniu materiał jest wirowany, co powoduje wytrącenie prątków i zwiększenie ich zawartości w osadzie („wzbogacanie osadu”). Powstały osad jest neutralizowany i zaszczepiany na powierzchnię gęstych pożywek lub probówek z płynnymi (półpłynnymi) pożywkami. Z pozostałego osadu sporządza się rozmazy do badania mikroskopowego. Technika zaszczepiania musi zapobiegać krzyżowemu zanieczyszczeniu materiału diagnostycznego.

W celu wiarygodnej interpretacji klinicznej wyników badań mikrobiologicznych należy przestrzegać następującej zasady: badania mikroskopowe i hodowlane należy wykonywać równolegle z tej samej próbki materiału diagnostycznego.

Zaszczepione probówki umieszcza się w termostacie w temperaturze 37 ^o C na 2 dni w pozycji poziomej. Zapewnia to bardziej równomierne wchłanianie materiału do pożywki. Po 2 dniach probówki ustawia się w pozycji pionowej i hermetycznie zamyka gumowymi lub silikonowymi korkami, aby zapobiec wysychaniu zaszczepionego podłoża.

Uprawy są utrzymywane w termostacie w temperaturze 37 ^° C przez 10-12 tygodni z regularną cotygodniową kontrolą. Podczas każdej kontroli kontrolnej rejestrowane są następujące parametry:

• okres wizualnie obserwowalnego wzrostu od dnia siewu;
• tempo wzrostu (liczba jednostek tworzących kolonie);
• skażenie hodowli obcą florą bakteryjną lub grzybami (takie probówki są usuwane);
• brak widocznego wzrostu. Rurki pozostawiono w termostacie do następnej kontroli.

Nośniki odżywcze

Do hodowli mykobakterii stosuje się różne media odżywcze: stałe, półpłynne, płynne. Jednak żadne ze znanych mediów odżywczych nie ma właściwości zapewniających wzrost wszystkich komórek mykobakterii. W związku z tym, aby zwiększyć wydajność, zaleca się jednoczesne stosowanie 2-3 mediów odżywczych o różnym składzie.

Jako standardowe podłoże do pierwotnej izolacji patogenu gruźlicy i określenia jego lekowrażliwości, WHO zaleca podłoże Lowensteina-Jensena. Jest to gęste podłoże jajeczne, na którym wzrost prątków uzyskuje się 20-25 dnia po wysianiu materiału bakterioskopowo dodatniego. Wysiewanie materiału bakterioskopowo ujemnego wymaga dłuższego okresu inkubacji (do 10-12 tygodni).

W naszym kraju rozpowszechniło się podłoże jajowe Finn-II zaproponowane przez ER Finn. Różni się ono tym, że zamiast L-asparaginy wykorzystuje glutaminian sodu, który uruchamia inne ścieżki syntezy aminokwasów w mykobakteriach. Wzrost pojawia się na tym podłożu nieco wcześniej, a częstość izolacji mykobakterii jest o 6-8% wyższa niż na podłożu Lowensteina-Jensena.

Aby zwiększyć skuteczność diagnostyki bakteriologicznej gruźlicy pozapłucnej, wskazane jest włączenie do kompleksu pożywek modyfikowanych pożywek Finn-II. Aby przyspieszyć wzrost, do pożywki Finn-II wprowadza się dodatkowo 0,05% tioglikolanu sodu, który obniża stężenie tlenu. Aby chronić układy enzymatyczne mykobakterii przed toksycznymi produktami peroksydacji lipidów, do pożywki Finn-II wprowadza się przeciwutleniacz octan α-tokoferolu w stężeniu 0,001 μg/ml. Materiał diagnostyczny wysiewa się metodą standardową.

W rosyjskich laboratoriach zajmujących się zwalczaniem gruźlicy stosowane są również inne modyfikacje gęstych pożywek: pożywka „Nowaja” zaproponowana przez G. G. Mordowskiego, pożywki A-6 i A-9 opracowane przez.V. Anikina itp.

Ze względu na to, że podczas chemioterapii dochodzi do uszkodzeń różnych układów metabolicznych komórki drobnoustrojów, część populacji prątków traci zdolność do prawidłowego rozwoju na konwencjonalnych pożywkach odżywczych i wymaga osmotycznie zrównoważonych (półpłynnych lub płynnych) pożywek odżywczych.

Ocena i dokumentowanie wyników posiewu materiału diagnostycznego

Niektóre szczepy i typy mykobakterii rosną powoli, wzrost może pojawić się nawet w 90 dniu. Liczba takich kultur jest niewielka, ale zmusza to do przechowywania wysiewów w termostacie przez 2,5-3 miesiące.

Zjadliwe kultury Mycobacterium tuberculosis zwykle rosną na stałych podłożach jajecznych jako kolonie w formie R o różnej wielkości i wyglądzie. Kolonie są suche, pomarszczone, w kolorze kości słoniowej i lekko pigmentowane. Na innych podłożach kolonie Mycobacterium tuberculosis mogą być bardziej wilgotne. Po cyklu chemioterapii lub w trakcie leczenia można wyizolować gładkie kolonie o wilgotnym wzroście (formy S).

Podczas izolacji kultur przeprowadza się szereg specjalistycznych badań mających na celu odróżnienie prątków gruźlicy od prątków niegruźliczych i saprofitycznych bakterii kwasoopornych.

Odpowiedź twierdzącą otrzymuje się po obowiązkowym badaniu mikroskopowym rozmazu z wyhodowanych kolonii barwionych metodą Ziehl-Neelsena. W przypadku wzrostu mykobakterii w rozmazach znajdują się jasnoczerwone pręciki, leżące pojedynczo lub w grupach, tworzące skupiska w postaci filcu lub warkoczyków. W młodych kulturach, zwłaszcza tych izolowanych od pacjentów długotrwale leczonych chemioterapią, mykobakterie wyróżniają się wyraźnym polimorfizmem, aż do obecności krótkich, prawie kokoidalnych lub wydłużonych wariantów przypominających grzybnię grzybów, wraz z formami w kształcie pręcików.

Intensywność wzrostu mykobakterii oznacza się według następującego schematu: (+) - 1-20 CFU w probówce (niskie wydalanie bakterii); (++) - 20-100 CFU w probówce (umiarkowane wydalanie bakterii); (+++) - >100 CFU w probówce (obfite wydalanie bakterii). W diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy nie wystarczy udzielić odpowiedzi wskazującej, czy mykobakterie zostały wykryte określoną metodą. Konieczne jest również posiadanie szczegółowego pojęcia o objętości i charakterze populacji mykobakterii, jej składzie i właściwościach. To właśnie te dane pozwalają prawidłowo zinterpretować stan procesu, zaplanować taktykę i szybko dostosować leczenie.

W ostatnich latach do przyspieszenia wzrostu prątków zaproponowano pożywki na bazie agaru z różnymi dodatkami wzrostowymi i stosowanie specjalnej mieszanki gazowej. Aby uzyskać wzrost prątków na tych pożywkach, podczas hodowli tworzy się atmosferę o zwiększonej zawartości dwutlenku węgla (4-7%). W tym celu stosuje się specjalne inkubatory CO2 _. Największy rozwój odnotowały jednak zautomatyzowane systemy hodowli prątków: MGIT-BACTEC-960 i MB/Bact.

Jednym z takich systemów jest system MGIT (mycobacteria growth indication tube), który jest wysoko zaawansowanym technologicznie rozwiązaniem i jest przeznaczony do przyspieszonej diagnostyki bakteriologicznej gruźlicy i określania wrażliwości prątków na leki pierwszego rzutu i niektóre leki drugiego rzutu. MGIT jest przeznaczony do stosowania jako część urządzenia VASTEC-960. Mikroorganizmy są hodowane w specjalnych probówkach z płynnym podłożem odżywczym na bazie zmodyfikowanego podłoża Middlebrook-7H9. Aby pobudzić wzrost prątków i zahamować wzrost obcej mikroflory, stosuje się MGIT Growth Supplement i mieszankę leków przeciwbakteryjnych PANTA.

Wzrost mikroorganizmów jest rejestrowany optycznie. Opiera się na fluorescencji, która występuje, gdy prątki zużywają tlen w trakcie swojego wzrostu. Na dnie specjalnej probówki znajduje się zależny od tlenu barwnik fluorochromowy, pokryty warstwą silikonu. Rozmnażanie się prątków prowadzi do zmniejszenia ilości tlenu w probówce i zmniejszenia jego stężenia, co powoduje wzrost fluorescencji, która staje się widoczna, gdy probówka zostanie napromieniowana światłem ultrafioletowym i jest automatycznie rejestrowana przez fotosensory wbudowane w urządzenie VASTES-960. Intensywność luminescencji jest rejestrowana w jednostkach wzrostu (GU). Dane dotyczące wzrostu są automatycznie wprowadzane do komputera, gdzie mogą być zapisywane. Komputerowa analiza krzywych wzrostu może dostarczyć informacji na temat obecności różnych grup prątków, w tym niegruźliczych, a także pomaga ocenić właściwości wzrostowe prątków.

W wyniku wprowadzenia takich systemów czas wzrostu prątków gruźlicy został znacznie skrócony, średnio 11 dni na VASTEC-960 i 19 dni na MB/Bact w porównaniu do 33 dni na standardowym gęstym podłożu odżywczym. Należy zauważyć, że systemy te wymagają wysoko wykwalifikowanego personelu. Wysiew materiału na podłoża płynne jest koniecznie połączony z wysiewem na podłoże Lowensteina-Jensena, które pełni rolę rezerwową w przypadkach, gdy prątki gruźlicy nie rosną na innych podłożach.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Oznaczanie lekowrażliwości prątków gruźlicy

Określenie spektrum i stopnia wrażliwości prątków gruźlicy na leki przeciwgruźlicze ma duże znaczenie kliniczne, jak również dla oceny epidemiologicznej rozprzestrzeniania się gruźlicy lekoopornej. Ponadto monitorowanie lekooporności pozwala nam ocenić skuteczność programu przeciwgruźliczego jako całości, będąc integralnym wskaźnikiem pracy wszystkich składników środków przeciwgruźliczych.

Częstotliwość i terminy wykonywania testów wrażliwości na leki:

• przed rozpoczęciem leczenia, jednorazowo w celu ustalenia strategii i taktyki leczenia:
• Podczas izolowania kultur z różnych materiałów od pacjenta (plwocina, BAL, mocz, wysięki, płyn mózgowo-rdzeniowy itp.) bada się wszystkie wyizolowane szczepy:
• pod koniec intensywnej fazy leczenia przy braku dynamiki klinicznej i radiologicznej:
• jeśli konieczna jest zmiana schematu leczenia w przypadku:
  • brak negatywności plwociny;
  • ponowne wykonanie posiewu po ujemnym wyniku plwociny;
  • gwałtowny wzrost ilości AFB w rozmazie po początkowym spadku. Wiadomo, że z materiału pochodzącego od pacjenta z gruźlicą izoluje się szczepy Mycobacterium tuberculosis o różnej wrażliwości na leki. Wrażliwość szczepów na leki przeciwgruźlicze może różnić się spektrum leków, stopniem, częstością i szybkością rozwoju oporności.

Stopień lekooporności Mycobacterium tuberculosis określa się według ustalonych kryteriów, które koncentrują się na klinicznym znaczeniu oporności i zależą od aktywności przeciwgruźliczej leku, jego farmakokinetyki, stężenia w miejscu zakażenia, maksymalnej dawki terapeutycznej itp.

Oznaczanie wrażliwości prątków gruźlicy na leki wykonuje się obecnie metodami mikrobiologicznymi:

• stężenia bezwzględne (metoda rozcieńczania na pożywkach stałych lub płynnych),
• proporcje,
• współczynnik oporu.

Zwykle oporność objawia się w postaci wizualnie obserwowanego wzrostu kolonii prątków gruźlicy, jednak istnieją metody, które indukują wzrost we wczesnych stadiach podziału komórek prątków w postaci reakcji barwnych. Metody te skracają czas badania z 3-4 do 2 tygodni.

Metoda absolutnego stężenia rekomendowana przez Komitet Chemioterapii WHO stała się w Rosji szeroko rozpowszechniona jako metoda zunifikowana. Z metodologicznego punktu widzenia jest najprostsza, ale wymaga wysokiej standaryzacji i precyzji procedur laboratoryjnych. Test wrażliwości na leki składa się z zestawu probówek z podłożem odżywczym zmodyfikowanym lekami przeciwgruźliczymi. Zestaw składa się z 2-3 probówek z różnymi stężeniami każdego z użytych leków, jednej probówki kontrolnej z podłożem bez leku i jednej probówki zawierającej 1000 μg/ml salicylanu sodu lub 500 μg/ml kwasu paranitrobenzoesowego w celu wykrycia wzrostu prątków niegruźliczych.

Do przygotowania zestawu mediów z preparatami należy użyć zmodyfikowanego medium Lowensteina-Jensena (bez skrobi), które wlewa się do kolb. Do każdej z kolb dodaje się określoną objętość odpowiedniego rozcieńczenia leku przeciwgruźliczego. Zawartość kolb dokładnie miesza się, wlewa do probówek i koaguluje w pozycji pochylonej przez 40 minut w temperaturze 85°C. Zaleca się koagulację medium w koagulatorze elektrycznym z automatyczną kontrolą temperatury. Medium z lekami przeciwgruźliczymi

1. rząd można przechowywać w lodówce w temperaturze 2-4 °C przez 1 miesiąc, z 2. rzędem leków - nie dłużej niż 2 tygodnie. Przechowywanie mediów z lekami w temperaturze pokojowej jest niedopuszczalne. Przygotowując roztwory leków przeciwgruźliczych, bierze się pod uwagę ich aktywność, obliczając stężenie z korektą na masę cząsteczkową niespecyficznej części leku, czystość itp. Do określenia wrażliwości leku stosuje się wyłącznie substancje chemicznie czyste.

Zasada metody polega na określeniu stężenia leku przeciwgruźliczego, który hamuje wzrost znacznej części populacji mykobakterii. Jeśli jest przeprowadzona prawidłowo, metoda ta ma dobrą niezawodność.

Przed wykonaniem testu należy upewnić się, że wyizolowana kultura Mycobacterium tuberculosis nie zawiera obcej mikroflory. Z hodowli prątków w 0,9% roztworze chlorku sodu przygotowuje się jednorodną zawiesinę zawierającą 500 milionów ciał mikrobiologicznych w 1 ml (standard zmętnienia optycznego 5 jednostek). Otrzymaną zawiesinę rozcieńcza się 0,9% roztworem chlorku sodu (1:10) i do każdej probówki zestawu pożywek dodaje się 0,2 ml zawiesiny. Zaszczepione probówki umieszcza się w termostacie w temperaturze 37 °C i utrzymuje poziomo przez 2-3 dni, tak aby skośna powierzchnia pożywki została równomiernie zaszczepiona zawiesiną Mycobacterium tuberculosis. Następnie probówki ustawia się w pozycji pionowej i inkubuje przez 3-4 tygodnie. Wyniki odnotowuje się po 3-4 tygodniach.

Ponieważ czas potrzebny do wyizolowania patogenu z materiału klinicznego na pożywkach wynosi co najmniej 1-1,5 miesiąca, wyniki określania wrażliwości na leki tą metodą można uzyskać nie wcześniej niż po 2-2,5 miesiącach od wysiania materiału. Jest to jedna z głównych wad tej metody.

Wyniki badania wrażliwości prątków na leki interpretuje się na podstawie pewnych kryteriów. Na podłożach stałych hodowlę uważa się za wrażliwą na stężenie leku zawartego w podłożu, jeśli liczba kolonii prątków wyhodowanych w danej probówce z lekiem nie przekracza 20 przy obfitym wzroście w probówce kontrolnej bez leku. Tylko jeśli jest więcej niż 20 kolonii, hodowlę uważa się za oporną na dane stężenie. W praktyce, gdy uzyskuje się wyniki wzrostu w probówkach zbliżone do 20 CFU, konieczne jest powiadomienie jednostki klinicznej, że wrażliwość lub oporność w tym przypadku jest graniczna, ponieważ czasami może to wyjaśniać niejasną dynamikę wskaźników klinicznych.

Dla różnych preparatów ustala się pewne stężenie, przy którym obserwuje się reprodukcję krytycznej proporcji populacji mykobakterii. Stężenia te nazywane są „krytycznymi”. Wielkość wzrostu populacji mykobakterii na pożywce z preparatem w stężeniu krytycznym jest stosowana jako kryterium stabilności.

W praktyce krajowej ftyzjologii, przy określaniu lekooporności, nie ogranicza się do określania jedynie stężeń krytycznych. Wynika to z faktu, że poszerzona definicja poziomu lekooporności patogenu pozwala klinicyście na bardziej prawidłowe formułowanie taktyk chemioterapii, wykorzystując wiedzę o potencjalizującym działaniu kombinacji leków, przewidywanie oporności krzyżowej lub stosowanie skuteczniejszych leków z grupy stosowanych leków przeciwgruźliczych.

Metoda koncentracji absolutnej jest najprostsza, ale też najbardziej wrażliwa na błędy popełniane przy jej wdrażaniu. Bardziej niezawodna, zwłaszcza przy określaniu wrażliwości na leki drugiej linii, i szeroko rozpowszechniona poza Rosją jest metoda proporcjonalna. Uwzględnia ona niedociągnięcia metody koncentracji absolutnej, ale jest bardziej pracochłonna w realizacji.

Metoda jest bardzo podobna do metody absolutnego stężenia. Przygotowanie probówek z lekami jest takie samo jak w metodzie absolutnego stężenia. Jednak dawka zarodkowa zawiesiny prątków gruźlicy jest zmniejszona 10-krotnie, co eliminuje częstość spontanicznej oporności niektórych szczepów prątków gruźlicy na leki takie jak Etambutol, protionamid, kapreomycyna. Jako kontrole stosuje się 2 lub 3 probówki z dawką zarodkową równą tej w probówkach, rozcieńczone kolejno 10 i 100 razy. Kryterium oporności jest odsetek wizualnie obserwowanego wzrostu prątków gruźlicy. W przypadku leków I rzutu kryterium oporności jest nadmierny wzrost 1% populacji początkowej, w przypadku leków II rzutu - wzrost 1 lub więcej niż 10% populacji początkowej, w zależności od wybranego stężenia krytycznego.

W 1997 r. grupa robocza Światowej Organizacji Zdrowia i Międzynarodowej Unii Przeciwgruźliczej ds. wykrywania oporności na leki przeciwgruźlicze wprowadziła zmiany do tych kryteriów, proponując uznanie za oporne prątków rozwijających się na gęstym podłożu jajowym Lowensteina-Jensena w następujących stężeniach:

• dihydrostreptomycyna - 4 μg/ml;
• izoniazyd - 0,2 µg/ml:
• ryfampicyna - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

W 2001 roku zaproponowano stężenia krytyczne dla następujących leków drugiej linii (dla krytycznego udziału 1%):

• kapreomycyna - 40 mcg/ml;
• protionamid - 40 mcg/ml;
• kanamycyna - 30 μg/ml;
• wiomycyna - 30 μg/ml;
• cykloseryna - 40 mcg/ml;
• kwas aminosalicylowy - 0,5 mcg/ml;
• ofloksacyna - 2 mcg/ml.

Wyniki wzrostu ocenia się po 4 tygodniach jako wstępne i po 6 tygodniach uprawy jako ostateczne.

Do określania wrażliwości na pyrazynamid, który jest szeroko stosowany w nowoczesnej chemioterapii gruźlicy, zalecane stężenie krytyczne wynosi 200 μg/ml. Nadal jednak nie ma powszechnie akceptowanej metody określania lekooporności na ten lek na stałych podłożach odżywczych, ponieważ jego aktywność przeciwbakteryjna objawia się tylko w środowisku kwaśnym (pH <6), które jest technicznie trudne do utrzymania. Ponadto wiele kultur klinicznych Mycobacterium tuberculosis niechętnie rośnie na podłożach jajecznych o kwaśnym środowisku.

Aby ocenić jakość wyników określania lekowrażliwości prątków gruźlicy, zaleca się kontrolowanie każdej nowej partii podłoża Lowensteina-Jensena poprzez równoległe oznaczanie podatności standardowego szczepu muzealnego H37Rv. Ponadto istnieją pewne kryteria mikrobiologiczne, które muszą być spełnione, aby metody dawały dobrze powtarzalny i prawidłowo interpretowany wynik. Należą do nich żywotność hodowli prątków gruźlicy, zasady uzyskiwania jednorodnej zawiesiny i zawiesiny, zasady selekcji kultur prątków gruźlicy oraz reprezentatywność wybranej masy bakteryjnej. Niezawodność określania lekooporności maleje przy ekstremalnie słabym wydalaniu bakterii.

Ostatnio za obiecującą uznano metodę określania wrażliwości na leki przy użyciu systemów automatycznych. Najbardziej zaawansowane w tej dziedzinie są opracowania oparte na VASTEC MGIT-960. W tym przypadku wrażliwość na leki prątków gruźlicy jest określana w oparciu o zmodyfikowaną metodę proporcjonalną. Podczas oznaczania porównuje się tempo wzrostu prątków gruźlicy w probówce kontrolnej i w probówkach z lekami. Do określania wrażliwości na streptomycynę, izoniazyd, ryfampicynę i etambutol stosuje się dodatki wzbogacające i antybiotyki wchodzące w skład zestawu SIRE. Do określania wrażliwości na pyrazynamid stosuje się zestaw PZA. Podczas badania probówki z lekami są zaszczepiane zawiesiną prątków gruźlicy, a także probówki kontrolne 100-krotnym rozcieńczeniem zawiesiny dla wszystkich leków, z wyjątkiem pyrazynamidu, gdzie rozcieńczenie zawiesiny wynosi 10-krotność. Kryterium stabilności jest wskaźnik wzrostu mykobakterii 100 GU, gdy wzrost w probówce kontrolnej osiąga 400 GU (patrz „Metody kulturowe do izolowania mykobakterii”). Wyniki są rejestrowane i interpretowane automatycznie i są ustawiane przez wprowadzony lub wybrany program.

Końcowe stężenia w probówce z płynnym podłożem odżywczym są używane jako stężenia krytyczne. Obecnie stężenia krytyczne zostały opracowane zarówno dla leków pierwszego rzutu, jak i niektórych leków drugiego rzutu. Należy zauważyć, że określenie wrażliwości prątków gruźlicy na cykloserynę i kwas aminosalicylowy przeprowadza się wyłącznie na podłożach odżywczych jaj.

Szczegółowy protokół pracy z opisanym systemem pozwala na badanie wrażliwości na leki zarówno na izolowanej hodowli (z gęstym podłożem odżywczym), jak i na wykorzystaniu pierwotnego wzrostu prątków w probówce MGIT. Ta ostatnia opcja znacznie skraca czas potrzebny na przeprowadzenie badań kulturowych, umożliwiając uzyskanie pełnych wyników hodowli prątków gruźlicy (w tym informacji o wrażliwości na leki) w ciągu 3 tygodni od pobrania materiału, podczas gdy tradycyjna metoda może to zapewnić dopiero w 3. miesiącu. Terminowe wyniki, gdy pacjent jest w intensywnej fazie leczenia, mogą zrekompensować stosunkowo wysoki koszt badań.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Różnicowanie mykobakterii

Biorąc pod uwagę, że stosowane pożywki nie są ściśle selektywne, późniejsze różnicowanie wyizolowanych prątków uważa się za obowiązkowe. Konieczność różnicowania prątków wynika z szeregu cech procesów patologicznych wywołanych przez przedstawicieli rodzaju: odmienny przebieg i wynik gruźlicy i mykobakteriozy, obecność naturalnej lekooporności na niektóre leki przeciwgruźlicze.

Uznaje się, że podstawową identyfikację prątków gruźlicy z grupy M. tuberculosis od prątków niegruźliczych przeprowadza się na podstawie następujących cech: szybkości wzrostu na gęstym podłożu odżywczym, tworzenia pigmentu, morfologii kolonii, obecności odporności na kwasy i optymalnej dla wzrostu temperatury.

Niestety, nie istnieje pojedyncza metoda laboratoryjna, która pozwalałaby na wiarygodne odróżnienie prątków gruźlicy od innych prątków kwasoopornych. Niemniej jednak połączenie opisanych powyżej objawów z wynikami szeregu testów biochemicznych podanych poniżej pozwala na identyfikację prątków gruźlicy z prawdopodobieństwem sięgającym 95%.

Aby odróżnić prątki gruźlicy z grupy M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii i inne) od wolno rosnących prątków niegruźliczych, stosuje się podstawowe testy biochemiczne w celu wykrycia obecności następujących objawów:

• zdolność do produkcji kwasu nikotynowego (test niacynowy):
• aktywność reduktazy azotanowej;
• termostabilna katalaza;
• wzrost na podłożu z salicylanem sodu (1 mg/ml).

Jako dodatkowy test można również zastosować testy wzrostu na podłożu zawierającym 500 μg/ml kwasu para-nitrobenzoesowego lub 5% chlorku sodu.

Wiele laboratoriów bakteriologicznych identyfikuje te mikroorganizmy dopiero na poziomie złożonym, co wynika z ograniczonych możliwości laboratoriów i możliwości metodycznych specjalistów.

W większości przypadków w praktyce do odróżnienia M. tuberculosis od M. bovis wystarczą następujące testy: niacyna, reduktaza azotanowa, pyrazynamidaza i rejestracja wzrostu na podłożu zawierającym 2 μg/ml hydrazydu kwasu tiofeno-2-karboksylowego. Bierze się pod uwagę, że prątki kompleksu M. tuberculosis charakteryzują się następującym zestawem cech:

• powolny wzrost (ponad 3 tygodnie);
• temperatura wzrostu w granicach 35-37 ^o C;
• brak pigmentacji (kolor kości słoniowej);
• wyraźne zabarwienie kwasoodporne;
• pozytywny wynik testu na niacynÄ™;
• pozytywny wynik testu reduktazy azotanowej;
• brak termostabilnej katalazy (68 ^o C).
• brak wzrostu na podłożu Lowensteina-Jensena zawierającym:
  • 1000 µg/ml kwasu salicylowego sodowego,
  • 500 mcg/ml kwasu para-nitrobenzoesowego,
  • 5% chlorek sodu:
• wzrost w obecności 1-5 μg/ml kwasu tiofeno-2-karboksylowego.

Znaczenie różnicowania izolowanych mykobakterii znacznie wzrośnie wraz ze wzrostem częstości rejestracji przypadków HIV/AIDS związanych z gruźlicą lub mykobakteriozą. Obecnie nie ma absolutnej pewności co do gotowości praktycznych laboratoriów regionalnych do prawidłowego wykonania tej ilości pracy.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Diagnostyka immunologiczna gruźlicy

Istnieje szereg uniwersalnych zjawisk, preparatów i testów immunologicznych, które pierwotnie odkryto specjalnie w gruźlicy lub w modelu odpowiedzi immunologicznej na prątki gruźlicy. Należą do nich BCG i tuberkulin, takie zjawisko jak skórne DST (testy tuberkulinowe - reakcje Pirqueta i Mantoux), reakcja na podskórne podanie tuberkulinu uczulonym zwierzętom (zjawisko Kocha). Niektóre z pierwszych przeciwciał w chorobach zakaźnych odkryto również w gruźlicy. Oczywiście im głębsze zrozumienie mechanizmów odporności przeciwgruźliczej i ich kontroli genetycznej, tym szersze może być zastosowanie metod immunologicznych i preparatów wpływających na odporność do rozwiązywania praktycznych problemów ftyzjologii.

Za najważniejszy i najbardziej złożony problem praktyczny uważa się obecnie wykrywanie gruźlicy w procesie masowych badań przesiewowych populacji. Jednak pomimo licznych doniesień o „sukcesach” (na ograniczonym materiale), nie ma metody immunologicznej (powtarzalnej w „każdej ręce”) ani leku odpowiedniego do tych celów.

W praktyce klinicznej powszechnie stosuje się metody immunologiczne, a w szczególności badania serologiczne (oznaczanie antygenów, przeciwciał) oraz próby prowokacyjne tuberkulinowe.

Wśród badań immunologicznych stosowanych w diagnostyce różnicowej na pierwszym miejscu plasują się metody serologiczne, które pozwalają na określenie obecności antygenów i przeciwciał w różnych środowiskach organizmu.

Specyficzność oznaczania przeciwciał przeciwko prątkom gruźlicy zależy od antygenów użytych w analizie immunologicznej. Zaproponowano znaczną liczbę antygenów, z których pierwszym jest tuberkulinowy PPD:

• PPD i inne złożone preparaty z płynu hodowlanego;
• środek dezintegrujący ultradźwiękowy;
• Ekstrakt z Tritona i inne złożone preparaty ścian komórkowych;
• 5-antygen (Daniel);
• 60-antygenów (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• czynnik pępowinowy (trehaloza-6,6-di-mykolan);
• fenolowe i inne glikolipidy;
• lipopolisacharydy;
• antygen wiążący fibroniektynę;
• białka (najczęściej rekombinowane); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA, itd.

W wyniku wieloletnich badań rosyjskich i zagranicznych naukowców zidentyfikowano główne wzorce powstawania przeciwciał i skuteczność diagnostyki serologicznej gruźlicy: im bardziej złożony antygen, tym wyższa czułość i niższa swoistość testów. Swoistość jest różna w różnych krajach w zależności od zakażenia populacji prątkami gruźlicy i prątkami niegruźliczymi, od szczepienia BCG itp. U dzieci informatywność serodiagnostyki jest niższa niż u dorosłych. W gruźlicy pierwotnej (częściej u dzieci) bardziej informatywne jest określenie IgM; w gruźlicy wtórnej - IgG. U osób zakażonych wirusem HIV informatywność serodiagnostyki w określaniu przeciwciał jest obniżona. Skuteczność oznaczania przeciwciał zależy od szeregu „momentów klinicznych”: aktywności procesu (obecności lub braku „izolacji” prątków, obecności jam gnilnych, stopnia nacieku), częstości występowania procesu, czasu jego przebiegu.

Czułość metody immunoenzymatycznej (EIA) wynosi około 70%. Niewystarczająca skuteczność badania wynika z jego niskiej swoistości. Wcześniej rozważano możliwości wykorzystania przesiewu serologicznego w grupach wysokiego ryzyka, w szczególności wśród osób ze zmianami pogruźliczymi w płucach.

Aby zwiększyć swoistość testu ELISA, poszukuje się bardziej swoistych antygenów, w tym uzyskanych metodą inżynierii genetycznej: ESAT-6 itp. (patrz wyżej). Zastosowanie ściśle swoistych antygenów (38 kDa, ESAT) zwiększa swoistość, ale znacznie zmniejsza czułość analizy. Oprócz testów ELISA (eksperymentalne systemy badań laboratoryjnych, takie jak zestaw Pathozyme ELISA), oferowane są również zestawy immunochromatograficzne z filtracją boczną (Mycodot), a także inne podobne testy (analiza punktów membranowych) z wizualną oceną wyniku testu. Podczas przeprowadzania tych testów analiza trwa 10-30 minut; nie wymagają one specjalistycznego sprzętu, wymagają wizualnej oceny wyników, co wiąże się z pewną subiektywnością. Metody te mają w przybliżeniu takie same cechy czułości i swoistości (odpowiednio 70% i 90-93%) jak tradycyjne testy ELISA.

Zastosowanie metod analizy immunologicznej ma pewną wartość jako dodatkowa metoda uwzględniana w kompleksie metod stosowanych w diagnostyce różnicowej gruźlicy, zwłaszcza w diagnostyce jej postaci pozapłucnych. Metoda ELISA jest najskuteczniejsza w diagnostyce gruźliczego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych przy badaniu płynu mózgowo-rdzeniowego. W tym przypadku czułość analizy wynosi 80-85%, a swoistość 97-98%. Istnieją informacje na temat skuteczności oznaczania przeciwciał przeciwko Mycobacterium tuberculosis w płynie łzowym w diagnostyce gruźliczego zapalenia błony naczyniowej oka.

Indukcja syntezy interferonu gamma in vitro

Interferon gamma (IFN-γ) jest czynnikiem swoistej ochrony immunologicznej, realizowanym poprzez aktywację układów enzymatycznych makrofagów. Indukcja syntezy IFN-γ przez uwrażliwione limfocyty T jest spowodowana ich interakcją z antygenami mykobakterii.

Zarówno tuberkulinowy PPD, jak i specyficzne antygeny uzyskane metodą inżynierii genetycznej są używane jako antygeny, w szczególności antygen ESAT-6 (wczesny wydzielany antygen o masie cząsteczkowej 6 kDa) i CFP-10 (białko filtratu hodowlanego, 10 kDa). Antygeny modyfikowane genetycznie lub rekombinowane są nieobecne w komórkach szczepionki BCG i innych mykobakteriach. Przy użyciu tuberkuliny wyniki testu indukcji IFN-γ są porównywalne z wynikami skórnej próby tuberkulinowej (bezpośrednia korelacja). Przy użyciu antygenów modyfikowanych genetycznie wyniki testu są bardziej specyficzne i nie zależą od wcześniejszego szczepienia BCG. W przypadku badania osób zaszczepionych, które nie miały kontaktu z zakażeniem gruźlicą, swoistość testu wynosi 99%. Czułość testu wśród pacjentów z gruźlicą waha się od 81 do 89%.

Opracowano testy i diagnostykę opartą na krótkotrwałej hodowli pełnych komórek krwi lub komórek jednojądrowych wyizolowanych z krwi z antygenami prątków gruźlicy in vitro, a następnie oznaczeniu stężenia IFN-γ lub zliczeniu liczby limfocytów T syntetyzujących IFN-γ. Stężenie interferonu syntetyzowanego w probówce oznacza się metodą ELISA przy użyciu przeciwciał monoklonalnych wiążących IFN-γ. Następnie, stosując kalibrację standardowego IFN-γ, oznacza się jego stężenie w probówce lub dołkach płytki.

W teście Elispot liczba limfocytów T syntetyzujących IFN-γ jest liczona na powierzchni naczynia pokrytego przeciwciałami przeciwko IFN-γ.

Twórcy diagnostyki in vitro indukowanej IFN-γ, która została zatwierdzona przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków, twierdzą, że test ten nie może odróżnić utajonego zakażenia gruźlicą od aktywnej gruźlicy. Dlatego w regionach o wysokim wskaźniku zakażeń test ten nie ma bezpośredniej wartości diagnostycznej. Jednak w naszym kraju może być stosowany do odróżniania zakażenia gruźlicą u dzieci od alergii poszczepiennej, a także do oceny poziomu swoistej odporności w trakcie leczenia.

Obecnie trwają badania nad krajowym systemem testowym pozwalającym na określenie in vitro indukcji syntezy IFN-γ przez specyficzne antygeny gruźlicy.

Stan odporności i przebieg gruźlicy, immunokorekcja

W trakcie leczenia gruźlicy u ludzi zachodzą zmiany w antygenemii i stanie układu odpornościowego.

Dane dotyczące zmian wysięków i tkanek są w dużej mierze sprzeczne. Jedyne, co można zauważyć z pełnym uzasadnieniem, to to, że ziarniniaki gruźlicze z reguły zawierają znaczną liczbę aktywowanych limfocytów T.

Warto zatrzymać się jeszcze na dwóch kwestiach, które są niezbędne do zrozumienia roli mechanizmów immunologicznych w leczeniu gruźlicy u ludzi:

• U pacjentów chorych na AIDS szczególnie często występuje oporność na wiele leków;
• W przypadku wielolekowej oporności (i braku zakażenia wirusem HIV) szczególnie istotne są zaburzenia odporności (głównie odporności limfocytów T).

W gruźlicy powszechnie stosuje się różne metody immunokorekcji. Przede wszystkim są to leki działające głównie na odporność limfocytów T i układ fagocytów jednojądrowych (hormony grasicy, izofony, likopidy, polioksydoniowe itp.), a także całe (atenuowane) prątki gruźlicy i ich składniki.

Molekularna diagnostyka biologiczna gruźlicy

Metody biologii molekularnej w diagnostyce chorób zakaźnych obejmują głównie metody oparte na manipulacji materiałami genomowymi patogenów bakteryjnych i wirusowych w celu identyfikacji specyficznego materiału genetycznego - odcinków DNA o sekwencji nukleotydowej specyficznej dla danego gatunku lub szczepu patogenu, do analizy specyficznych sekwencji DNA w genach, które decydują o wrażliwości patogenu na określone leki, a także do analizy aktywności funkcjonalnej określonych genów patogenu. Metody biologii molekularnej stały się powszechne w badaniach naukowych i praktycznym zastosowaniu w diagnostyce i monitorowaniu różnych zakażeń bakteryjnych i wirusowych po odkryciu reakcji łańcuchowej polimerazy w 1985 roku przez Carrie Mullis (laureatkę Nagrody Nobla. 1989).

Zasady i możliwości metody reakcji łańcuchowej polimerazy

PCR umożliwia amplifikację (mnożenie) sekwencji nukleotydowej (fragmentu DNA patogenu) w probówce w ciągu kilku godzin o miliony razy. Przeprowadzenie reakcji w obecności pojedynczych łańcuchów DNA decyduje o wyjątkowo wysokiej czułości analizy.

Sekwencja nukleotydów w określonych odcinkach łańcucha DNA decyduje o unikalności genetycznej mikroorganizmu, co wyjaśnia wysoką specyficzność reakcji PCR.

Znaczenie tej metody w wykrywaniu i badaniu cech Mycobacterium tuberculosis wynika z biologicznych cech tego mikroorganizmu, który charakteryzuje się bardzo powolnym wzrostem: czas podwojenia DNA Mycobacterium tuberculosis w trakcie jego hodowli wynosi 12–24 godzin.

Zasada metody PCR opiera się na amplifikacji - wielokrotnym, milionowym mnożeniu odcinków określonej sekwencji DNA w mikroobjętości probówki z cyklicznym powtarzaniem trzech następujących etapów reakcji, z których każdy odbywa się w innym reżimie temperaturowym:

• Etap I - denaturacja dwuniciowego DNA pod wpływem ogrzewania z rozbieżnością jego łańcuchów;
• Etap II - komplementarne wiązanie (hybrydyzacja) starterów (oligonukleotydów starterowych) z końcowymi odcinkami łańcuchów ściśle specyficznego fragmentu DNA, wyselekcjonowanego do amplifikacji;
• Etap III – uzupełnienie łańcucha fragmentów DNA przy użyciu termostabilnej polimerazy DNA.

Do amplifikacji probówka musi zawierać cząsteczki matrycowego DNA. Cztery rodzaje deoksyrybonukleozydowych trifosforanów (nukleotydów) zawierających odpowiadające im zasady azotowe: adeninę (A), tyminę (T), guaninę (G), cytozynę (C); sztucznie syntetyzowane oligonukleotydy starterowe (startery) składające się z 18-20 par zasad; termostabilny enzym, polimerazę DNA, o optymalnej temperaturze 68-72 ^° C, oraz jony magnezu.

Specyficzność PCR zależy od wyboru fragmentu DNA. Zgodnie z nim syntetyzowane są flankujące oligonukleotydy primerów. Specyficzność hybrydyzacji i uzupełniania łańcucha DNA jest określana przez zasadę komplementarności następujących par zasad azotowych: adenina-tymina, guanina-cytozyna.

Aby określić genom prątków gruźlicy kompleksu, najskuteczniejszym celem amplifikacji w większości systemów testowych jest fragment DNA IS6110, który w większości szczepów prątków gruźlicy ma znaczną liczbę (10-20) powtórzeń w genomie, co zapewnia, obok swoistości, wysoką czułość analizy. Jednocześnie opisano szczepy prątków gruźlicy z małą liczbą powtórzeń lub brakiem fragmentu IS6110.

Ekstrakcja cząsteczek DNA z próbki biologicznej

Aby wykonać reakcję PCR, cząsteczki DNA patogenu muszą zostać wyizolowane z materiału biologicznego w minimalnej objętości, z minimalną ilością niespecyficznego DNA i różnymi inhibitorami enzymu - polimerazy DNA.

Przygotowanie próbki musi być przeprowadzone w warunkach zapobiegających zanieczyszczeniu krzyżowemu badanych próbek izolowanymi cząsteczkami DNA. Wymaga to wstępnego naświetlenia pomieszczenia światłem ultrafioletowym, podłóg i powierzchni roboczych stołów i urządzeń - roztworami zawierającymi chlor. Konieczne jest również używanie czystych rękawiczek, jednorazowych probówek i końcówek do pipet automatycznych.

Aby wyizolować DNA Mycobacterium tuberculosis z próbek klinicznych (płyn mózgowo-rdzeniowy, popłuczyny oskrzelowe) niezawierających dużej liczby leukocytów, resztek komórkowych lub soli, wystarczy odwirować próbkę przy 3-4 tysiącach obrotów na minutę, dodać do osadu 20-30 µl 2% roztworu Triton X-100 i podgrzać do temperatury 90 ^o C przez 30 minut.

Przygotowanie próbki plwociny wymaga wydajnego upłynnienia, zazwyczaj przy użyciu 4% wodorotlenku sodu i N-acetylo-L-cysteiny (NALC) w ilości 50-80 mg na próbkę, w zależności od lepkości próbki. Roztwór NALC należy przygotować ex tempore lub proszek NALC można dodać bezpośrednio do próbki w stanie suchym. Po upłynnieniu próbki należy odwirować przez 15 min przy 3500-4000 obr./min (3000 g) w 50 ml probówkach z zakrętką, tj. w takich samych warunkach, jakie są zalecane do przygotowania plwociny przed hodowlą.

Do ekstrakcji DNA z osadu najczęściej stosuje się metodę opartą na użyciu 5-6 molowego roztworu izotiocyjanianu guanidyny jako odczynnika lizującego i mikroporowatych cząstek tlenku krzemu („ziemi okrzemkowej”), które sorbują cząsteczki DNA. Następnie niespecyficzne substancje, w tym możliwe inhibitory, przemywa się 2,5 molowym roztworem izotiocyjanianu guanidyny i roztworem etanolu, po czym cząsteczki DNA są desorbowane w wodzie, a próbki te wykorzystuje się do wykonania PCR. Aby uprościć technologię ekstrakcji DNA, „ziemię okrzemkową” często zastępuje się magnetycznymi mikrocząstkami pokrytymi tlenkiem krzemu. W tym przypadku do wytrącania cząstek zamiast wirowania stosuje się specjalny magnetyczny stojak na mikroprobówki.

Oryginalną metodę immunomagnetycznego rozdzielania prątków gruźlicy z następczą ekstrakcją DNA patogenu opracowano w Rosji. Do immunomagnetycznego rozdzielania prątków gruźlicy stosuje się ferropioniany o wielkości 3-5 μm, pokryte tlenkiem krzemu, do których przyłączono wiązaniem chemicznym poliklonalne (królicze) przeciwciała przeciwko prątkom gruźlicy. Próbki plwociny po lizie alkalicznej neutralizuje się kwaśnym roztworem Tris-HCl i inkubuje z sorbentem immunomagnetycznym. Następnie immunoferropioniany zbiera się za pomocą pręta magnetycznego z wymienną końcówką, przenosi do mikroprobówki i wytrąca. Dodaje się 20-30 μl 2% roztworu Triton X-100 i ogrzewa przez 30 minut w temperaturze 90 ^o C. Nadsącz stosuje się jako matrycę DNA do analizy PCR.

Trudnym problemem jest ekstrakcja DNA prątków gruźlicy z próbek biopsyjnych. Do lizy biopsyjnej stosuje się enzym proteinazę K w stężeniu końcowym 200–500 mg/l w temperaturze 56 ^o C przez noc. Następnie ekstrahuje się go jedną ze znanych metod. Nadmiar niespecyficznego DNA w analizie PCR próbek biopsyjnych często powoduje zahamowanie reakcji, co wymaga ponownej ekstrakcji DNA.

Metody wykrywania wyników

Po zakończeniu reakcji, rozprzestrzenione fragmenty DNA patogenu są identyfikowane za pomocą różnych metod.

Metoda elektroforezy żelowej jest dobrze znana. W tym przypadku uzyskany fragment DNA jest identyfikowany za pomocą kontroli pozytywnej zawierającej pożądany specyficzny fragment DNA lub za pomocą wcześniej znanego rozmiaru (liczby par nukleotydów) fragmentu, który jest określany za pomocą standardowego markera molekularnego.

W obecności specyficznego barwnika – bromku etydyny, który wchodzi w skład dwuniciowego DNA, zsyntetyzowany fragment DNA ujawnia się jako pasmo, które świeci pod wpływem światła ultrafioletowego.

Wielkość fragmentu DNA, ustalona metodą elektroforezy na podstawie odległości przebytej od punktu początkowego, musi odpowiadać znanemu markerowi masy cząsteczkowej lub kontroli pozytywnej.

Inne metody określania wyników PCR opierają się na hybrydyzacji jednoniciowych produktów PCR z komplementarnym oligonukleotydem – sondą DNA znakowaną biotyną, a następnie wykrywaniu za pomocą reakcji enzymatycznej, np. poprzez wiązanie sprzężonego streptawidyny i fosfatazy alkalicznej z biotyną.

W oparciu o ten typ detekcji stworzono analizatory PCR, w których detekcja wyników PCR odbywa się automatycznie w wyniku odczytu gęstości optycznej w próbkach po zajściu reakcji enzymatycznej.

Wady tych metod obejmują możliwość wewnątrzlaboratoryjnego skażenia dość krótkimi fragmentami cząsteczek DNA. Gdy te cząsteczki dostaną się do nowo badanych próbek, stają się matrycą dla PCR i prowadzą do fałszywie dodatnich wyników.

W związku z tym, aby zapobiec fałszywie pozytywnym wynikom, wprowadza się surowe zasady rozdzielania i izolowania pomieszczeń: do ekstrakcji DNA z próbek biologicznych; pomieszczeń do wykrywania wyników (elektroforezy) ze strefy czystej. Pomieszczenia te stanowią strefę prawdopodobnego skażenia. Inną strefą izolowaną jest pomieszczenie czyste do wprowadzania badanych próbek DNA do probówek z mieszaniną reakcyjną do PCR. I wreszcie zakłada się, że główne urządzenie - wzmacniacz DNA - należy wynieść do oddzielnego, być może biurowego, pomieszczenia.

Aby zapobiec zanieczyszczeniu produktami poprzednich reakcji - amplikonami, niektóre systemy testów PCR zawierają deoksyrybonukleozyd urydyny zamiast deoksyrybonukleozydu tymidyny, który jest budowany w odpowiedniej pozycji podczas syntezy łańcucha in vitro, tj. zasada azotowa tymina obecna w natywnym DNA jest zastępowana uracylem. Glikozylaza DNA uracylowa dodana do mieszaniny reakcyjnej analizowanego materiału niszczy tylko fragmenty zanieczyszczające deoksyrydyną, ale nie natywne analizowane DNA zawierające deoksytymidynę. Późniejsze ogrzewanie w temperaturze 94 ^o C inaktywuje ten enzym i nie zakłóca amplifikacji w PCR.

Istnieje system testowy oparty na izotermicznej amplifikacji rRNA, w którym najpierw przeprowadza się odwrotną transkrypcję i syntezę cząsteczek DNA, które z kolei stanowią matrycę do późniejszej syntezy cząsteczek RNA. Amplikony RNA wykrywa się za pomocą sondy DNA barwionej akrydyną podczas hybrydyzacji w roztworze probówki reakcyjnej. Ta metoda, oprócz wysokiej czułości, ma tę zaletę, że przeprowadza analizę w jednej probówce, co zapobiega zanieczyszczeniu. Według autorów czułość tej metody w próbkach oddechowych sięga 90% przy swoistości 99-100%.

Nowe metody wykrywania są wdrażane w PCR w czasie rzeczywistym. Metody te różnią się przede wszystkim tym, że PCR i wykrywanie jego wyników są przeprowadzane jednocześnie w jednej zamkniętej probówce. To nie tylko technologicznie upraszcza metodę analizy, ale także zapobiega zanieczyszczeniu pomieszczeń laboratoryjnych i próbek produktami poprzedniego PCR.

W PCR w czasie rzeczywistym wyniki są wykrywane przez fluorescencję powstającą w wyniku hybrydyzacji fluorogenicznej sondy DNA ze specyficznym fragmentem DNA amplifikowanym podczas PCR. Struktura fluorogenicznych sond DNA jest skonstruowana w taki sposób, że znacznik fluorescencyjny jest uwalniany w wyniku reakcji enzymatycznej lub oddala się od cząsteczki wygaszacza fluorescencji dopiero po specyficznej hybrydyzacji z pożądaną cząsteczką DNA amplifikowaną podczas PCR. W miarę wzrostu liczby cząsteczek zhybrydyzowanych z sondą, wzrost fluorescencji do wykrywalnego poziomu jest proporcjonalny do liczby cząsteczek amplifikowanego produktu. Ponieważ liczba cząsteczek fragmentu DNA jest podwajana podczas każdego cyklu PCR, liczba cykli, od których fluorescencja jest wykrywana i wzrasta, jest odwrotnie proporcjonalna do liczby cząsteczek DNA w oryginalnej próbce. Jeśli do reakcji zostanie wprowadzonych kilka różnych znanych stężeń cząsteczek odpowiadającego fragmentu DNA prątka gruźlicy jako kalibrator, wówczas liczbę genomów DNA w badanym materiale można obliczyć za pomocą programu komputerowego.

Każda próbka standardowa jest duplikowana. Kryterium ilościowym jest minimalna liczba cykli PCR wymagana do wystąpienia i wzrostu wykrywalnej fluorescencji. Oś odciętych to liczba cykli; oś rzędnych to wartość fluorescencji. Stężenia DNA są odwrotnie proporcjonalne do liczby cykli wymaganych do pojawienia się fluorescencji. Okna w prawej kolumnie (21-32) pokazują numery cykli dla odpowiadających stężeń. Różnice między 10-krotnymi stężeniami fragmentów DNA 10 ² -10 ⁶ ml wynoszą 3,2-3,4 cykli. U dwóch pacjentów stężenia fragmentów IS6110 wynosiły około 10 ³ /ml i 10 ⁴ /ml. Biorąc pod uwagę liczbę powtórzeń (6-20) analizowanych fragmentów w genomie Mycobacterium tuberculosis, liczba Mycobacterium tuberculosis w próbkach klinicznych wynosi odpowiednio około 100 i 1000 komórek.

Zastosowanie PCR w diagnostyce gruźlicy

Metoda PCR jest w największym stopniu wykorzystywana do szybkiej diagnostyki gruźlicy - wykrywania Mycobacterium tuberculosis w próbkach klinicznych: plwocinie, popłuczynach oskrzelowych, wysięku opłucnowym, moczu, płynie mózgowo-rdzeniowym, nakłuciach osteolizy, aspiratach żeńskich narządów płciowych i różnych biopsjach. W badaniu w Holandii obejmującym około 500 próbek plwociny i popłuczyn oskrzelowych od 340 pacjentów z potwierdzonym rozpoznaniem gruźlicy płuc, zbadano porównawczą czułość metod PCR, hodowli i mikroskopii rozmazowej. Czułość analizy wyniosła odpowiednio 92,6, 88,9 i 52,4%. Swoistość wszystkich metod wyniosła około 99%.

Porównano skuteczność wykrywania Mycobacterium tuberculosis przy użyciu mikroskopii rozmazowej, wysiewu na podłoże Lowensteina-Jensena, systemu testowego VASTES i analizy PCR. Czułość PCR wyniosła 74,4%, mikroskopii 33,8%, wysiewu na podłoże stałe 48,9%, a VASTES 55,8%. Średni czas wykrywania dla wysiewu na podłoże Lowensteina-Jensena wynosi 24 dni. VASTES 13 dni, PCR 1 dzień.

Przedstawiono również możliwość wykorzystania PCR jako czułej i szybkiej metody monitorowania skuteczności leczenia gruźlicy.

Wykrycie DNA Mycobacterium tuberculosis metodą PCR przy skutecznej chemioterapii jest ustalane w dłuższym okresie czasu - średnio 1,7 miesiąca w porównaniu do wydalania bakterii oznaczonego metodą mikroskopii fluorescencyjnej i 2,5 miesiąca w porównaniu do badania bakteriologicznego.

Diagnostyka pozapłucnych postaci gruźlicy

Znaczenie PCR jako czułej metody jest szczególnie duże w przypadku postaci pozapłucnych, gdyż to właśnie w tych postaciach kliniczne i radiologiczne oraz tradycyjne metody bakteriologiczne oznaczania Mycobacterium tuberculosis w materiałach diagnostycznych okazują się nieskuteczne.

W badaniu próbek moczu wyniki analizy PCR były dodatnie u 16 z 17 pacjentów z aktywną gruźlicą układu moczowego, a ujemne u 4 pacjentów z nieaktywną gruźlicą nerek i 39 pacjentów z niegruźliczymi chorobami układu moczowego.

Wykazano skuteczność analizy PCR w badaniu aspiratów szpiku kostnego u pacjentów z gorączką nieznanego pochodzenia z podejrzeniem gruźliczego charakteru choroby. W diagnostyce gruźliczego zapalenia węzłów chłonnych u dzieci przebadano 102 aspiraty punkcyjne i biopsje 67 dzieci z podejrzeniem gruźliczego zapalenia węzłów chłonnych. Uzyskano wyniki pozytywne: metodą PCR w czasie rzeczywistym - 71,6%, mikroskopią fluorescencyjną - 46,3%, badaniem hodowli - 41,8%. W badaniu 50 biopsji węzłów chłonnych u pacjentów z chorobą kociego pazura wszystkie wyniki były ujemne. Wykazano zatem 100% swoistość analizy PCR. W tej samej pracy wykazano możliwość wykrycia M. avium w biopsji punkcyjnej węzłów chłonnych.

Wiadomo, że diagnoza gruźlicy żeńskich narządów płciowych w niepłodności jest jednym z najtrudniejszych problemów diagnostycznych. Pozytywne wyniki uzyskano w badaniach PCR biopsji endometrium, aspiratów endometrium i próbek płynu z kieszonki Douglasa u 14 (56%) z 25 pacjentek badanych laparoskopowo z podejrzeniem gruźlicy. Badania mikroskopowe rozmazu i hodowli dały odpowiednio 1 i 2 pozytywne wyniki. Te przypadki były również dodatnie w PCR. Większość wyników dodatnich w PCR wystąpiła w przypadkach z charakterystycznymi cechami gruźlicy według badania histologicznego; mniejsza liczba w przypadkach z podejrzeniem gruźlicy według laparoskopii. Tylko jeden pozytywny wynik PCR uzyskano przy braku danych laparoskopowych na gruźlicę.

Podczas diagnozowania pozapłucnych form gruźlicy lekarze często zadają sobie pytanie o możliwość identyfikacji patogenu podczas badania próbek krwi metodą PCR. Dane z literatury wskazują, że wykrycie DNA Mycobacterium tuberculosis z próbek krwi jest możliwe w zaawansowanych postaciach zakażenia HIV. DNA Mycobacterium tuberculosis wykryto tylko w uogólnionej gruźlicy różnych narządów u pacjentów z przeszczepioną nerką i immunosupresją.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Identyfikacja gatunkowa mykobakterii

Metoda PCR może być bardzo skuteczna w szybkiej identyfikacji prątków gruźlicy i niektórych typów prątków niegruźliczych po uzyskaniu ich pierwotnego wzrostu. W tym przypadku zastosowanie PCR może zaoszczędzić 7-10 dni wymaganych do późniejszej identyfikacji kulturowej pozytywnego wyniku. Badanie PCR jest technicznie bardzo proste, ponieważ nie wymaga złożonego przygotowania próbek materiału klinicznego w celu uzyskania wysokiej czułości. Podczas badania 80 pozytywnych kultur w takim systemie testowym (MB BacT. firmy Organon) wszystkie pozytywne wyniki analizy PCR były ściśle specyficzne i zostały przeprowadzone w ciągu 1 dnia. Aby zidentyfikować inne typy prątków po ich uzyskaniu w hodowli, DNA patogenu jest hybrydyzowane ze specyficznymi sondami DNA znakowanymi akrydyną, a szczepy są wykrywane przez pojawienie się chemiluminescencji za pomocą chemiluminometru lub na paskach nitrocelulozowych z oceną wizualną po hybrydyzacji. Zestaw umożliwia identyfikację ograniczonej liczby gatunków: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii i M. gordonae.

A. Telenti i in. opracowali również stosunkowo prostą i niedrogą metodę identyfikacji gatunkowej klinicznie ważnych prątków opartą na PCR i późniejszym traktowaniu dwoma enzymami restrykcyjnymi (enzymami, które mają zdolność cięcia cząsteczki DNA w określonych punktach). W tym przypadku fragment DNA kodujący białko szoku cieplnego (65 kDa) jest amplifikowany, po czym uzyskany w PCR fragment DNA o wielkości 439 par nukleotydów jest traktowany oddzielnie dwoma enzymami - Bste II i Нае III. Następnie, za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, analizuje się dwa uzyskane produkty, określając ich rozmiary (liczbę par nukleotydów) za pomocą zestawu standardowych fragmentów DNA (molekularnych markerów DNA) o długości od 100 do 1000 par nukleotydów. W każdym z określonych gatunków (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum) dla każdego enzymu restrykcyjnego występują 2 lub 3 fragmenty DNA o różnych rozmiarach. Połączenie powstałych fragmentów DNA o różnych rozmiarach pozwala na odróżnienie tych gatunków od siebie.

Opracowywana jest technologia mikromacierzy biologicznego DNA, która umożliwi identyfikację ponad 100 gatunków prątków w ramach jednego badania.

Identyfikację gatunku można przeprowadzić również stosując amplifikację PCR regionu zmiennego 16S rRNA, a następnie sekwencjonowanie amplikonów w porównaniu z odpowiadającą im strukturą pierwotną, co pozwala na identyfikację ponad 40 gatunków prątków.

PCR można również stosować do identyfikacji gatunków w obrębie kompleksu prątków gruźlicy, w tym do różnicowania między M. bovis i M. bovis BCG. Odbywa się to poprzez analizę obecności lub braku niektórych genów w regionach genomowych RD1, RD9 i RD10. RD1 jest nieobecny w M. bovis BCG, ale występuje w gatunkach wirulentnych, w tym M. bovis.

Oznaczanie lekowrażliwości Mycobacterium tuberculosis metodą PCR

Zadania metod genetyki molekularnej w celu określenia wrażliwości lub oporności Mycobacterium tuberculosis na leki sprowadzają się do identyfikacji mutacji w określonych sekwencjach nukleotydowych znanych genów. Główne metody opierają się albo na bezpośrednim odczycie (sekwencjonowaniu) tych sekwencji po amplifikacji, albo na hybrydyzacji znakowanych biotyną fragmentów DNA amplifikowanych podczas PCR z sondami DNA. Obie opcje obejmują identyfikację substytucji w sekwencjach nukleotydowych, które przy użyciu sond DNA prowadzą do braku lub niepełnej hybrydyzacji na membranie nitrocelulozowej przy użyciu koniugatu enzymu (streptawidyna-fosfataza alkaliczna) - metoda LIPA-Rif-TB.

Metoda pomiaru fluorescencji w lokalnie utrwalonych sondach DNA na mikroregionach komplementarnych do znanych mutacji w regionach genów amplifikowanych metodą PCR odpowiedzialnych za wrażliwość lub oporność na leki nazywana jest metodą mikrobiochipów. Podstawowy algorytm przeprowadzania tego badania jest następujący. Po wyizolowaniu DNA z próbki klinicznej lub hodowli mykobakteryjnej należy wykonać PCR w celu amplifikacji odpowiadających fragmentów genu groB odpowiedzialnego za wrażliwość na leki na ryfampicynę lub genów katG i inhA kodujących białka mykobakteryjne odpowiedzialne za wrażliwość na izoniazyd. Wyniki PCR ocenia się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, która potwierdza otrzymanie odpowiadających fragmentów DNA o pożądanej długości. Następnie wykonuje się drugą rundę PCR w celu wprowadzenia znacznika fluorescencyjnego do DNA. Wyniki PCR ponownie potwierdza się za pomocą elektroforezy w żelu. Następnie przeprowadza się hybrydyzację (inkubację przez noc) z późniejszym płukaniem uzyskanego materiału na biochipie, który jest dużą liczbą krótkich łańcuchów DNA (sond) utrwalonych na małej szklanej płytce, komplementarnych do sekwencji nukleotydowych typu prątków gruźlicy lekowrażliwych w punktach możliwych mutacji, a także do sekwencji zmutowanych odpowiedzialnych za lekooporność. Lokalizacja sond DNA na płytce jest ściśle określona, a poziom fluorescencji obserwowany podczas hybrydyzacji w celu ustalenia wyniku za pomocą specjalnego urządzenia odczytującego jest ustalany. W związku z tym wyniki analizy są określane za pomocą specjalnego programu komputerowego.

W ostatnich latach opracowano alternatywne metody określania wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na lek, oparte na technologii PCR w czasie rzeczywistym, co pozwala na przeprowadzenie tych badań w trybie zamkniętych probówek.

Rysunek 13-13 przedstawia wynik analizy kultur klinicznych Mycobacterium tuberculosis w celu określenia lekooporności na ryfampicynę przy użyciu real-time PCR: 218 - próbka kontrolna (wrażliwa na ryfampicynę); 93 - kontrola pozytywna dla mutacji Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - kontrola pozytywna dla mutacji Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - próbki eksperymentalne. Wynik obliczenia krzywych kinetycznych amplifikacji dla 4 kanałów: kanał 1: 393 - kontrola pozytywna dla mutacji Ser-Trp TCG-TGG; kanał 2: 4482 - kontrola pozytywna dla mutacji Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - próbki eksperymentalne; kanał 4: krzywe kinetyczne amplifikacji wszystkich próbek biorących udział w eksperymencie. Kontrola pozytywna reakcji amplifikacji. Wnioski: Analiza ujawniła następujące mutacje, które determinują oporność na ryfampicynę: w próbkach 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Tę samą zasadę zastosowano do określenia lekooporności na izoniazyd przez geny katG i inhA, które determinują najczęstsze mutacje.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Identyfikacja szczepu Mycobacterium tuberculosis

Najbardziej przebadaną metodą identyfikacji szczepu Mycobacterium tuberculosis jest technologia zwana polimorfizmem długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), która opiera się na fragmentacji (restrykcji) DNA Mycobacterium tuberculosis przez enzym Pvu II i późniejszej hybrydyzacji uzyskanych fragmentów z pewnymi specyficznymi sekwencjami na DNA jego powtarzalnego elementu IS6110. Zmienność wewnątrzgatunkowa jest realizowana ze względu na różną liczbę powtórzeń IS6110 i ich lokalizację na DNA, a także różnorodność odległości między pewnymi punktami ataku enzymu restrykcyjnego (miejscami restrykcyjnymi) i elementem IS6110. Technologia ta jest bardzo złożona i pracochłonna. Po potraktowaniu DNA wyizolowanego z hodowli prątków gruźlicy enzymem restrykcyjnym wykonuje się elektroforezę żelową, następnie fragmenty DNA o różnej długości są przenoszone na membranę nitrocelulozową, hybrydyzowane z fragmentami elementu IS6110, a wyniki są wykrywane za pomocą reakcji enzymatycznej. Otrzymany specyficzny wzór pasm charakteryzuje DNA konkretnego szczepu prątka gruźlicy. Analiza komputerowa ujawnia tożsamość lub pokrewieństwo szczepów. Pomimo faktu, że metoda RFLP jest najbardziej dyskryminująca, tj. ujawnia największą liczbę różnic w analizowanych szczepach, jest ona nieskuteczna przy małej liczbie (mniej niż 5) powtórzeń IS6110, obserwowanych w niektórych szczepach. Rysunki 13-14 przedstawiają wyniki typizacji szczepów metodą RFLP.

Alternatywą może być metoda spoligotypingu - analiza polimorfizmu sekwencji dystansowych DNA - pośrednich między bezpośrednimi powtórzeniami regionu DR. Podczas przeprowadzania spoligotypingu szczepów PCR przeprowadza się z primerami ograniczającymi region DR, po czym powstają fragmenty o różnej długości, które hybrydyzują ze zmiennymi pośrednimi regionami DNA. Analiza sekwencji dystansowych regionu DR wydaje się, zdaniem badaczy, prostsza, bardziej produktywna i odpowiednia do pierwotnego przesiewu szczepów i wstępnej analizy epidemiologicznej, a także do bezpośredniego badania materiału klinicznego.

Oczywiście, bardziej skuteczną i dostępną technologicznie metodą jest VNTR (skrót od angielskich słów), czyli metoda określania zmiennej liczby dokładnych powtórzeń tandemowych w DNA prątka gruźlicy. Metoda ta opiera się wyłącznie na wykorzystaniu PCR i nie wymaga dodatkowych manipulacji. Ponieważ liczba powtórzeń tandemowych w różnych szczepach i w różnych miejscach jest różna, na powstałym elektroforegramie produktów PCR określa się fragmenty o różnych rozmiarach i analizuje się je. Zdaniem badaczy, za pomocą VNTR osiąga się większy stopień dyskryminacji szczepów niż w przypadku metody RFLP.

W ostatnich latach wiele uwagi poświęcono rozprzestrzenianiu się szczepów Mycobacterium tuberculosis z rodziny W-Beijing (niektórzy nazywają je szczepem Beijing), które są w dużym stopniu oporne na leki.

Podstawowe wymagania dotyczące jakości badań biologii molekularnej

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Główne dokumenty regulacyjne dotyczące przeprowadzania PCR

Rozporządzenia Ministerstwa Zdrowia Federacji Rosyjskiej: Nr 45 z 7.02.2000; Nr 109 z 21.03.2003; Nr 64 z 21.02.2000. Wytyczne: 1.3.1888-04 „Organizacja pracy podczas badań PCR materiału zakażonego patogennymi czynnikami biologicznymi III-IV grup patogenności”; 1.3.1794-03 „Organizacja pracy podczas badań PCR materiału zakażonego drobnoustrojami I-II grup patogenności”. 2003; 3.5.5.1034-01 „Dezynfekcja materiału badawczego zakażonego bakteriami grup patogenności I-IV podczas pracy metodą PCR”, 2001. Załącznik 11 do Instrukcji w sprawie ujednoliconych metod badań mikrobiologicznych w wykrywaniu, diagnostyce i leczeniu gruźlicy.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personel

Badania biologii molekularnej mogą być wykonywane przez lekarzy diagnostów laboratoryjnych, bakteriologów, wirusologów, biologów zajmujących się diagnostyką kliniczną, a także przez specjalistów ze średnim wykształceniem medycznym, którzy przeszli specjalizację i szkolenie uzupełniające w ustalony sposób.

Układ pomieszczeń laboratoryjnych

Wymagane jest następujące wyposażenie laboratoryjne:

• Pomieszczenie do przetwarzania próbek - laboratorium przystosowane do pracy z czynnikami zakaźnymi grup patogenności III-IV, zgodnie z Wytycznymi Metodycznymi 13.1888-04.
• Obszar przygotowywania mieszanin reakcyjnych PCR to pomieszczenie laboratoryjne zapewniające ochronę przed wewnętrznym zanieczyszczeniem laboratorium – obszar „czysty”.
• • Jeśli do analizy produktów PCR stosuje się elektroforezę lub hybrydyzację, pomieszczenie laboratoryjne, w którym amplifikowane fragmenty DNA są ekstrahowane z probówki amplifikacyjnej i odpowiednio mogą przedostać się do środowiska, zgodnie z wymogami dla laboratoriów PCR (Wytyczne metodologiczne 1.3.1794-03, Wytyczne metodologiczne 1.3.1888-04) musi być całkowicie odizolowane od pomieszczeń określonych w poprzednich akapitach. Przemieszczanie się personelu, sprzętu, materiałów i przedmiotów z obszaru elektroforezy do obszaru przetwarzania próbek i obszaru „czystego”, a także przenoszenie powietrza przez system wentylacyjny lub w wyniku przeciągów, musi być wykluczone. Obszar ten nie jest wymagany do fluorymetrycznego wykrywania produktów PCR.
• Pomieszczenie do dokumentowania i przetwarzania wyników wyposażone jest w komputery i niezbędny sprzęt biurowy. W pomieszczeniu tym może znajdować się sprzęt zapewniający wykrywanie produktów PCR bez otwierania probówki. - detektory fluorescencyjne PCR i termocyklery do PCR w czasie rzeczywistym.

Wymagania sanitarno-epidemiologiczne dotyczące wstępnego przetwarzania plwociny są podobne do standardowych wymagań mikrobiologicznych obowiązujących w przypadku pracy z Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Kompletny zestaw sprzętu laboratoryjnego do diagnostyki PCR

Zestaw laboratoryjny zawiera wyposażenie następujących pomieszczeń.

• pomieszczenie do przygotowywania próbek, zawierające następujące wyposażenie: komora laminarna klasy ochrony II „SP-1.2”: termostat półprzewodnikowy z podgrzewaną pokrywą na probówki Eppendorfa; mikrocentrifuga o prędkości 13 000 obr./min; wirówka („Vortex”); lodówka o zakresie temperatur od -20 ^° C do +10 ^° C; pipety o zmiennej objętości serii „Proline”; pompa z kolbą pułapkową OM-1; stojak na pipety; stojak na stanowisko robocze 200x0,5 ml; stojak na stanowisko robocze 50x1,5 ml; stojaki do przechowywania probówek 80x1,5 ml;
• pomieszczenie do przygotowywania mieszanin reakcyjnych: komora ochronna PCR box ("Laminar-C. 110 cm); wirówka "Vortex"; pipety o zmiennej objętości serii "Proline"; stojak na pipety; stojak na stanowiska robocze 200x0,2 ml; stojaki do przechowywania probówek 80x1,5 ml; lodówka o zakresie temperatur od -20 ^° C do +10 ^° C;
• Pomieszczenie do elektroforezy: komora do elektroforezy poziomej; źródło zasilania; transiluminator;
• Wzmacniacz DNA lub analizator kwasów nukleinowych (PCR w czasie rzeczywistym) z komputerem i oprogramowaniem; może być umieszczony w dowolnym dostępnym pomieszczeniu. Jeśli używana jest technologia PCR w czasie rzeczywistym, pomieszczenie do elektroforezy nie jest potrzebne.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Kontrola jakości zewnętrznej

Aby mieć pewność, że uzyskane wyniki będą obiektywnie wiarygodne, laboratoria muszą uczestniczyć w systemie zewnętrznej oceny jakości badań laboratoryjnych.

Uczestnicy systemu kontroli jakości otrzymują: 12 ampułek z liofilizowanymi zawiesinami komórek bakteryjnych, z czego dwie zawierają E. coli, 3 ampułki z prątkami gruźlicy (szczep awirulentny) o stężeniu 10 ² /ml; 3 ampułki z komórkami podobnego szczepu o stężeniu 10 ⁴ /ml; po 2 ampułki z prątkami niegruźliczymi M. avium-intracellulare i M. kansasii o stężeniu 10 ⁵ /ml.

Testy wysyłane do zewnętrznej oceny jakości są wstępnie testowane w dwóch niezależnych laboratoriach, które mają duże doświadczenie w tej dziedzinie.

[ 85 ], [ 86 ]