Diagnostyka laboratoryjna gruźlicy

Gruźlica jest chorobą łatwą do zdiagnozowania w nowoczesnych warunkach i osiągnięciach naukowych. Diagnostyka laboratoryjna gruźlicy ma zasadnicze znaczenie dla innych metod diagnostycznych, po drugie dla badań rentgenowskich.

[1], [2], [3], [4],

Kliniczny test krwi

U pacjentów z gruźlicą zmiany w ogólnej analizie krwi nie są patognomoniczne. W przypadku ograniczonych i nieaktywnych postaci gruźlicy erytrocyt jest w normalnej ilości niedoborowy. W przypadku masywnych nacieków lub serowaciejącego płuc, podczas gdy częstość serowaciejącego chłonnych, specyficzne zmiany chorobowe jelit, jak również dla dużych płuc lub krwawienia pooperacyjnego i Uwaga erythropenia mikrocytozy, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrocytoza, a zwłaszcza poikilotsitoz spotykają się znacznie rzadziej, zwykle z ciężką niedokrwistością. Liczba retikulocytów w etapie gruźlicy kompensowane w zakresie od 0,1 do 0,6%, przy subcompensated - od 0,6 do 1,0% i 1%, charakteryzuje zdekompensowaną retikulocytów.

W przypadku gruźlicy w niektórych przypadkach może być umiarkowana leukocytozę (do 15 tysięcy leukocytów.), Mniej promieniowania, które pojawiają się w 2-7% pacjentów z ograniczoną i szybki proces występujących form oraz 12,5% - przez niszczące i postępującą gruźlicę .

Najczęstsze przesunięcia występują w formule leukocytów. Oznaczyć względną i bezwzględną neutrofilię, umiarkowane przesunięcie formuły leukocytów w lewo przed promielocytami. Mielocyty są bardzo rzadkie w przypadku nieskomplikowanej gruźlicy. Zwiększenie liczby neutrofili o patologiczną ziarnistość w hemogramie pacjenta z gruźlicą zawsze wskazuje czas trwania procesu: u pacjentów z ciężką gruźlicą prawie wszystkie neutrofile zawierają ziarnistość patologiczną. Kiedy ognisko gruźlicy ustaje, przesunięcie jądrowe stosunkowo szybko zbliża się do normy. Patologiczna ziarnistość neutrofilów zwykle utrzymuje się dłużej niż inne zmiany w hemogramie.

Zawartość eozynofilów w krwi obwodowej jest różna w zależności od fazy procesu i stanu alergicznego organizmu. Ich ilość zmniejsza się do aneosinofilii w ciężkich i przewlekłych wybuchach choroby i, przeciwnie, wzrasta wraz z resorpcją nacieków i wysięków opłucnowych, a także we wczesnych postaciach pierwotnej gruźlicy.

Większości postaci pierwotnej gruźlicy towarzyszy limfopenia, która jest czasami obserwowana przez wiele lat, nawet po bliznowaceniu określonych zmian. Wtórnej gruźlicy w fazie zaostrzenia, w zależności od ciężkości procesu, może towarzyszyć normalna liczba limfocytów lub limfopenia.

Zajmuje miejsce szczególne określającą OB dodatkowe testy, aby ocenić proces gruźlicze (ESR), mający wartość oceny procesu gruźlicy przepływu i określenie jego aktywnej formy. Wzrost ESR sygnalizuje obecność ogniska patologicznego procesu (zakaźnych chorób zapalnych, ropne septycznego, hemoblastosis, Hodgkin i in.) I wskazuje jego ciężkości, a nie normalne poziomy ESR zawsze wskazuje brak patologii. Przyspieszanie sedymentacji erytrocytów ułatwia wzrost zawartości globulin, fibrynogenu, cholesterolu we krwi i zmniejszenie lepkości krwi. Spowolnienie sedymentacji erytrocytów jest charakterystyczne dla stanów, w których występuje hemokoncentracja, wzrost zawartości albuminy i kwasów żółciowych.

Hemogram u pacjentów z gruźlicą zmienia się podczas leczenia. Zmiany hematologiczne zanikają szybciej, im skuteczniejsza interwencja terapeutyczna. Należy jednak pamiętać o wpływie na hemopoezę różnych leków przeciwbakteryjnych. Często powodują one eozynofilię, w niektórych przypadkach - leukocytozę, a częściej leukopenię aż po agranulocytozę i reakcję limfoidalną-siatkową. Systematyczna kontrola hematologiczna i prawidłowa analiza uzyskanych danych są niezbędne do oceny stanu klinicznego pacjenta, dynamiki procesu i skuteczności zastosowanego leczenia.

[5], [6], [7], [8], [9],

Analiza kliniczna moczu

W przypadku gruźlicy układu moczowego głównym badaniem laboratoryjnym jest badanie moczu. Można obserwować leukocyturię, erytrocyturię, białkomocz, hipoizostenurię, prątki gruźlicy, niespecyficzną bakteriurię.

Leukocyturia jest najczęstszym objawem gruźlicy układu moczowego przed wykonaniem specyficznej chemioterapii i jest nieobecna tylko w wyjątkowych przypadkach, na przykład przy całkowitym obliteracji światła przewodu moczowodowego. Test Nechiporenko (oznaczenie liczby leukocytów w 1 ml moczu) pomaga w bardziej obiektywnej ocenie stopnia leukocyturii w nefroterculosis, a w niektórych przypadkach i ujawnienia jej w normalnej ogólnej analizie moczu. Należy jednak wziąć pod uwagę, że leukocyturia może wystąpić w ostrym i przewlekłym odmiedniczkowym zapaleniu nerek, zapaleniu pęcherza moczowego, w zapaleniu cewki moczowej, w nerkach i w moczowodzie.

Eryrocrocyturia. Jak również leukocyturię. Są uważane za jeden z najczęstszych objawów laboratoryjnych gruźlicy układu moczowo-płciowego. Częstość krwiomoczu zależy od rozpowszechnienia procesu, wzrasta wraz z rozwojem destrukcyjnego procesu gruźlicy w nerkach. Erytrocytury bez leukocyturii są bardziej typowe dla wczesnych stadiów gruźlicy nerek. Hematuria, która dominuje nad leukocyturią, jest ważnym argumentem przemawiającym za gruźlicą nerki w jej różnicowaniu z niespecyficznym odmiedniczkowym zapaleniem nerek.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biochemiczne badanie krwi

W przypadku gruźlicy zmiany niektórych parametrów biochemicznych zależą przede wszystkim od fazy procesu, powikłań i różnych współistniejących chorób. U pacjentów z nieaktywną gruźlicą płuc i innych narządów całkowita zawartość białek i frakcji białkowych surowicy krwi pozostaje niezmieniona i określa ich prawidłową zawartość.

W ostrych postaciach choroby, jak również przy zaostrzeniu i progresji przewlekłych postaci gruźlicy, zmniejsza się współczynnik albuminy-globuliny.

Niezbędny w ocenie stanu funkcjonalnego uszkodzenia organicznego i wątrobie w gruźlicy i jej powikłań jest określenie całkowitego poziomu bilirubiny bezpośredniej i AST (ACT), aminotransferazy alaninowej (ALT). Dynamiczne oznaczanie poziomu aminotransferaz. Bilirubina w leczeniu pacjentów z gruźlicą, zwłaszcza w ciężkich postaciach, jest obowiązkowym składnikiem badania biochemicznego pacjentów z gruźlicą i jest przeprowadzana co miesiąc.

Ocena stanu czynnościowego nerek obejmuje oznaczenie stężenia kreatyniny w surowicy i obliczenie wskaźnika filtracji kłębuszkowej zgodnie ze wzorem Cockcrofta-Gaulta. Obliczenie współczynnika filtracji kłębuszkowej za pomocą próbki Reberga daje mniej dokładne wyniki.

Głównym celem dynamicznych badań biochemicznych pacjentów z gruźlicą jest monitorowanie przebiegu procesu, szybkie wykrywanie skutków ubocznych leków i odpowiednie korygowanie powstałych zaburzeń homeostatycznych.

[17], [18], [19]

Zastosowanie biochemicznych metod badań w pozapłucnej gruźlicy

Najbardziej informatywnym wskaźnikiem jest zawartość kwasu tuberkulostearynowego w płynach biologicznych, ale jego definicja wiąże się z trudnościami technicznymi (zapotrzebowanie na chromatografię gazową i spektrometrię masową).

Prospektywny pomiar aktywności deaminazy adenozyny - enzymu oznaczanego w cieczach: maziowej, osierdzia, puchtu lub kręgosłupa. Głównymi producentami deaminaz adenozyny są limfocyty i monocyty. Określenie aktywności deaminazy adenozynowej w płynach biologicznych ułatwia rozpoznanie gruźlicy, zapalenie błony maziowej węzłów chłonnych, gruźliczego zapalenia opon mózgowych, gruźlicy serositis.

Niektóre wskaźniki biochemiczne ze względu na ich niespecyficzność są określane tylko w płynach biologicznych, w pobliżu ogniska uszkodzenia. Zmierz poziom wskaźników w odpowiedzi na podskórne lub śródskórne wstrzyknięcie tuberkuliny (zwykle przed i 48 i 72 godziny po nim). Następnie stopień inkrementacji poziomu markera (w%) jest obliczany w odniesieniu do poziomu początkowego.

Optymalne oznaczanie w moczu aktywności swoistego dla narządu enzymu transamnidazy, którego pojawienie się odnotowano w klęsce nerkowej o różnym charakterze. Badanie transamidynaz jest uzasadnione tylko w warunkach podskórnego wstrzyknięcia tuberkuliny w celu zaostrzenia miejscowego procesu zapalnego. Oznaczyć aktywność transamidyny w moczu początkowo i 24-72 godziny po wprowadzeniu tuberkuliny TE. Zwiększenie fermentacji w 2 i więcej przypadkach pozwala w 82% przypadków odróżnić czynną gruźlicę nerek od zaostrzenia przewlekłego odmiedniczkowego zapalenia nerek.

W przypadku gruźlicy żeńskich narządów płciowych stężenie haptoglobiny i dialdehydu malonowego we krwi określa się w warunkach prowokującego testu tuberkulinowego. Podskórnie wstrzyknięta tuberkulina w dawce 50 TE i 72 godziny później przeprowadziła drugie badanie biochemiczne. W przypadku etiologii gruźlicy stopień wzrostu poziomu haptoglobiny jest nie mniejszy niż 28%, a poziom malonylodialdehydu wynosi 39% lub więcej. Określono także aktywność deaminazy adenozyny w płynie otrzewnowym uzyskanym z przestrzeni Douglasa. Punktacja jest ponownie badana 72 godziny po śródskórnym wstrzyknięciu tuberkuliny w dawkach 0,1 TE i 0,01 TE do projekcji wewnętrznych narządów płciowych na przedniej ścianie jamy brzusznej. Na korzyść procesu gruźlicy wzrost aktywności deaminazy adenozynowej wynosi 10% lub więcej w porównaniu z początkową.

Po uszkodzeniu oka badana jest reakcja ogniskowa, która pojawia się w oku w odpowiedzi na stymulację antygenową. Niepożądane jest rozwinięcie wyraźnej odpowiedzi, której towarzyszy zmniejszenie funkcji wzrokowych. Ponieważ ocena minimalnych reakcji ogniskowych jest często trudna, dla obiektywizacji wniosku zaleca się orientować równolegle i na stopie wzrostu w surowicy krwi haptoglobiny lub deaminazy adenozyny.

Wszystkie badania biochemiczne powinny być prowadzone w połączeniu z innymi metodami.

[20], [21], [22], [23],

Badanie systemu krzepnięcia krwi

Znaczenie stanu badań układu krzepnięcia krwi gruźlicy jest spowodowany przez obecność wielu pacjentów z gruźlicą płuc krwioplucie lub krwotok do płuc, a także powikłań hemocoagulation w chirurgicznym leczeniu gruźlicy. Ponadto utajony przepływ wewnątrznaczyniowej hemocoagulacji, który naturalnie towarzyszy gruźlicy, wpływa na przebieg choroby i skuteczność chemioterapii.

U pacjentów z gruźlicą płucną występowania Składnik wysiękowy zapalenie obserwowanym spadkiem aktywności przeciwzakrzepowej krwi. W przypadku pacjentów o niskiej częstości występowania określonej zmiany w płucach z przewagą hemocoagulation wydajne wewnątrznaczyniowej składnikiem zapalnym wyrażone nieznacznie. U pacjentów z gruźlicą płuc z krwioplucie i płuc państwowej krwotok układu krzepnięcia krwi jest inna: u pacjentów z małą utratą krwi w gemoptoe wysokości lub bezpośrednio po jego zakończeniu jest gwałtowny wzrost zdolności krzepnięcia krwi spowodowane ciężkim nasileniu trombinoobrazovaniya utrzymując zwiększony „strukturalny” krzepnięcie. U pacjentów z masywną utratą krwi obserwuje się spadek potencjału krzepnięcia ze względu na zmniejszenie stężenia fibrynogenu. Aktywność czynnika XIII, liczba płytek krwi. Na etapie leczenia chirurgicznego pacjenci z ograniczonymi postaciami gruźlicy nie doświadczają łagodnych znaczących zaburzeń z układem homeostazy. Pacjenci z powszechnego procesu w wykonaniu pnevmon- lub plevropnevmonektomii często rozwijają DIC, który może przybrać formę „drugiej choroby.”

Do monitorowania stanu krzepnięcia krwi u pacjentów z gruźlicą płucną powinno być przeprowadzane oznaczanie aktywowanego częściowego czasu tromboplastynowego (aPTT), fibrynogenu, trombiny, indeks czasu protrombinowego i czas krwawienia i czas krzepnięcia.

[24], [25], [26], [27], [28]

Badania hormonalne

Współczesne obserwacje eksperymentalne i kliniczne wskazują na obecność zmian w stanie hormonalnym w specyficznym gruźliczym zapaleniu płuc. Jest udowodnione, że korekcja dysfunkcji, systemy przysadki, tarczycy, przysadki, nadnerczy i trzustki w połączeniu z terapii anty-TB przyczyniać się do aktywacji fibrogenezy i naprawy w określonym locus zapalenia.

Stan funkcjonalny układu przysadkowo-tarczycy jest oceniana poprzez określenie zawartości w surowicy krwi trijodotyroniny (T ₃ ), tyroksyny (T ₄ ), przysadkowy hormon tyreotropowy (TSH). Stwierdzono, że subkliniczną niedoczynność tarczycy wykryto u 38-45% pacjentów z gruźlicą płuc, a najczęściej zdiagnozowano ją z rozproszonymi i włóknisto-jamistymi postaciami tego procesu. W tych samych form najbardziej znacząco zmniejszone poziomy zarówno T ₃ i T ₄ i dochodzi równowagi tych hormonów w postaci zwiększenia proporcji T ₄ / T _s.

Funkcji kory nadnerczy, ocenia się poziom kortyzolu w surowicy krwi i funkcji wydzielania wewnętrznego trzustki - stężenie insuliny immuno-reaktywne. W ostrej fazie choroby zakaźnej wzrasta zapotrzebowanie na endogenny kortyzol i insulinę. Hiperinsulinemia jest również wskazane w insulinooporności tkanek ciała, które jest typowe dla każdego aktywnego procesu zapalnego, a zwłaszcza specyficznej. Określenie funkcji glukokortykoidowej nadnerczy z czynną gruźlicą płuc pozwala na wykrycie obecności hiperkortykulacji u większości pacjentów. Normalne poziomy stężenia we krwi kortyzolu u pacjenta z zapaleniem zakaźnych w ostrej fazie powinny być uważane za względne niewydolności glukokortykoidowego funkcji kory nadnerczy, które mogą służyć za podstawę do podtrzymywania stopniowo dawce odpowiedniej terapii zastępczej glukokortykoidów.

Niemal jedna trzecia pacjentów z gruźlicą płuc może stwierdzić, że poziom insuliny w nich jest dość niski i zbliża się do dolnej granicy normy, podczas gdy 13-20% obserwuje znaczny hiperinsulinizm. Zarówno względny hipo- i hiperinsulinizm są czynnikami wysokiego ryzyka rozwoju zaburzeń metabolizmu węglowodanów w różnym stopniu. Te zmiany w funkcjonalnej aktywności komórek B trzustki wymagają regularnego monitorowania glikemii u pacjentów z gruźlicą i szybkiego zapobiegania cukrzycy. Ponadto. Służy to jako dodatkowe uzasadnienie celowości stosowania fizjologicznych dawek insuliny w złożonej terapii gruźlicy.

Ogólnie rzecz biorąc, niższy poziom hormonów tarczycy i ich zaburzenia równowagi hiperkortyzolemii i Hiperinsulinizm największym zasięgiem u pacjentów z ciężkim przebiegiem procesu gruźliczego, z rozległym uszkodzeniem płuc i ciężkimi objawami zatrucia gruźlicy.

Diagnostyka mikrobiologiczna gruźlicy

Badania mikrobiologiczne są niezbędne do identyfikacji pacjentów z gruźlicą, weryfikacji diagnozy, monitorowania i korygowania chemioterapii, oceny wyników leczenia, innymi słowy, od momentu zarejestrowania pacjenta na gruźlicę przed jego zdjęciem.

Wszystkie programy i projekty epidemiologiczne opierają się na ocenie liczby bakteryjnych wydalin, czego nie można dokonać bez zastosowania laboratoryjnych metod wykrywania prątków gruźlicy. W badaniu tak zwanej niezorganizowanej populacji odsetek bakteryjnych najeźdźców sięga 70 lub więcej, co sprawia, że metody laboratoryjne są wystarczająco skutecznym środkiem identyfikacji pacjentów z gruźlicą w tej grupie populacyjnej.

Tradycyjne metody mikrobiologiczne do diagnozowania gruźlicy to badania bakterioskopowe i kulturowe. Nowoczesne metody uwzględniają hodowlę prątków gruźlicy w zautomatyzowanych systemach, ustawienie PCR. Jednak wszystkie te metody muszą łączyć się z klasycznymi metodami bakteriologicznymi.

Zbiór materiałów diagnostycznych

Skuteczność badań laboratoryjnych zależy w dużej mierze od jakości materiału diagnostycznego. Zgodność z zasadami zbierania, przechowywania i transportu materiałów diagnostycznych oraz dokładna implementacja algorytmu oceny pacjenta bezpośrednio wpływa na wynik i zapewnia bezpieczeństwo biologiczne.

Do badań na gruźlicę stosuje się różne materiały. Ze względu na fakt, że TB logkih- najczęstszą postacią zmian gruźliczych, podstawowego materiału do badań pod plwocinie i innych rodzajów odpinanym tchawiczo: górna wydzieliny dróg oddechowych uzyskane po inhalacji aerozolu: Zmywarki oskrzeli; płukania oskrzelowo-pęcherzykowe; materiał otrzymany przez oskrzelowego i do płuc przeztchawiczny biopsji spośród aspiratów oskrzelowych, waciki krtani, wysięki z ran i wymazów al.

Skuteczność badań wzrasta, jeśli prowadzony jest kontrolowany odbiór materiału od pacjenta. W tym celu zostaje przydzielone specjalnie wyposażone pomieszczenie lub zakupione specjalne kabiny. Gromadzenie materiału jest niebezpieczną procedurą, dlatego konieczne jest zbieranie materiałów do badań, z zachowaniem zasad bezpieczeństwa infekcyjnego.

Materiał do badań na prątkach gruźlicy zbiera się w jałowych butelkach z mocno przykręcanymi nasadkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu środowiska i chronić zebrany materiał przed zanieczyszczeniem.

Fiolki do zbierania materiałów diagnostycznych muszą spełniać następujące wymagania:

• muszą być wykonane z odpornego na uderzenia materiału;
• powinien łatwo topić się podczas autoklawowania;
• mieć wystarczającą objętość (40-50 ml):
• mieć szeroki otwór do zbierania plwociny (średnica nie mniejsza niż 30 mm);
• być łatwe w obsłudze, przezroczyste lub półprzezroczyste, dzięki czemu można ocenić ilość i jakość pobranej próbki bez otwierania pokrywy.

Aby uzyskać optymalne wyniki badań, należy przestrzegać następujących warunków:

• Zbierz materiał przed rozpoczęciem chemioterapii;
• materiał do badań należy zebrać przed porannym spożyciem żywności i lekarstw;
• do badań pożądane jest zebranie co najmniej 3 próbek porannej flegmy. Zbierz plwocinę przez 3 kolejne dni;
• zebrany materiał należy dostarczyć do laboratorium tak szybko, jak to możliwe:
• w przypadku, gdy jest to natychmiast niemożliwe do dostarczenia materiału do laboratorium, jest ono przechowywane w lodówce w temperaturze powietrza 4 ° C przez nie więcej niż 48 godzin;
• Podczas transportu materiału należy ściśle monitorować integralność fiolek.

Prawidłowo zebrana plwocina jest śluzowa lub śluzowo-ropna. Optymalna objętość testowanej plwociny wynosi 3-5 ml.

Plwocina jest pobierana pod nadzorem lekarza. Osoby odpowiedzialne za pobieranie plwociny powinny postępować zgodnie z pewnymi zasadami:

• konieczne jest wyjaśnienie pacjentowi celu badania i konieczności kaszlu nie śliną lub śluzem nosogardła, ale zawartością głębokiego układu oddechowego. Można to osiągnąć w wyniku produktywnego kaszlu, który pojawia się po kilku (2-3) głębokich oddechach. Konieczne jest również ostrzeżenie pacjenta, że powinien przepłukać usta przegotowaną wodą, aby usunąć główną część mikroflory rosnącej w jamie ustnej i resztki jedzenia, które utrudniają badanie plwociny;
• pracownik medyczny biorący udział w zbieraniu plwociny, oprócz szlafmycy i czapki, musi nosić maskę, gumowe rękawiczki i gumowy fartuch;
• stojąc za pacjentem, zaleca się trzymać butelkę jak najbliżej jego warg i natychmiast rozdzielać ją na flegmę, gdy kaszle, i należy zapewnić, że przepływ powietrza jest kierowany z dala od pracownika służby zdrowia:
• Po zakończeniu pobierania plwociny pracownik służby zdrowia powinien ostrożnie zamknąć fiolkę pokrywką i ocenić ilość i jakość zebranej plwociny. Następnie butelka jest oznakowana i umieszczona w specjalnym pojemniku w celu przetransportowania do laboratorium.

Lub zastosować irytujący wdychania przy użyciu sprzętu zainstalowanego w pomieszczeniu zebranie - jeśli pacjent nie przed i wcześnie rano w dniu pobrania materiału niezbędnego do dać mu wykrztuśne :. Wyciąg z korzenia prawoślazu (mukaltin), bromheksynę ambroksol, itp wytwarzają śluz, w nocy flegma. Materiał zebrany w ten sposób nie podlega konserwacji i powinien zostać sprawdzony w dniu pobrania. Aby uniknąć jego "uboju" w laboratorium w kierunku, należy zrobić specjalną ocenę.

Jeśli badania mikrobiologiczne nie zostaną przeprowadzone w tym zakładzie, zebrany materiał diagnostyczny powinien być centralnie dostarczony do laboratorium, pod warunkiem, że materiał jest przechowywany w odstępach czasu między dostawami w lodówce lub przy użyciu środków konserwujących. Dostarcz materiał do laboratorium w pudłach transportowych, które można łatwo dezynfekować. Każda próbka powinna być zaopatrzona w odpowiednią etykietę, a cała partia powinna zostać wypełniona załączonym formularzem.

[29], [30], [31],

Tryby i częstotliwość badań pacjentów

Na wstępnym, tak zwanym diagnostycznym, badaniu pacjenta na gruźlicę, należy zbadać co najmniej 3 porcje plwociny przez 2 lub 3 dni. Gromadzone pod nadzorem personelu medycznego, co zwiększa skuteczność mikroskopii.

Podstawowe badania przesiewowe na gruźlicę powinny być przeprowadzone przez wszystkie medyczne ośrodki diagnostyczne systemu opieki zdrowotnej. Niedawno zorganizowano tak zwane centra mikroskopii, wyposażone w nowoczesne mikroskopy i sprzęt zapewniający bezpieczeństwo epidemiczne, w oparciu o kliniczne laboratoria diagnostyczne w celu poprawy skuteczności wstępnego badania.

W obiektach przeciwgruźliczych stosuje się test przesiewowy, który obejmuje badanie plwociny lub innego materiału diagnostycznego przez co najmniej 3-krotne przez 3 dni. Podczas leczenia badania mikrobiologiczne są przeprowadzane regularnie co najmniej raz w miesiącu w fazie intensywnej chemioterapii. Po przejściu do fazy leczenia badania są przeprowadzane rzadziej - w odstępie 2-3 miesięcy, a częstotliwość badania jest zmniejszana do dwóch.

Cechy kolekcji materiałów diagnostycznych dla gruźlicy pozapłucnej

Cecha patologicznego materiału z formy TB pozapłucnej - Mycobacterium tuberculosis niskim stężeniu w nim, co wymaga bardziej czułych metod badań mikrobiologicznych, przede wszystkim na podłożu techniki zasiewu.

W przypadku gruźlicy układu moczowo-płciowego mocz jest najbardziej dostępnym materiałem do badań. Pobieranie moczu powinno być wykonywane przez specjalnie przeszkoloną pielęgniarkę.

Zewnętrzne narządy płciowe są przemywane wodą z mydłem lub słabym roztworem nadmanganianu potasu. Zewnętrzne otwarcie cewki moczowej jest dokładnie traktowane. W sterylnej fiolce zbiera się średnią porcję moczu: u mężczyzn, naturalnie u kobiet, z użyciem cewnika. Mocz z miednicy nerkowej zbiera się w jałowych probówkach z cewniowaniem jednej lub dwóch nerek, w tym ostatnim przypadku - koniecznie oddzielnie od każdej nerki. Niewielką ilość tego moczu odwirowuje się, bada się osad.

U mężczyzn, plemniki, punkcikowate jądra, sekret prostaty poddaje się odwirowaniu w celu uzyskania osadu. Przy każdej lokalizacji określonego procesu w obszarze narządów płciowych u mężczyzn, masaż prostaty może promować wydzielanie wydzielin zawierających prątki gruźlicy.

Krew menstruacyjną u kobiet pobiera się przez ssanie lub używanie czapki Kafki. Otrzymany materiał jest uwalniany z czerwonych krwinek, przemywa go wodą destylowaną, a następnie wiruje. Osad jest badany.

Przydziały z kanału szyjki macicy są gromadzone w niektórych pojemnościach Kafki lub czapce, to jest pożądane jest, aby gromadzić 1-2 ml materiału patologicznego.

Materiał uzyskany z interwencji operacyjnych na nerki, narządy płciowe. Z biopsjami, zeskrobaniami z endometrium, homogenizować. W tym celu umieszcza się ją w jałowym moździerzu i dokładnie rozkrusza za pomocą sterylnych nożyczek. Do tej zawiesiny dodano jałową piasku rzecznego w ilości równej wagi, a następnie uzupełniono 0,5-1.0 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu, a wszystko roztarto aż do masy o konsystencji pasty z dodatkiem izotonicznego roztworu chlorku sodu (4-5 ml). Następnie masę pozostawia się do odstania na 1-1,5 minuty, bada się supernatant.

Gruźlica kości i stawów. Punktowy (ropa ropni) uzyskany za pomocą jałowej strzykawki umieszczany jest w sterylnych naczyniach i natychmiast dostarczany do laboratorium. Sterylną pipetę, wcześniej zwilżoną sterylnym izotonicznym roztworem chlorku sodu, pobrać 2-5 ml ropy, przenieść do butelki z koralikami i dodać kolejne 2-3 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu. Butelkę zamyka się korkiem i wstrząsa w aparacie jokera przez 8-10 minut. Badano homogenizowaną zawiesinę.

W gruźliczych postaciach gruźlicy okołostawowej pobierana jest ropa z przetoki. Obfite wydzielanie jest pobierane bezpośrednio do probówki. W przypadkach niedostatecznego wydalania ropą przetokę przemywa się jałowym izotonicznym roztworem chlorku sodu, a wodę myjącą zebraną w probówce lub kawałku tamponu zaimpregnowanego ropą przesyła się do badania.

Materiał chirurgiczny uzyskany podczas zabiegów chirurgicznych na kościach i stawach może składać się z ropnych nekrotycznych mas, granulacji, tkanki bliznowatej, tkanki kostnej, błony maziowej i innych substratów. Jego leczenie odbywa się tak, jak w gruźlicy nerek.

Badanie mikrobiologiczne mazi stawowej w 3% roztworze cytrynianu sodu (stosunek 1: 1) w celu zapobiegania koagulacji wykonuje się bezpośrednio po przebiciu.

Gruźlica węzłów chłonnych. Badana jest również ropa, wydobywana podczas nakłuwania węzłów chłonnych. Jako ropa ropni. Badane są tkanki węzłów chłonnych uzyskane podczas zabiegów chirurgicznych, biopsji, tak jak w przypadku innych postaci gruźlicy.

Badanie mas stolca na prątkach gruźlicy jest niezwykle rzadkie, ze względu na prawie całkowity brak pozytywnych wyników.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mikroskopia mikobakterii

Mikroskopia plwociny to stosunkowo szybka, prosta i niedroga metoda, którą należy stosować we wszystkich przypadkach z podejrzeniem gruźlicy. Ponadto, badanie to jest prowadzone w celu oceny skuteczności chemioterapii i ustalenia powrotu do zdrowia lub niepowodzenia leczenia, jeśli nie ma testu na kulturę.

Stosuje się dwie metody badania mikroskopowego:

• metoda bezpośredniej mikroskopii, gdy rozmaz jest przygotowywany bezpośrednio z materiału diagnostycznego;
• metoda mikroskopii osadu przygotowanego z materiału poddanego obróbce dekontaminacyjnej do hodowli.

Pierwszą metodę stosuje się w tych laboratoriach, w których prowadzone są jedynie badania mikroskopowe (kliniczne i diagnostyczne laboratoria ogólnej sieci medycznej).

Najlepsze wyniki badania mikroskopowego uzyskuje się przez zatężanie materiału diagnostycznego (na przykład przez odwirowanie).

Aby wykryć prątki gruźlicy z prawdopodobieństwem 50% podczas przeprowadzania mikroskopii, 1 ml plwociny powinno zawierać ponad 5000 komórek drobnoustrojów. Plwocina pacjentów z gruźliczymi postaciami płuc zawiera zwykle znaczną ilość bakterii odpornych na kwasy, co pozwala na ich wiarygodne wykrywanie za pomocą bakterioskopii. Czułość diagnostyczną tej metody można poprawić, badając kilka próbek plwociny u jednego pacjenta. Negatywny wynik badania bakterio-skopowego nie wyklucza rozpoznania gruźlicy, ponieważ plwocina niektórych pacjentów zawiera mniej prątków niż można wykryć za pomocą mikroskopii. Złe przygotowanie plwociny może również spowodować negatywny wynik badania bakterio-skopowego.

Najczęściej stosowaną metodą wykrywania prątków kwasochłonnych w rozmazie jest barwa według Tsiol-Nelsen. Metoda opiera się na penetracji fuksyny karbolowej do komórki drobnoustrojowej przez membranę, która zawiera warstwę woskowo-lipidową, jednocześnie ogrzewając i silnie trawiąc działanie fenolu. Późniejsze odbarwienie rozmazu za pomocą 25% roztworu kwasu siarkowego lub 3% kwasu solnego prowadzi do odbarwienia wszystkich struktur, które nie są kwasoodporne. Odbarwione elementy wymazu są zabarwione 0,3% roztworem błękitu metylenowego. Mykobakterie nie dostrzegają zwykłych barwników anilinowych, w wyniku czego kwasooporne prątki są zabarwione na kolor szkarłatny, a inne mikroby i elementy komórkowe - na niebiesko.

Dla rozmazów barwionych przez Ziehl-Nelsenu użyciu światło z soczewki mikroskopu dwuokularowego imersyjny (90- lub 100-krotny wzrost) i okularu na 7 lub 10-krotnym powiększeniu. Zbadaj 100 pól widzenia, które są wystarczające do zidentyfikowania pojedynczych prątków w rozmazie. W przypadku negatywnego wyniku takiego badania, dla potwierdzenia zaleca się obejrzenie kolejnych 200 pól widzenia. Zapisz wyniki, wskazując liczbę wykrytych kwasoopornych prątków (KUM).

Oprócz tej techniki, kolorowe fluorochromy są używane do mikroskopii luminescencyjnej, co pozwala osiągnąć najlepsze wyniki. Zastosowanie tej metody zwiększa wydajność mikroskopii o 10-15%. Podczas leczenia prątków barwnikami luminescencyjnymi (auraminą, rodaminą itp.) Substancje te wiążą się również z woskowymi strukturami komórki drobnoustrojów. Podczas napromieniowywania kolorowych komórek ekscytującym źródłem światła (pewnym spektrum promieniowania ultrafioletowego), zaczynają świecić pomarańczowym lub jasnym czerwonym światłem na czarnym lub ciemnozielonym tle. Ze względu na wysoką jasność i kontrast obrazu widzialnego, całkowite powiększenie mikroskopu można zmniejszyć 4-10 razy, pole widzenia rozszerza się, a czas oglądania preparatu maleje. Wraz z tym, ze względu na znacznie większą głębię ostrości, można zwiększyć komfort badania.

Kiedy do obserwacji tego samego obszaru używa się mikroskopii fluorescencyjnej, rozmaz uzyskuje znacznie mniej czasu niż w przypadku mikroskopii świetlnej barwienia Tsiol-Nelsen. Jeśli na dzień roboczy mikroskop analizuje około 20-25 takich wymazów, to za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej może zbadać więcej niż 60-80 próbek w tym samym czasie. Doświadczeni mikroskopiści wiedzą, że zabarwienie komórek za pomocą mieszaniny auraminy i rodaminy jest w pewien sposób charakterystyczne dla prątków o wysokiej kwasowości, które w tym przypadku wyglądają jak złote kije. Saprofity są pomalowane na zielonkawy kolor.

Inną ważną zaletą metody mikroskopii fluorescencyjnej - zdolność do wykrywania zmienionych tuberculosis, traci pod wpływem szkodliwych czynników, w tym intensywnej chemioterapii, własności kislotousotoychivosti i nie są wykrywane w związku z tym barwienia Ziehl-Nelsenu.

Wady metody mikroskopii fluorescencyjnej obejmują stosunkowo wysoki koszt mikroskopu i jego działanie. Jednak w scentralizowanych lub innych dużych laboratoriach, gdzie obciążenie przekracza normę 3 techników laboratoryjnych pracujących z trzema konwencjonalnymi mikroskopami, taniej jest używać zamiast tego jednego mikroskopu fluorescencyjnego.

Metody bakteriologiczne mają raczej wysoką swoistość (89-100%). Około 97% pozytywnych wyników uzyskanych za pomocą dowolnej metody mikroskopii jest jednoznacznie potwierdzone wynikami siewu.

Należy zauważyć, że podczas badania mikroskopowego wymazu materiału patologicznego niemożliwe jest określenie gatunku należącego do zidentyfikowanych kwasoopornych prątków. Metoda mikroskopii pozwala na nadanie opinii tylko w obecności lub nieobecności kwasu, do wytwarzania drobnoustrojów, co może być wyjaśnione przez istnienie w przyrodzie dużej liczby morfologicznie podobne do gruźliczych mykobakterii złożonych mikroorganizmów kwasoodpornych nontubercular.

Wyniki mikroskopii są oceniane w jednostkach półilościowych.

Aby móc porównać wyniki różnych metod mikroskopii, wprowadza się współczynniki empiryczne. Na przykład, w celu porównania wyników z rozmazów barwionych barwników fluorescencyjnych pod mikroskopem w świetle badań danych (1000 krotne powiększenie), konieczne jest podzielenie liczby kwasów prątków wykrytego przez mikroskopu fluorescencyjnego, odpowiedni współczynnik w 250-krotnym powiększeniu - do 10, 450-krotnie - do 4, z 630-krotnie - do 2.

Cechy mikroskopii w przypadku pozapłucnej gruźlicy

Przeprowadza się bezpośrednią mikroskopię, a także mikroskopię wymazów przygotowanych po wzbogaceniu, a następnie barwniki lub luminescencyjne barwniki Tsiol-Nelsen. Bezpośrednia mikroskopia wymazów jest nieskuteczna ze względu na niskie stężenie prątków w materiale, a zatem bardziej racjonalne jest stosowanie metod wzbogacania. Najbardziej skuteczne jest odwirowanie. Jeśli materiał biologiczny jest lepki, wirowanie jest stosowana z jednoczesnym upłynnienia i homogenizacja materiału, które przeprowadza się przy użyciu wirówki o dużej szybkości, z siłą odśrodkową 3000 g i roztworów podchlorynu. Inne metody wzbogacania, takie jak mikro flotacja, nie są obecnie stosowane ze względu na tworzenie biologicznie niebezpiecznych aerozoli.

[37], [38],

Kulturowa metoda diagnozy gruźlicy

Metoda siewu lub metoda hodowli jest bardziej czuła niż mikroskopia wymazowa i ma wiele zalet w stosunku do tej drugiej. Pozwala wykryć kilkadziesiąt żywych prątków w badanym materiale i ma dużą wartość diagnostyczną. Jest to szczególnie ważne podczas badania materiału od nowo zdiagnozowanych lub leczonych pacjentów, którzy uwalniają niewielką ilość prątków.

W porównaniu z mikroskopem badania nad kulturą umożliwiają zwiększenie liczby pacjentów z TB zdiagnozowanych o ponad 15-25%, a także weryfikują gruźlicę we wcześniejszych stadiach, gdy choroba nadal jest podatna na leczenie. Bardzo ważną zaletą testu hodowlanego jest możliwość uzyskania hodowli wzbudnicy, którą można zidentyfikować i zbadać pod kątem wrażliwości na leki, wirulencji i innych właściwości biologicznych.

Wady metod uprawy to czas ich trwania (czas oczekiwania materiałów sięga 10 tygodni). Wyższy koszt, złożoność przetwarzania materiału diagnostycznego.

Zasady przedoperacyjnego leczenia materiału diagnostycznego

Konwencjonalne metody mikrobiologiczne nie mogą być stosowane w badaniach nad gruźlicą. Wynika to z faktu. że prątek gruźlica rośnie bardzo powoli, a większość próbek klinicznych zawiera szybko rosnące pyogenne i gnilne mikroorganizmy, grzyby. Ich szybki wzrost na bogatych pożywkach zakłóca rozwój prątków i nie pozwala na izolację czynnika wywołującego gruźlicę, więc materiał diagnostyczny musi zostać poddany wstępnej obróbce przed zaszczepieniem. Ponadto, prątki uwalniane z dróg oddechowych pacjenta są zwykle otoczone dużą ilością śluzu, co utrudnia koncentrację. W związku z tym przed zasadzeniem plwociny i innych podobnych materiałów konieczne jest ich upłynnienie, odkażenie.

Wszystkie detergenty i dekontaminy mają mniej lub bardziej wyraźny efekt toksyczny na prątki. W wyniku przetwarzania może zginąć nawet do 90% prątków. Aby utrzymać dostatecznie populacji bakterii grzybiczych, oszczędzając potrzebę stosowania technik przetwarzania danych, które pozwalają, z jednej strony, w celu stłumienia szybko rosnących bakterii ropotwórcze i zgnilizny, a z drugiej - do zachowania żywotności bakterii grzybiczych w materiale.

W zależności od materiału, stopnia jednorodności i zanieczyszczeń dla obróbki wstępnej przy użyciu różnych odkażający: plwociny - 4% roztworu wodorotlenku sodu, roztwory trohzameschonnogo fosforanu sodu o stężeniu 10%, chlorek benzalkonium, fosforan trisodowy, NALC NaOH (N-acetylo-L-cysteiny wodorotlenek sodu) w końcowym stężeniu 1% NaOH, w moczu i innych materiałów płynnych - roztwór kwasu siarkowego, 3%, w stosunku do zanieczyszczonych próbek materiałów zawierających tłuszczu - roztwór kwasu szczawiowego do 5%. Ponadto w niektórych przypadkach stosuje się enzymy, surfaktanty (detergenty). Stosowaniu Tween i niektórych innych detergentów towarzyszy mniejsza śmierć komórek prątków (40-50% przeżyć). Można je jednak stosować tylko do materiałów płynnych. Największą dystrybucją na świecie był NALC-NaOH. Wyprodukowany w zestawach. Ta metoda pozwala przydzielić więcej niż 85% populacji komórek prątków. Dekontaminacja materiałów stałych zawierających tkaniny jest trudniejsza, ponieważ trudno jest odgadnąć stopień dyspersji materiału podczas homogenizacji. Na przykład w leczeniu biopsji węzłów chłonnych często towarzyszy zwiększona częstotliwość skażenia przez obcą florę. W takim przypadku można użyć 1% etonium.

Niejednorodny materiał homogenizuje się za pomocą szklanych perełek w obecności odkażających. Ciekłe materiały odwirowuje się wstępnie i traktuje tylko osad.

Techniki siewu i inkubacji

Po obróbce wstępnej materiał jest odwirowywany, wytrącając prątki i zwiększając ich zawartość w osadzie ("wzbogacanie osadu"). Uzyskany osad neutralizuje się i zaszczepia (zaszczepia) gęstymi pożywkami odżywczymi lub probówkami z ciekłymi (półstałymi) pożywkami. Z pozostałej części osadu przygotowuje się rozmazy do badania mikroskopowego. Technika zaszczepiania powinna zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu materiału diagnostycznego.

Aby uzyskać wiarygodną kliniczną interpretację wyników badania mikrobiologicznego, należy przestrzegać następującej zasady: badania mikroskopowe i kulturowe muszą być wykonywane równolegle z tej samej próbki materiału diagnostycznego.

Zaszczepione probówki umieszcza się w termostacie w temperaturze 37 ^° C na 2 dni w pozycji poziomej. Zapewnia to bardziej równomierne wchłanianie materiału do pożywki hodowlanej. Po 2 dniach probówki są przenoszone do pozycji pionowej i hermetycznie zamykane gumowymi lub silikonowymi zatyczkami, aby zapobiec wysychaniu wysianych mediów.

Uprawy są inkubowane w temperaturze 37 ^o C przez 10-12 tygodni z regularnego oglądania tygodniowym. Dla każdego podglądu rejestrowane są następujące parametry:

• okres obserwowany wizualnie od dnia siewu;
• stopa wzrostu (liczba CFU);
• zanieczyszczenie uprawy przez obcą florę bakteryjną lub grzyby (takie probówki są usuwane);
• brak widocznego wzrostu. Rurki pozostają w termostacie do następnego oglądania.

Pożywki

Różne podłoża odżywcze są stosowane do hodowli prątków; gęsty, półpłynny, płynny. Jednak żadna ze znanych pożywek nie ma właściwości zapewniających wzrost wszystkich komórek prątków. W związku z tym zaleca się jednoczesne stosowanie 2-3 różnych pożywek o różnych składach w celu zwiększenia skuteczności.

WHO zaleca środowisko Levenstein-Jensen jako standardowe medium do pierwotnej izolacji czynnika wywołującego gruźlicę i do określania jego wrażliwości na leki. Jest to gęste środowisko jajeczne, w którym wzrost prątków uzyskuje się w 20. I 25. Dniu po wysianiu bakterioskopicznie dodatniego materiału. Uprawy materiału bakteriologicznie ujemnego wymagają dłuższego okresu inkubacji (do 10-12 tygodni).

W naszym kraju proponowana E.R. Finn - środowisko jajek Finn-II. Różni się tym, że zamiast L-asparaginy używa glutaminianu sodu, który uruchamia inne sposoby syntezy aminokwasów prątków. Wzrost pojawia się na tym podłożu nieco wcześniej, a częstotliwość alokacji prątków jest o 6-8% wyższa niż w podłożu Lowenstein-Jensen.

Aby poprawić skuteczność diagnostyki bakteriologicznej pozapłucnej gruźlicy, zaleca się włączenie modyfikowanych pożywek Finn-II do kompleksu pożywek. W celu przyspieszenia wzrostu dodaje się tioglikolan sodu 0,05%, który zmniejsza stężenie tlenu, do pożywki Finn-II. Aby chronić układy enzymatyczne prątków przed toksycznymi produktami peroksydacji lipidów w pożywce Finn-II, dodaje się przeciwutleniacz octan α-tokoferolu w stężeniu 0,001 μg / ml. Wysiew materiału diagnostycznego przeprowadza się zgodnie ze standardową procedurą.

W rosyjskich laboratoriach przeciwgruźliczych stosowane są również inne modyfikacje gęstych pożywek; zaproponował G.G. Mordoviańska pożywka "New", opracowana przez V.A. Anicic media odżywcze A-6 i A-9, itp.

Ze względu na fakt, że w procesie chemioterapię uszkodzenie różnych systemów metabolizmu komórek drobnoustrojów, niektóre prątkowy populacja traci zdolność do rozwijania się zwykle w konwencjonalnych podłożach odżywczych i wymaga osmotycznie zrównoważonej (lub półpłynna) podłoża hodowlanego.

Ocena i rejestracja wyników wysiewu materiału diagnostycznego

Niektóre szczepy i gatunki mykobakterii rosną powoli, wzrost może pojawić się nawet do 90. Dnia. Liczba takich roślin jest niewielka, ale pozwala to wytrzymać uprawy w termostacie przez 2,5-3 miesiące.

Wirulentne kultury prątków gruźlicy zwykle rosną na gęstych jajach w postaci kolonii typu R o różnych rozmiarach i gatunkach. Kolonie suche, pomarszczone, kości słoniowej, lekko pigmentowane. W innych mediach kolonia Mycobacterium tuberculosis może być bardziej wilgotna. Po zakończeniu chemioterapii lub podczas leczenia można wydzielić gładkie kolonie o wilgotnym wzroście (formy S).

Podczas izolowania upraw, w celu odróżnienia prątków gruźlicy od prątków gruźlicy i saprofitów opornych na kwasy stosuje się specjalne badania.

Pozytywną odpowiedź podaje się po obowiązkowym badaniu mikroskopowym wybarwionego rozmazu Tsiol-Nelsen z hodowanych kolonii. W przypadku wzrostu prątków w rozmazach, występują jasne czerwone patyki, które leżą pojedynczo lub w grupach tworząc skupiska w postaci filcu lub warkoczy. U młodych kultur, zwłaszcza wyizolowanych z długotrwałym leczeniu pacjentów z chemioterapią, prątki różnią Polimorfizm wyrażone do obecności w kształcie pręta, jak również krótkie prawie kokoidalnych lub wydłużonych wersji, które przypominają grzybnię.

Szybkość wzrostu prątków jest określona przez następujący schemat: (+) - 1-20 cfu in vitro (niewielkie wydzielanie bakteryjne); (++) - 20-100 CFU in vitro (umiarkowane wydalanie bakteryjne); (+++) -> 100 CFU in vitro (obfite wydzielanie bakteryjne). W diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy nie wystarczy odpowiedzieć na pytanie, czy Mycobacterium wykryto w ten czy inny sposób. Mieć szczegółową wiedzę na temat zakresu i charakteru populacji prątków, jej składu i właściwości. To właśnie te dane pozwalają nam prawidłowo interpretować stan procesu, planować taktyki i odpowiednio korygować leczenie.

W ostatnich latach, w celu przyspieszenia wzrostu prątków, zaproponowano pożywki na podłożu agarowym z różnymi dodatkami do wzrostu i zastosowanie specjalnej mieszaniny gazów. Aby uzyskać wzrost prątków na tych podłożach, podczas uprawy powstaje atmosfera o wysokiej zawartości dwutlenku węgla (4-7%). W tym celu stosowane są specjalne inkubatory CO ₂. Jednak najbardziej rozwinięte zautomatyzowane systemy do hodowli prątków: MGIT-BACTEC-960 i MB / Bact.

Jednym z takich systemów - System MGIT (wzrost prątków wskazując rury), co wskazuje na rozwój nowoczesnych technologii i jest przeznaczona do szybkiego bakteriologicznego diagnostyce gruźlica i Mycobacterium wrażliwości na leki pierwszego rzutu, oraz niektóre leki drugiego rzutu. MGIT koncentruje się na używaniu go jako części urządzenia VASTES-960. Mikroorganizmy uprawia się w specjalnych probówkach z płynną pożywką opartą na zmodyfikowanym podłożu Middlebrook-7H9. Aby stymulować wzrost prątków i hamować wzrost mikroflory obcej, stosuje się MGIT Growth Supplement i mieszaninę leków przeciwbakteryjnych PANTA.

Wzrost mikroorganizmów jest rejestrowany optycznie. Opiera się na fluorescencji, która pojawia się, gdy w trakcie wzrostu tlen jest zużywany przez prątki. Zależny od tlenu barwnik fluorochromowy znajduje się na dnie specjalnej probówki i pokryty warstwą silikonu. Powielanie prątki prowadzi do zmniejszenia ilości tlenu w rurze i zmniejszając stężenie, które powoduje wzrost fluorescencji, która staje się widoczna pod wpływem promieniowania ultrafioletowego przez świetlówki i automatycznie rejestrowane fotodetektora Wbudowane urządzenie VASTES-960. Intensywność luminescencji jest rejestrowana w jednostkach wzrostu (jednostki wzrostu GU). Dane dotyczące wzrostu są zapisywane na komputerze, gdzie można je zapisać automatycznie. Komputerowa analiza krzywych wzrostu może dostarczyć informacji na temat obecności różnych puli prątków, w tym nie-gruźlicy, a także pomaga ocenić właściwości wzrostu prątków.

W wyniku wprowadzenia takich systemów znacznie zmniejszył się czas wzrostu prątków, średnio 11 dni na VASTES-960 i 19 dni na MB / Bact w porównaniu do 33 dni na standardowym gęstym podłożu odżywczym. Należy zauważyć, że systemy te wymagają wysoko wykwalifikowanego personelu. Zasiewowi materiału na ciekłych pożywkach towarzyszy bezwzględnie zasiew na podłożu Levenstein-Jensen, który pełni rolę kopii zapasowej w przypadkach, gdy prątki gruźlicy nie powodują wzrostu w innych pożywkach.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Oznaczanie wrażliwości na leki mykobakterii

Określenie spektrum i stopnia wrażliwości prątków na leki przeciwgruźlicze ma ogromne znaczenie kliniczne, a także epidemiologiczną ocenę rozprzestrzeniania się gruźlicy z lekoopornością. Ponadto monitorowanie oporności na leki umożliwia ocenę skuteczności całego programu gruźlicy, będącego integralnym wskaźnikiem działania wszystkich składników działań przeciwgruźliczych.

Wielość i czas wrażliwości na leki:

• przed rozpoczęciem leczenia, aby określić strategię i taktykę leczenia:
• gdy wyizolowane są z chorych hodowli różnych materiałów (plwociny, płyn BAL, mocz, wysięki, alkohol itp.), bada się wszystkie izolowane szczepy:
• pod koniec intensywnej fazy leczenia w przypadku braku dynamiki klinicznej i radiologicznej:
• jeśli konieczna jest zmiana schematu leczenia w następujących przypadkach:
  • brak rozmazu w plwocinie;
  • ponowna izolacja kultury po rozmazie plwociny;
  • drastyczny wzrost liczby CMU w wymazie po początkowym spadku. Dobrze wiadomo, że szczepy prątków gruźlicy, które są niejednorodne pod względem wrażliwości na leki, są izolowane z materiału od pacjenta z gruźlicą. Wrażliwość szczepów na leki przeciwgruźlicze może się różnić w zakresie leków, stopnia, częstotliwości i częstości występowania oporności.

Stopień lekooporności prątków gruźlicy określa się zgodnie z ustalonymi kryteriami, które są ukierunkowane na kliniczne znaczenie oporności i zależą od przeciwgruźliczej aktywności leku, jego farmakokinetyki, stężenia w ognisku uszkodzenia. Maksymalna dawka terapeutyczna i tak dalej.

Oznaczanie wrażliwości na leki prątków jest obecnie prowadzone metodami mikrobiologicznymi:

• Bezwzględne stężenia (metoda rozcieńczania na gęstym lub płynnym podłożu odżywczym),
• proporcje,
• współczynnik oporu.

Zwykle oporność objawia się w postaci wizualnie obserwowanego wzrostu kolonii prątków gruźlicy, ale istnieją metody, które indukują wzrost we wczesnych etapach podziału komórek prątków w postaci reakcji barwnych. Te metody skracają czas testu z 3-4 do 2 tygodni.

Jako zjednoczone w Rosji został rozszerzony, zalecany przez chemioterapię metody Komitetu, który stężeń bezwzględnych, co jest z metodologicznego punktu widzenia, jest najbardziej proste, ale wymaga dużej precyzji i standaryzację procedur laboratoryjnych. Test wrażliwości na lek składa się z zestawu probówek z pożywką zmodyfikowaną lekami przeciw TB. Zestaw składa się z 2-3 rur z różnych stężeń każdego ze stosowanych leków rurek, jednej w kontroli bez leku do otoczenia i do jednej rurki zawierającej 1000 mcg / ml soli sodowej Sali tsilovokislogo lub 500 ug / ml paranitrobenzoynoy kwas nontubercular wykrywania wzrost prątków.

Aby przygotować zestaw pożywek wraz z preparatami, stosuje się zmodyfikowaną pożywkę Levenstein-Jensen (bez skrobi), którą wlewa się do kolb. W każdej z kolb dodaje się określoną objętość odpowiedniego rozcieńczenia preparatu przeciwprątkowego. Zawartość kolb dokładnie miesza się, wlewa do probówek i składa w pozycji nachylonej przez 40 minut w temperaturze 85 ° C. Zaleca się zwijanie medium w przewijarkę elektryczną z automatyczną regulacją temperatury. Środa z lekami przeciw gruźlicy

Pierwszą serię można przechowywać w lodówce w temperaturze 2-4 ° C przez 1 miesiąc, przygotowując drugi rząd - nie dłużej niż 2 tygodnie. Przechowywanie pożywek preparatami w temperaturze pokojowej jest niedopuszczalne. Podczas przygotowywania roztworów leków przeciw gruźlicy bierze się pod uwagę ich aktywność, obliczając stężenie dostosowane do masy cząsteczkowej niespecyficznej części preparatu, czystości itp. Aby określić wrażliwość na leki, stosuje się wyłącznie substancje chemicznie czyste.

Zasadą tej metody jest określenie stężenia leku przeciwgruźliczego, który hamuje wzrost znacznej części populacji prątków. Jeśli zostanie to zrobione poprawnie, ta metoda ma dobrą niezawodność.

Przed badaniem należy upewnić się, że wyizolowana kultura prątków gruźlicy nie ma obcej mikroflory. Z hodowli prątków w 0,9% roztworze chlorku sodu otrzymuje się homogeniczną zawiesinę zawierającą 500 milionów ciałek drobnoustrojowych na ml (wzorzec zmętnienia optycznego 5 jednostek). Otrzymaną zawiesinę rozcieńcza się 0,9% roztworem chlorku sodu (1:10) i do każdej probówki z zestawu pożywki dodaje się 0,2 ml zawiesiny. Zaszczepione probówki umieszcza się w termostacie w temperaturze 37 ° C i utrzymuje w pozycji poziomej przez 2-3 dni tak, aby pochyła powierzchnia pożywki hodowlanej została równomiernie zaszczepiona zawiesiną prątka gruźlicy. Probówki są następnie przenoszone do pozycji pionowej i inkubowane przez 3-4 tygodnie. Wyniki są rejestrowane po 3-4 tygodniach.

Ponieważ czas wydalania wydalniczego z materiału klinicznego na pożywki wynosi co najmniej 1-1,5 miesiąca, wyniki oznaczania wrażliwości na leki tą metodą można uzyskać nie wcześniej niż 2 do 2,5 miesiąca po wysianiu materiału. Jest to jedna z głównych wad tej metody.

Interpretować wyniki określania wrażliwości na leki mykobakterii na podstawie określonych kryteriów. Na stałej pożywce hodowlanej jest uznawane za wrażliwe na stężenie leku, które są zawarte w nośniku, gdy liczba kolonii prątków hodowanych in vitro z tego leku nie większej niż 20 jest w obfitej wzrostu w rurze sterującej, bez leków. Tylko w obecności więcej niż 20 kolonii kultura jest uważana za odporną na to stężenie. W praktyce, gdy uzyskuje się wzrost, wyniki w probówkach są zbliżone do 20 cfu. Konieczne jest powiadomienie jednostki klinicznej, że wrażliwość lub opór w tym przypadku jest na granicy, ponieważ czasami może to wyjaśnić rozmytą dynamikę wskaźników klinicznych.

W przypadku różnych leków ustala się określone stężenie, przy którym obserwuje się reprodukcję krytycznej proporcji populacji prątków. Stężenia te nazywane są "krytycznymi". Jako kryterium stabilności stosuje się wzrost populacji mykobakterii na pożywce z preparatem o stężeniu krytycznym.

W praktyce domowej TB, przy określaniu lekooporności, nie są one ograniczone do określania tylko krytycznych stężeń. Wynika to z faktu. że rozszerzanym definicja lekooporności umożliwia lekarzowi dokładniej ustawić chemioterapii taktyki konieczna jest znajomość wzmacniania działania kombinacji leków, krzyżują oczekiwaną odporność lub zastosowanie bardziej efektywną grupą leki stosowane leki przeciw-TB.

Metoda absolutnej koncentracji jest najprostsza, ale jest również najbardziej wrażliwa na błędy popełniane podczas jej wykonywania. Bardziej wiarygodne, zwłaszcza w określaniu wrażliwości na leki drugiego rzutu, a poza Rosją jest metoda proporcji. Bierze pod uwagę niedociągnięcia metody bezwzględnych stężeń, ale w wykonaniu jest bardziej pracochłonne.

Metoda jest bardzo podobna do metody absolutnego stężenia. Przygotowanie probówek z lekami odbywa się w ten sam sposób. Jak w metodzie absolutnej koncentracji. Jednakże dawka nasion zawiesiny prątków gruźlicy jest zmniejszona dziesięciokrotnie. Co eliminuje spontaniczną oporność niektórych szczepów prątków gruźlicy na takie leki, jak Etambutol, protionamid, kapreomycyna. Jako kontrolę stosuje się 2 lub 3 probówki z dawką nasion równą w probówkach, kolejno rozcieńczane 10 i 100 razy. Kryterium stabilności stanowi proporcja wizualnie obserwowanego wzrostu prątków gruźlicy. W przypadku leków z pierwszej serii kryterium stabilności stanowi przekroczenie wzrostu o 1% początkowej populacji dla leków z drugiego rzędu - wzrost o 1 lub więcej niż 10% wartości początkowej, w zależności od wybranego stężenia krytycznego.

W 1997 roku grupa robocza WHO i Międzynarodowej Unii do identyfikacji dobra odporność gruźlicy TB narkotyków dokonał korekt do tych kryteriów, oferując uważane prątków odporny, które rosną na pożywkach stałych jajko Lowenstein-Jensen w następujących stężeniach:

• dihydrostreptomycyna - 4 μg / ml;
• izoniazyd 0,2 μg / ml:
• ryfampicyna 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

W 2001 r. Zaproponowano stężenia krytyczne dla następujących leków drugiego rzutu (dla krytycznej proporcji 1%):

• kapreomycyna - 40 μg / ml;
• protionamid - 40 μg / ml;
• kanamycyna - 30 μg / ml;
• wiomycyna - 30 mcg / ml;
• cykloseryna 40 μg / ml;
• kwas aminosalicylowy - 0,5 μg / ml;
• ofloksacyna - 2 μg / ml.

Wyniki wzrostu ocenia się po 4 tygodniach jako wstępne i po 6 tygodniach uprawy - jako ostateczne.

Aby określić wrażliwość leku na pirazynamid, który jest szeroko stosowany we współczesnej chemioterapii w leczeniu gruźlicy, zalecane stężenie krytyczne wynosi 200 μg / ml. Jednakże do tej pory nie ma ogólnie przyjętej metody określania lekooporności na ten lek na pożywkach w postaci stałej, ponieważ jego aktywność przeciwbakteryjna przejawia się tylko w środowisku kwaśnym (pH <6), co jest technicznie trudne do utrzymania. Ponadto wiele kultur klinicznych prątków gruźlicy niechętnie rośnie na jajach w środowisku kwaśnym.

Aby ocenić jakość wyników testów wrażliwości na leki Mycobacterium, zaleca się, aby każdą nową partię średniej LJ sterowania równoległego oznaczania wrażliwości standardowego szczepu H37Rv muzeum. Ponadto istnieją pewne kryteria mikrobiologiczne, które muszą być utrzymane, aby techniki dawały dobrze odtwarzalny i poprawnie interpretowany wynik. Należą do żywotności hodowli Mycobacterium tuberculosis, zasady dla uzyskania jednorodnej zawiesiny i zawiesinowych kultur zasad selekcji Mycobacterium tuberculosis reprezentatywności wybraną masę bakteryjną. Wiarygodność określania lekooporności zmniejsza się przy wyjątkowo rzadkim uwalnianiu bakterii.

Niedawno uznano, że metoda określania wrażliwości na leki za pomocą zautomatyzowanych systemów jest obiecująca. Najdoskonalsze w tej dziedzinie są rozwiązania oparte na VASTES MGIT-960. W tym przypadku czułość leku na prątki gruźlicy jest określana na podstawie zmodyfikowanej metody proporcji. W procesie oznaczania porównuje się szybkość wzrostu prątków gruźlicy w probówce kontrolnej oraz w probówkach z lekami. W celu określenia wrażliwości na streptomycynę, izoniazyd, rifamp-pikin i ethambutol stosuje się suplementy wzbogacające i antybiotyki zawarte w zestawie SIRE. Aby określić wrażliwość na pirazynamid, użyj zestawu PZA. W trakcie testu zawieszenia Mycobacterium tuberculosis zaszczepiano probówki z lekami, a także rur sterowania przygotowaną zawiesiną 100 razy dla wszystkich leków poza pirazynamid, w którym zawiesina jest rozcieńczenie 10 razy. Kryterium stabilności stanowi wskaźnik wzrostu prątków 100 GU, gdy wzrost osiąga się w rurze kontrolnej 400 GU (patrz "Metody hodowli do izolowania prątków"). Księgowanie i interpretacja wyników są przeprowadzane automatycznie i są ustalane przez dane wejściowe lub wybrany program.

Jako krytyczne stężenia stosuje się końcowe stężenia w probówce z ciekłym pożywką. Obecnie opracowano stężenia krytyczne zarówno dla leków pierwszego rzutu, jak i leków drugiego rzutu. Należy zauważyć, że wrażliwość prątków gruźlicy na cykloserynę i kwas aminosalicylowy określa się tylko na pożywce jajecznej.

Szczegółowy protokół pracy na opisanym układzie pozwala badać podatność na leki zarówno na wyizolowanej kulturze (z gęstym podłożem odżywczym), jak i przy użyciu pierwotnego wzrostu prątków w probówce MGIT. Ta ostatnia opcja znacznie zmniejsza czas na kulturę, co pozwala uzyskać pełne wyniki hodowli Mycobacterium tuberculosis (w tym informacji na temat wrażliwości na lek) po 3 tygodniach od daty odbioru materiału, podczas gdy tradycyjny sposób możliwe jest uzyskanie tylko 3 miesiąca. Z czasem uzyskane wyniki, gdy pacjent znajduje się w intensywnej fazie leczenia, mogą zrekompensować stosunkowo wysokie koszty badań.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Różnicowanie mykobakterii

Biorąc pod uwagę, że zastosowane pożywki nie są ściśle selektywne. Późniejsze różnicowanie izolowanych prątków jest uznawane za obowiązkowe. Konieczność zróżnicowania prątków jest z uwagi na szereg cech procesów chorobowych wywołanych przez rodzaj: inny przebieg i wyniki gruźlicy i mycobacteriosis obecność naturalnej odporności na niektóre leki anty-TB leków.

Uważa się, że podstawowa identyfikacja kompleksu M. Tuberculosis nontubercular prątków jest wykonywany przez następujące cechy: szybkość wzrostu na pożywkach stałych pigmentacji, morfologii kolonii, w obecności kwasu, opór i temperatury optymalnego wzrostu.

Niestety, nie istnieje jedna metoda laboratoryjna wiarygodnie odróżnić M. Tuberculosis prątków z innych prątków kwasoopornych, to jednak kombinacja cech opisanych powyżej wyników podanych poniżej pewnej liczby testów biochemicznych pozwala na identyfikację kompleksu Mycobacterium tuberculosis z M. Prawdopodobne 95%.

Dla rozróżnienia Mycobacterium kompleksu M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii i inni) z wolno rosnącym prątków stosowanego nontubercular podstawowych testów biochemicznych, które wykrywają obecność następujących objawów:

• zdolność do produkcji kwasu nikotynowego (test niacyny):
• aktywność reduktazy azotanowej;
• termostabilna katalaza;
• wzrost na pożywce z salicylanem sodu (1 mg / ml).

Jako dodatkowe badania można również zastosować wzrost na pożywce zawierającej 500 μg / ml kwasu paranitrobenzoesowego lub 5% chlorku sodu.

Wiele laboratoriów bakteriologicznych identyfikuje te mikroorganizmy tylko na poziomie kompleksu, co wynika z ograniczonych możliwości laboratoriów i metodologicznych możliwości specjalistów.

W większości przypadków, w praktyce jednak, dla odróżnienia M. Tuberculosis i M. Bovis wystarcza następujące testy: niacyny w obecności azotanu, rejestracja obecności i pirazinamidazy wzrostu w pożywce zawierającej 2 ug / ml, hydrazyd kwasu tiofeno-2-karboksylowy. Należy wziąć pod uwagę, że prątki kompleksu M. Tuberculosis charakteryzują się następującym zbiorem znaków:

• powolny wzrost (ponad 3 tygodnie);
• temperatura wzrostu w przedziale 35-37 ^o C;
• brak pigmentacji (kość słoniowa);
• oznaczył kwasowo-szybki kolor;
• pozytywny test niacyny;
• pozytywny test na redukcję azotanów;
• brak termostabilnej katalazy (68 ^° C).
• Brak wzrostu na podłożu Levenstein-Jensen zawierającym:
  • 1000 μg / ml salicylanu sodu,
  • 500 μg / ml kwasu paranitrobenzoesowego,
  • 5% chlorek sodu:
• wzrost w obecności 1-5 μg / ml kwasu tiofeno-2-karboksylowego.

Znaczenie różnicowania izolowanych prątków znacznie wzrośnie wraz ze wzrostem częstotliwości rejestrowania przypadków HIV / AIDS związanych z gruźlicą lub mykobakteriozą. W chwili obecnej nie ma absolutnej pewności, że praktyczne laboratoria regionalne są gotowe do prawidłowego wykonania tej pracy.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Diagnostyka immunologiczna gruźlicy

Istnieje wiele uniwersalnych zjawisk, leków i testów immunologicznych, które pierwotnie stwierdzono dokładnie z gruźlicą lub modelem odpowiedzi immunologicznej na prątki. Należą do nich BCG i tuberkulina, zjawisko takie jak skórna GZT (testy tuberkulinowe - reakcje Pirke i Mantoux), reakcja na podskórne wstrzyknięcie tuberkuliny uczulonemu zwierzęciu (fenomen Kocha). Jedno z pierwszych przeciwciał w chorobie zakaźnej wykryto również w gruźlicy. Oczywiście, im głębsze zrozumienie mechanizmów odporności przeciwgruźliczej i ich kontroli genetycznej, tym szersze może być zastosowanie metod immunologicznych i leków, które wpływają na odporność w celu rozwiązania praktycznych problemów fittisiologii.

Najważniejszym i najtrudniejszym problemem praktycznym jest obecnie wykrywanie gruźlicy w procesie masowej selekcji populacji. Jednak pomimo licznych doniesień o "sukcesach" (przy ograniczonym materiale), nie ma odpowiedniej metody immunologicznej (odtwarzalnej w "dowolnych ramionach") i leku odpowiedniego do tego celu.

Metody immunologiczne, w szczególności badania serologiczne (oznaczanie antygenów, przeciwciał) i testy prowokujące tuberkulinę są bardzo szeroko stosowane w praktyce klinicznej.

Na pierwszym miejscu wśród badań immunologicznych stosowanych w diagnostyce różnicowej znajdują się metody serologiczne - oznaczanie antygenów i przeciwciał w różnych środowiskach ciała.

Swoistość przeciwciał przeciwko prątkom gruźlicy zależy od antygenów użytych w teście immunologicznym. Proponuje się znaczną ilość antygenów, z których pierwszym jest PPD tuberkuliny:

• PAP i inne złożone preparaty z cieczy hodowlanej;
• rozpad ultradźwiękowy;
• Ekstrakt Triton i inne złożone preparaty ścian komórkowych;
• 5-antygen (Daniel);
• 60-antygen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• czynnik kordowy (6,6-di-mycolan trehalozy);
• fenolowe i inne glikolipidy;
• lipopolisacharydy;
• antygen wiążący fibronektynę;
• białka (najczęściej rekombinowane); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA itp.

W wyniku wieloletnich badań rosyjskich i zagranicznych naukowców wykazały, podstawowe prawa i skuteczności przeciwciał serologicznej diagnostyce gruźlicy: im więcej antygen, wyższą czułość i specyficzność niższą testu. Specyfika w poszczególnych krajach różni się w zależności od populacji zakażenie M. Tuberculosis i nontubercular prątków z przeprowadzania szczepień BCG i innych. W przypadku dzieci, zawartość informacyjna serodiagnozy jest niższa niż u dorosłych. W gruźlicy pierwotnej (częściej dzieci) definicja IgM jest bardziej pouczająca. Z drugorzędową IgG. U pacjentów zakażonych HIV zmniejsza się wartość informacyjna serodiagnozy w oznaczaniu przeciwciał. Oznaczanie sprawności przeciwciał zależy od liczby „aspektów klinicznych”: aktywność procesu (obecność lub brak „Isolation” prątków zaniku obecności zagłębień, stopień infekcji), częstość procesu, czas jego przepływu.

Czułość metody testu immunoenzymatycznego (ELISA) wynosi około 70%. Niewystarczająca skuteczność badania wynika z jego niskiej specyficzności. Wcześniej rozważano możliwość zastosowania badań serologicznych w grupach wysokiego ryzyka, w szczególności u osób ze zmianami gruźliczymi w płucach.

Aby zwiększyć swoistość testu ELISA, należy kontynuować poszukiwania bardziej specyficznych antygenów, w tym uzyskanych dzięki inżynierii genetycznej: ESAT-6 itp. (Patrz wyżej). Zastosowanie ściśle specyficznych antygenów (38 kDa, ESAT) zwiększa swoistość. Ale znacznie zmniejsza wrażliwość analizy. Wraz z IFA (systemy testów laboratoryjnych, doświadczalnych. Np zestaw Pathozyme ELISA) dostarcza również zestawów, z bocznymi immunochromatograficznego filtracji (Mycodot), a także innych testów (punktową analizę na błonę) o wizualnej ocenie wyników badania. Podczas tych testów analizę przeprowadza się przez 10-30 minut; nie wymagają specjalnego wyposażenia, wymagają wizualnej oceny wyników, co wiąże się z pewną subiektywnością. Metody te mają w przybliżeniu tę samą charakterystykę czułości i swoistości (odpowiednio 70% i 90-93%), co tradycyjny test ELISA.

Zastosowanie metod analizy immunologicznej ma określoną wartość jako dodatkową, braną pod uwagę w zespole stosowanych metod, w diagnostyce różnicowej gruźlicy, szczególnie w diagnozowaniu jej form pozapłucnych. Najskuteczniejszą metodą ELISA jest rozpoznanie gruźlicy zapalenia opon mózgowych w badaniu płynu mózgowo-rdzeniowego. W tym przypadku czułość analizy wynosi 80-85%, a swoistość wynosi 97-98%. Istnieją dane dotyczące skuteczności wykrywania przeciwciał przeciwko prątkom gruźlicy w płynie łzowym w diagnostyce gruźliczego zapalenia błony naczyniowej.

Indukcja syntezy interferonu gamma in vitro

Interferon gamma (IFN-γ) jest swoistym czynnikiem obrony immunologicznej realizowanym przez aktywację układów enzymatycznych makrofagów. Indukcja syntezy IFN-γ przez uczulone limfocyty T powoduje ich interakcję z antygenami prątków.

Jako antygeny stosowane jako tuberkulina PPD. Oraz specyficzne antygeny, uzyskane za pomocą inżynierii genetycznej, w szczególności antygenów ESAT-6 (early wydzielanym antygenem, o ciężarze cząsteczkowym 6 kDa) i CFP-10 (białko z filtratu hodowli 10 kDa). Inżynieria genetyczna lub zrekombinowane antygeny są nieobecne w komórkach szczepionki BCG i innych prątków. Podczas stosowania tuberkuliny wyniki testu indukcyjnego IFN-γ są porównywalne z wynikami testu skórnego tuberkuliny (korelacja bezpośrednia). Przy stosowaniu genetycznie modyfikowanych antygenów wyniki testu są bardziej szczegółowe i nie zależą od poprzedniego szczepienia BCG. Podczas badania osób zaszczepionych, które nie miały kontaktu z zakażeniem gruźlicą, swoistość testu wynosi 99%. Czułość testu wśród pacjentów z gruźlicą waha się od 81 do 89%.

Testy i narzędzia diagnostyczne, został opracowany w oparciu o krótkotrwałej hodowli komórek lub komórek jednojądrzastych krwi pełnej, wyizolowanych z krwi antygenami Mycobacterium tuberculosis in vitro z późniejszego oznaczenia stężenia IFN-y lub przez zliczenie liczby limfocytów T, które syntetyzują IFN-y. Stężenie interferonu zsyntetyzowanego w probówce określa się za pomocą testu ELISA, stosując przeciwciała monoklonalne wiążące IFN-γ. Następnie, poprzez kalibrację standardowego IFN-y, jego stężenie określa się w probówce lub studzienkach płytki.

Podczas przeprowadzania testu Elispot, liczba limfocytów T syntetyzujących IFN-γ. Są liczone na powierzchni płytki pokrytej przeciwciałami przeciwko IFN-γ.

Programiści Diagnosticum na IFN-γ in vitro, poprzez indukcję, który został zatwierdzony przez Agencję do leków i produktów USA twierdzą, że test jest niemożliwe do odróżnienia od utajonego zakażenia gruźlicą aktywną. Dlatego w regionach o wysokim poziomie infekcji test nie jest bezpośrednio diagnostyczny. Jednak w naszym kraju można go wykorzystać do odróżnienia zakażenia gruźlicą u dzieci od alergii po szczepieniu oraz do oceny poziomu swoistej odporności w procesie leczenia.

Obecnie badany jest domowy system testowy do określania indukcji syntezy IFN-γ przez specyficzne antygeny gruźlicy in vitro.

Stan odporności i przebieg gruźlicy, immunokorekcja

W procesie leczenia gruźlicy u ludzi występują zmiany w antygenemii i stanie układu odpornościowego.

Dane dotyczące zmian w wysiękach i tkankach są w dużej mierze sprzeczne. Jedyną rzeczą, którą można zauważyć z dobrego powodu, jest to, że w ziarniniakach gruźliczych z reguły wykrywa się znaczną liczbę aktywowanych limfocytów T.

Rozsądnie jest zastanowić się nad dwoma innymi postanowieniami, które są niezbędne do zrozumienia roli mechanizmów immunologicznych w leczeniu gruźlicy u ludzi:

• Pacjenci z AIDS mają szczególnie wysoką częstość występowania oporności na wiele leków;
• z wieloma opornościami na leki (i przy braku infekcji HIV) szczególnie istotne są zaburzenia odporności (zwłaszcza związek komórek T).

W przypadku gruźlicy powszechnie stosuje się różne metody immunomodulacji: jest głównie leki działają przede wszystkim na odporność komórek T oraz system fagocytów jednojądrzastych (hormony grasicy, izoforon likopid, polioksidony et al.). Jak również całe (atenuowane) mykobakterie i ich składniki.

Diagnostyka molekularno-biologiczna gruźlicy

W przypadku metod biologii molekularnej w diagnostyce chorób zakaźnych obejmują, głównie metody oparte na manipulowanie materiału genomowego patogenów bakteryjnych i wirusowych do identyfikacji konkretnego materiału genetycznego - segmenty DNA o sekwencji nukleotydowej specyficzne dla poszczególnych szczepów typu lub patogenów analizę specyficznych Sekwencje DNA w genach, które określają wrażliwość patogenu na określone substancje lecznicze, a także na analizę funkcjonalną aktywność niektórych genów patogenu. Molekularnych technik biologicznych były szeroko w badaniach naukowych i praktycznego zastosowania w diagnostyce i kontroli różnych zakażeń bakteryjnych i wirusowych, po otwarciu 1985 Carrie Myullisom (nagroda Nobla., 1989), reakcję łańcuchową polimerazy.

Zasady i możliwości metody reakcji łańcuchowej polimerazy

PCR pozwala na amplifikację (namnażanie) in vitro sekwencji nukleotydów (fragment DNA patogenu) przez kilka godzin w milionach razy. Reakcja w obecności pojedynczych łańcuchów DNA determinuje niezwykle wysoką czułość testu.

Sekwencja nukleotydowa pewnych regionów w łańcuchu DNA determinuje tożsamość genetyczną drobnoustroju, co wyjaśnia wysoką specyficzność PCR.

Znaczenie tej metody do wykrywania i badania właściwości prątków gruźlicy wynika z biologicznych cech drobnoustroju, który ma bardzo powolny wzrost: czas podwojenia DNA prątków gruźlicy podczas uprawy wynosi 12-24 godzin.

Zasada metody PCR polega na amplifikacji - wiele milionów razy. Pomnożenie odcinków określonej sekwencji DNA w mikrowoliwce w probówce podczas cyklicznego nawrotu następujących trzech etapów reakcji, z których każdy przechodzi w innym reżimie temperaturowym:

• Etap I - denaturacja dwuniciowego DNA po podgrzaniu z rozbieżnością łańcuchów;
• II etap - komplementarne wiązanie (hybrydyzacja) starterów (priming oligonucleotides) z końcowymi odcinkami łańcuchów ściśle specyficznych, wybranych do namnażania fragmentu DNA;
• Etap III - zakończenie łańcucha fragmentu DNA przy użyciu termostabilnej polimerazy DNA.

Do amplifikacji in vitro potrzebne są cząsteczki matrycowego DNA. Cztery typy trifosforanów deoksynukleozydów (nukleotydów) zawierające odpowiednie azotowe zasady: adeninę (A), tyminę (T), guaninę (D), cytozynę (C); sztucznie syntetyzowane starterowe oligonukleotydy (primery) składające się z 18-20 par zasad; termostabilny enzym polimeraza DNA o optymalnej temperaturze 68-72 ^na C, a jony magnezu.

Specyfika PCR zależy od wyboru fragmentu DNA. Zgodnie z tym, syntetyzuje się oligonukleotydy zaszczepione z flanków. Swoistość hybrydyzacji i zakończenia łańcucha DNA wynika z zasady komplementarności następujących par zasad azotowych: adenina-tymina, guanina-cytozyna.

W celu ustalenia genomowej gruźlicze kompleks prątków najbardziej wydajnej amplifikacji docelowej w większości systemów testowych wybranych fragmentów DNA IS6110, który w większości szczepów Mycobacterium tuberculosis genomu znaczną ilość (10-20) powtórzeń, który zapewnia, wraz z specyficzność, wysoką czułość testu. Jednocześnie opisano szczepy Mycobacterium tuberculosis z małą liczbą powtórzeń lub brak fragmentu IS6110.

Izolacja cząsteczek DNA z próbki biologicznej

Aby przeprowadzić PCR, cząsteczki DNA patogenu powinny zostać wyizolowane z materiału biologicznego w minimalnej objętości, z minimalną ilością niespecyficznego DNA i różnymi inhibitorami polimerazy DNA.

Przygotowanie próbek powinno odbywać się w warunkach, które zapobiegają krzyżowemu zanieczyszczeniu próbek przez wyizolowane cząsteczki DNA. Aby to zrobić, konieczne jest wstępne oczyszczenie pomieszczenia ultrafioletem, podłogami i powierzchniami roboczymi biurka i urządzeń z roztworami zawierającymi chlor. Również obowiązkowe stosowanie czystych rękawic, jednorazowych probówek i końcówek do automatycznych pipet.

W celu wyizolowania DNA Mycobacterium tuberculosis z próbek klinicznych (płynu mózgowo-rdzeniowego do przemywania oskrzeli) nie zawierającej dużą liczbę komórek, szczątki komórek lub ich soli, wystarczającą do wirowanie próbki 3-4 tys. Obr./min, dodać do osadu 20-30 ul 2% roztworu Triton X-100 i ogrzewano w temperaturze 90 ^o C, przez 30 minut.

Do przygotowania próbek plwociny muszą być skuteczne w stan ciekły, który jest powszechnie stosowany dla 4% roztworu wodorotlenku sodu i N-acetylo-L-cysteiny (NALC) w ilości 50-80 mg na próbki - w zależności od lepkości próbki. Roztwór NALC musi być przygotowany ex tempore lub proszek NALC można dodać bezpośrednio do próbki. Po upłynnieniu próbki próbki należy odwirować przez 15 minut przy 3,5-4,000 rpm (3000 g) w 50 ml fiolkach z nakrętkami, i. E. W tych samych warunkach, które są zalecane do przedwczesnego przygotowania flegmy.

Do ekstrakcji DNA z metodą peletek są najczęściej oparte na zastosowaniu roztworu 5-6 molowym izocyjanianu guanidyny odczynnika do lizy jak mikroporowatych cząstek i tlenku krzemu ( „ziemia okrzemkowa”) sorpcji cząsteczkę DNA. Substancje, w tym inhibitory nieswoiste możliwe, następnie przemywa się w roztworze 2,5 molowego roztworu izotiocyjanianu guanidyny i etanolem, po czym cząsteczka DNA jest uwalnianego w wodzie i tych próbek użyto do przeprowadzenia reakcji PCR. Aby uprościć technologię ekstrakcji DNA, "ziemia okrzemkowa" jest często zastępowana przez mikrocząstki magnetyczne pokryte tlenkiem krzemu. W tym przypadku zamiast odwirowywania stosuje się specjalny stojak magnetyczny na mikroprobówki w celu strącenia cząstek.

W Rosji opracowano oryginalną metodę immunomagnetycznego oddzielania prątków, a następnie ekstrakcję DNA patogenu. Mycobacterium tuberculosis immunomagnetyczną rozdział za ferroparticles wielkość 3-5 mikrometrów, pokryte krzemionką, do którego są dołączone przez chemiczną poliklonalnego wiążącego (królik) przeciwciał wobec Mycobacterium tuberculosis. Próbki plwociny po lizie alkalicznej neutralizuje się za pomocą kwaśnego roztworu tris-HCl i inkubuje z sorbentem immunomagnetycznym. Następnie, immunofiltry są zbierane za pomocą pręta magnetycznego z wymienną końcówką, przenoszone na mikroprobówkę i wytrącane. Dodać 20-30 μl 2% roztworu Triton X-100 i ogrzewać przez 30 minut w 90 ^° C. Supernatant stosuje się jako matrycę DNA do analizy PCR.

Trudnym problemem jest izolacja DNA prątków gruźlicy z próbek biopsyjnych. W przypadku biopsji enzymatycznej enzym proteinaza K jest stosowana w końcowym stężeniu 200-500 mg / lw temperaturze 56 ^° C przez noc. Ponadto stosuje się jedną ze znanych metod. Nadmiar niespecyficznego DNA w analizie PCR biopsji często powoduje zahamowanie reakcji, co wymaga powtórnej ekstrakcji DNA.

Metody wykrywania wyników

Po zakończeniu reakcji zamplifikowane fragmenty DNA patogenu są identyfikowane różnymi metodami.

Metoda elektroforezy żelowej jest dobrze znana. Powstały fragment DNA identyfikuje się za pomocą kontroli pozytywnej zawierającej pożądany specyficzny fragment DNA lub zgodnie ze znanym rozmiarem (liczba par nukleotydowych) fragmentu, który określa się przy użyciu standardowego markera molekularnego.

W obecności specyficznego barwnika bromek etydyny jest zawarty w dwuniciowym DNA. Zsyntetyzowany fragment DNA jest wykrywany jako pasmo świetlne pod działaniem promieniowania ultrafioletowego.

Wielkość fragmentu DNA, określona za pomocą elektroforezy z odległości od początku, musi odpowiadać znanemu markerowi masy cząsteczkowej lub kontroli pozytywnej.

Inne metody określania wyniki PCR w oparciu o hybrydyzację jednołańcuchowych produktów PCR z oligonukleotydem komplementarnym do niego - sondę DNA znakowano biotyną, a następnie wykrywanie na drodze reakcji enzymatycznych, na przykład przez wiązanie streptawidyna-biotyna alkalicznej fosfatazy.

W oparciu o tego typu wykrywanie stworzono analizatory PCR, w których wykrywanie wyników PCR jest przeprowadzane automatycznie w wyniku odczytu gęstości optycznej w próbkach po przejściu reakcji enzymatycznej.

Wadami tych metod są możliwości intralaboracyjnego skażenia przez raczej krótkie fragmenty cząsteczek DNA. Kiedy cząsteczki wchodzą do nowych próbek, stają się matrycą do PCR i prowadzą do wyników fałszywie dodatnich.

W związku z tym, aby zapobiec fałszywie pozytywnym wynikom, wprowadza się ścisłe zasady separacji i izolacji pomieszczeń: ekstrakcji DNA z próbek biologicznych; przesłanki do wykrywania wyników (elektroforeza) ze strefy czystej. Te tereny są strefą prawdopodobnego zanieczyszczenia. Innym odizolowanym obszarem jest czyste pomieszczenie do wprowadzania próbek DNA do testowania w probówkach z mieszaniną reakcyjną do PCR. Na koniec zakłada się, że główne urządzenie - wzmacniacz DNA - powinno zostać umieszczone w oddzielnym, możliwie biurowym pokoju.

Aby zapobiec zanieczyszczeniu produktów poprzednich reakcji - niektóre badania systemu Likon wzmacniacz PCR zamiast dezoksinukleozidtimidina zawierać dezoksinukleoziduridin, który przy obiegu syntezy in vitro, a nie wprowadzone we właściwej pozycji, to znaczy Azotową zasadę tyminy obecnej w natywnym DNA zastępuje uracyl. Glikozylaza Uracil-DNA, dodana do mieszaniny reakcyjnej do analizowanego materiału, niszczy tylko zanieczyszczające fragmenty dezoksyurydyną, ale nie natywny DNA do analizy. [0002] Późniejsze ogrzewanie w 94 ^° C dezaktywuje ten enzym i nie zakłóca amplifikacji w PCR.

Istnieje system testowy oparty na izotermicznej amplifikacji rRNA, dla którego najpierw przeprowadza się odwrotną transkrypcję i syntezę cząsteczek DNA. Który z kolei jest matrycą do późniejszej syntezy cząsteczek RNA. Amplikony RNA są wykrywane przy użyciu sondy DNA barwionej akrydyną po hybrydyzacji w roztworze probówki reakcyjnej. Ta metoda, oprócz wysokiej czułości, ma tę zaletę, że analizuje się w jednej probówce, co zapobiega zanieczyszczeniu. Według autorów czułość tej metody w próbkach oddechowych sięga 90% ze swoistością 99-100%.

Nowe metody wykrywania są realizowane w czasie rzeczywistym PCR. Metody te różnią się przede wszystkim tym PCR, a wykrycie jego wyników przeprowadza się jednocześnie w jednej zamkniętej probówce. To nie tylko upraszcza technologicznie technikę analizy, ale także zapobiega zanieczyszczaniu pomieszczeń laboratoryjnych i próbek testowych produktami poprzedniej PCR.

W przypadku PCR w czasie rzeczywistym wykrywanie wyników jest spowodowane fluorescencją powstającą w wyniku hybrydyzacji fluorogennej sondy DNA ze specyficznym fragmentem DNA zamplifikowanym podczas PCR. Struktura fluorogenne sondy DNA skonstruowanego tak, że znacznik fluorescencyjny jest uwalniany w wyniku reakcji enzymatycznej, albo w pewnej odległości od cząsteczki wygaszającej fluorescencję tylko w specyficznej hybrydyzacji z pożądaną cząsteczką DNA, który ma być powielony w PCR. Wraz ze wzrostem liczby cząsteczek hybrydyzujących z sondą, wzrost fluorescencji do wykrywalnego poziomu jest proporcjonalny do liczby cząsteczek amplifikowanego produktu. Ponieważ w każdej liczby cykli PCR fragment cząsteczki DNA jest mnożona przez połowę liczby cykli, fluorescencja jest określony i zwiększa odwrotnie proporcjonalna do liczby cząsteczek DNA w początkowej próbce. Jeśli reakcja jest wprowadzenie jako kalibrator kilka różnych, znanych stężeń cząsteczek odpowiedniego fragmentu DNA Mycobacterium tuberculosis za pomocą programu komputerowego mogą zostać obliczone i ilość genomowego DNA dla badanego materiału.

Każda standardowa próbka jest powielana. Kryterium ilościowym jest minimalna liczba cykli PCR niezbędnych do wystąpienia i wzrostu określonej fluorescencji. Na odciętej - liczba cykli; rzędna jest wartością fluorescencji. Stężenia DNA są odwrotnie proporcjonalne do liczby cykli wymaganych do pojawienia się fluorescencji. W prawej kolumnie (21-32) zaznaczono numery cyklu dla odpowiednich stężeń. Różnice między 10-krotnym stężeniem fragmentów DNA 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 cykle. Dla dwóch pacjentów stężenia fragmentów IS6110 wynosiły około 10 ³ / ml i 10 ⁴ / ml. Biorąc pod uwagę liczbę powtórzeń (6-20) fragmentów analizowanych w genomie Mycobacterium tuberculosis, liczba mykobakterii w próbkach klinicznych wynosi odpowiednio około 100 i 1000 komórek.

Zastosowanie PCR w diagnostyce gruźlicy

Metoda PCR jest najczęściej stosowana do przyspieszonej diagnostyki gruźlicy - wykrywania prątków gruźlicy w próbkach klinicznych: plwocinie. Drenaż oskrzeli, wysięk opłucnowy, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, punkcik osteolizy, aspiraty żeńskich narządów płciowych i różne próbki biopsyjne. Podczas badania około 500 próbek śladów plwociny i oskrzeli u 340 pacjentów z potwierdzoną diagnozą gruźlicy płuc w Holandii zbadano czułość porównawczą PCR, kultury i mikroskopii rozmazowej. Czułość analizy wynosiła odpowiednio 92,6, 88,9 i 52,4%. Specyfika wszystkich metod wynosiła około 99%.

Porównano skuteczność wykrywania prątków gruźlicy za pomocą mikroskopii wymazowej, wysiewu na podłożu Levenstein-Jensen, systemu testowego VASTES i analizy PCR. PCR wykazał czułość 74,4%, mikroskopię - 33,8%, zaszczepienie na gęstym podłożu - 48,9% i VASTES - 55,8%. Średni czas wykrywania wysiewu na podłożu Levenstein-Jensen wynosi 24 dni. VASTES - 13 dni, PCR - 1 dzień.

Omówiono również możliwości zastosowania PCR jako czułej i szybkiej metody monitorowania skuteczności leczenia gruźlicy.

Detekcja Mycobacterium tuberculosis DNA przez PCR skutecznej chemioterapii określona przez dłuższy czas - średnio 1,7 miesiąca w porównaniu z rozmazem określonej pod mikroskopem fluorescencyjnym i przez 2,5 miesiąca w stosunku do badania bakteriologicznego.

Rozpoznanie pozapłucnych postaci gruźlicy

Znaczenie PCR jako metody czułej jest szczególnie duże w przypadku form pozapłucnych, ponieważ w tych postaciach metody kliniczno-radiologiczne i tradycyjne bakteriologiczne metody określania prątków gruźlicy w materiałach diagnostycznych są nieskuteczne.

W badaniu próbek moczu wyniki analizy PCR były pozytywne u 16 z 17 pacjentów z czynną gruźlicą układu moczowego, a ujemnych u 4 pacjentów z nieaktywną gruźlicą nerkową i u 39 pacjentów z nie-gruźliczymi chorobami układu moczowego.

Skuteczność analizy PCR w badaniu aspiratów szpiku kostnego u pacjentów z gorączką nieznanego pochodzenia wykazano w przypadkach podejrzenia gruźlicy. Aby zdiagnozować gruźlicze zapalenie węzłów chłonnych, badano 102 aspiraty przebijające i próbkę biopsyjną 67 dzieci z podejrzeniem gruźliczego zapalenia węzłów chłonnych u dzieci. Uzyskano pozytywne wyniki: 71,6% PCR w czasie rzeczywistym. Mikroskopia fluorescencyjna - 46,3%. Badania kultury - 41,8%. W badaniu 50 biopsji węzłów chłonnych u pacjentów z chorobą "kota drapania", wszystkie wyniki były negatywne. W ten sposób wykazano 100% specyficzność analizy PCR. W tej samej pracy, z biopsją punkcji węzłów chłonnych, wykazano możliwość wykrycia M. Avium.

Rozpoznanie gruźlicy dotyczącej niepłodności kobiet narządów płciowych, jak wiadomo, jest jednym z najtrudniejszych problemów diagnostycznych. W badaniu PCR biopsji endometrium, aspiratów endometrium i próbek płynów z przestrzeni Douglasa, 14 (56%) z 25 pacjentów zbadanych laparoskopowo z podejrzeniem gruźlicy uzyskało pozytywne wyniki. Stosując mikroskopię wymazową i hodowlę otrzymano odpowiednio 1 i 2 wyniki. Przypadki te były również pozytywne pod względem PCR. Większość wyników pozytywnych pod względem PCR było związanych z przypadkami z charakterystycznymi objawami gruźlicy zgodnie z badaniem histologicznym; mniejsza liczba - z podejrzeniem o gruźlicę według danych laparoskopowych. Tylko jeden pozytywny wynik analizy PCR uzyskano przy braku danych laparoskopowych dotyczących gruźlicy.

Podczas diagnozowania pozapłucnych postaci gruźlicy klinicyści często pytają o możliwość wykrycia patogenu podczas badania próbek krwi metodą PCR. Dane literackie wskazują, że wykrywanie DNA z prątków gruźlicy z próbek krwi jest możliwe przy daleko idących postaciach zakażenia HIV. DNA prątków gruźlicy wykryto jedynie uogólnionej gruźlicy różnych narządów u pacjentów z przeszczepioną nerką i immunosupresją.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Identyfikacja gatunków prątków

Metody PCR, mogą być bardzo skuteczne dla szybkiej identyfikacji prątków gruźlicy i kompleksu niektórych gatunków prątków nontubercular po odebraniu ich początkowego wzrostu. W takim przypadku użycie PCR może zaoszczędzić 7-10 dni, niezbędnych do późniejszej identyfikacji kulturowej wyniku pozytywnego. Test PCR jest technicznie bardzo prosty, ponieważ nie wymaga skomplikowanego przygotowania próbki materiału klinicznego, aby osiągnąć wysoką czułość. W badaniu 80 pozytywnych hodowli w tym układzie testowym (MB VaT z Organon) wszystkie pozytywne wyniki analizy PCR były ściśle specyficzne i były wykonywane przez 1 dzień. W celu zidentyfikowania innych gatunków prątków do wytwarzania DNA kultury patogenów hybrydyzacji z zastosowaniem specyficznych sond DNA wyznakowanych akrydyna i szczepów wykrytych przez pojawienie chemiluminescencji chemiluminometr lub paski nitrocelulozowe z wizualną oceną po hybrydyzacji. Przy pomocy takiego zestawu zidentyfikowano ograniczoną liczbę gatunków: kompleks prątków gruźlicy. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii i M. Gordonae.

A.Telenti i in. Opracowaliśmy również stosunkowo prosty i tani sposób identyfikacji gatunków klinicznie ważnych gatunków Mycobacteria przez PCR i dalszej obróbce z dwóch enzymów restrykcyjnych (enzymy o właściwościach cięcia cząsteczkę DNA w określonych punktach). Fragment DNA jest amplifikowany. Który koduje białko szoku cieplnego (65 kDa), a następnie fragment PCR 439 par nukleotydów wytworzonych przez PCR traktuje się oddzielnie dwoma enzymami: Bste II i Nae III. Następnie, stosując elektroforezę w żelu agarozowym, dwa otrzymane produkty analizuje się przez określenie ich wielkości (liczby par nukleotydów) przy użyciu zestawu standardowych fragmentów DNA (markerów molekularnego DNA) o długości od 100 do 1000 par nukleotydów. W każdym z określonych gatunków (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum), 2 lub 3 fragmenty DNA o różnej wielkości są wykrywane dla każdego enzymu restrykcyjnego. Połączenie różnych uzyskanych rozmiarów DNA pozwala na różnicowanie tych gatunków między sobą.

Opracowywana jest technologia mikromacierzy DNA biologicznego. Które pomogą zidentyfikować ponad 100 gatunków prątków w jednym badaniu.

Identyfikację gatunków można również przeprowadzić przez powielenie PCR regionu zmiennego 16S rRNA, a następnie sekwencjonowanie amplikonu w porównaniu z odpowiednią strukturą pierwszorzędową, która umożliwia identyfikację ponad 40 gatunków prątków.

Za pomocą PCR można również przeprowadzić identyfikację gatunku w obrębie kompleksu prątków gruźlicy, w tym różnicowanie M. Bovis i M. Bovis BCG. W tym celu analizuje się obecność lub nieobecność niektórych genów w regionach genomowych RD1. RD9 i RD10. RD1 nie występuje w M. Bovis BCG, ale jest obecny w zjadliwych gatunkach, w tym M. Bovis.

Oznaczanie wrażliwości na leki Mycobacterium tuberculosis metodą PCR

Celów molekularnych metod genetycznych podatności leku lub odporność Mycobacterium tuberculosis zmniejszyć do identyfikacji mutacji w specyficznych sekwencji nukleotydów znanych genów. Podstawowe metody bazują na bezpośredniej prochityvanii (sekwencyjną) tych sekwencji Po amplifikacji lub hybrydyzacji znakowanego biotyną amplifikowanych fragmentów DNA w reakcji PCR z sondami DNA. Obie alternatywy pozwalają rozpoznać podstawienia nukleotydów w sekwencji, które za pomocą sondy DNA prowadzi do braku lub w niekompletnym hybrydyzacji membranę nitrocelulozową stosując koniugat enzym (streptawidyna-fosfataza alkaliczna) - Metoda LipA-RIF TB.

Sposób pomiaru fluorescencji w lokalnie zamocowany na zgładów Sondy DNA komplementarne z mutacjami znanymi w powielone PCR regionów genów odpowiedzialnych za oporności lub wrażliwości na lek, tzw mikrobiochipov metodą. Główny algorytm przeprowadzania tych badań jest następujący. Po izolacji DNA z próbki klinicznej i kultury prątków jest konieczne do przeprowadzenia amplifikacji PCR odpowiednich fragmentów genu rpoB odpowiedzialny za wrażliwość na lek lub ryfampicyna katG i inhA genów kodujących białka Mykobakterii jest odpowiedzialny za wrażliwość na izoniazyd. Wyniki PCR ocenia się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, w których potwierdzone są odpowiednie fragmenty DNA o pożądanej długości. Następnie przeprowadza się drugą rundę PCR w celu wprowadzenia znacznika fluorescencyjnego do DNA. Wyniki PCR ponownie potwierdzono za pomocą elektroforezy żelowej. Następnie hybrydyzację przeprowadzono (inkubacja przez noc), a następnie przemycie uzyskanej materiału na biochipa, który jest duża liczba stałych w małej szklanej płytce krótkie nici DNA (sondy), które są komplementarne do nukleotydu sekwencji tuberculosis typu Mycobacterium leków wrażliwych na punktów możliwych mutacji. Jak również zmutowanych sekwencji odpowiedzialnych za oporność na lek. Położenie sondy DNA w płytce - ściśle określona i poziom fluorescencji obserwowanej w hybrydyzacji do określenia wyników za pomocą specjalnego urządzenia odczytującego jest zainstalowany. W tym względzie wyniki analizy określa się za pomocą specjalnego programu komputerowego.

W ostatnich latach opracowano alternatywne metody określania wrażliwości na leki prątków gruźlicy na podstawie technologii PCR w czasie rzeczywistym, które umożliwiają prowadzenie tych badań w teście z zamkniętą probówką.

Na ryc. 13-13 przedstawia wynik analizy klinicznych kultur prątków gruźlicy w określaniu lekooporności na ryfampicynę za pomocą PCR w czasie rzeczywistym: 218 - próbka kontrolna (wrażliwa na ryfampicynę); 93 - pozytywna kontrola mutacji Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - pozytywna kontrola mutacji Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - próbki eksperymentalne. Wynik obliczenia krzywych kinetycznych amplifikacji na 4 kanałach: kanał 1: 393 - kontrola pozytywna dla mutacji Ser-Trp TCG-TGG; kanał 2: 4482 - kontrola pozytywna dla mutacji Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - próbki eksperymentalne; kanał 4: krzywe kinetyczne amplifikacji wszystkich próbek uczestniczących w eksperymencie. Dodatnia kontrola reakcji amplifikacji. Wnioski: Na podstawie wyników analizy zidentyfikowano następujące mutacje określające oporność na ryfampicynę: w próbkach 162 163 172 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Ta sama zasada została zastosowana do określenia oporności na lek na izoniazyd dla genów katG i inhA, które determinują najczęstsze mutacje.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Identyfikacja szczepu Mycobacterium tuberculosis

Najlepiej zbadanych metodą identyfikacji szczepów Mycobacterium tuberculosis jest technika zwana długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP RFLP. Lub w wersji angielskiej), które opiera się na fragmentirovanin (ograniczenie) enzymu Mycobacterium tuberculosis DNA PvuII i fragmentów uzyskanych następnie hybrydyzacji niektórych specyficznych sekwencji w DNA powtarzający się element IS6110. Zmienność wewnątrzgatunkowa jest realizowana z powodu różnej liczby powtórzeń IS6110 i ich lokalizacji na DNA. Jak również różne odległości między niektórymi punktami ataku enzymów restrykcyjnych enzymów (miejsca restrykcyjne) i elementem IS6110. Ta technologia jest bardzo skomplikowana i czasochłonna. Po traktowaniu DNA pochodzącym z hodowli Mycobacterium tuberculosis, elektroforeza w żelu przeprowadza się z enzymem restrykcyjnym, a następnie przenosi się fragmenty DNA o różnej długości, na membranie nitrocelulozowej, hybrydyzację prowadzono z fragmentami IS6110-elementu i wykrywano za pomocą reakcji enzymatycznych. Powstały specyficzny wzór prążków charakteryzuje DNA określonego szczepu Mycobacterium tuberculosis. Za pomocą analizy komputerowej ujawnia się tożsamość lub pokrewieństwo szczepów. Pomimo faktu, że metoda RFLP jest najbardziej dyskryminująca, tj. Określa największą liczbę różnic szczepów badanych, jest nieskuteczne w niewielkiej ilości (mniej niż 5) IS6110-powtórzeń występujących w niektórych szczepów. Na ryc. 13-14 pokazuje wyniki typowania RFLP szczepów.

Alternatywą może być metoda spoligotypingu - analiza polimorfizmu sekwencji DNA spoza sekwencji - pośrednie między bezpośrednimi powtórzeniami regionu DR. Przy przeprowadzaniu spoligotypowania szczepów, PCR przeprowadza się za pomocą starterów wiążących region DR, po czym powstają fragmenty o różnej długości, które hybrydyzują ze zmiennymi regionami pośrednimi DNA. Przedstawiono analizę sekwencji przerywników regionu DR. Według naukowców, bardziej proste, produktywne i odpowiednie do pierwotnego badania przesiewowego szczepów i wstępnej analizy epidemiologicznej, a także do badań bezpośrednio materiału klinicznego.

Oczywiście bardziej efektywną i technologicznie dostępną metodą jest VNTR (skrót angielskich słów) lub metoda określania zmiennej liczby dokładnych powtórzeń tandemowych w DNA prątków gruźlicy. Ta metoda opiera się wyłącznie na zastosowaniu PCR i nie wymaga dodatkowej manipulacji. Ponieważ liczba powtórzeń tandemowych w różnych szczepach iw różnych loci jest różna, fragmenty o różnej wielkości są określane i analizowane na wynikowym elektroforegramie produktów PCR. Według naukowców użycie VNTR pozwala osiągnąć większy stopień dyskryminacji szczepów niż w przypadku metody RFLP.

W ostatnich latach wiele uwagi poświęcono dystrybucji szczepów Mycobacterium tuberculosis z rodziny W-Beijing (czasami nazywanej szczepem pekińskim), które są w dużej mierze odporne na leki.

Podstawowe wymagania dotyczące jakości badań biologicznych molekularnych

[72], [73], [74], [75],

Podstawowe dokumenty regulacyjne dotyczące PCR

Zamówienia rosyjskie Ministerstwo Zdrowia: №45 od 02.07.2000 g .. Numer 109 z 21.03.2003 g .. Numer 64 z 21.02.2000, wytycznych: 1.3.1888-04 „Organizacja pracy w badaniach z zastosowaniem materiału PCR zakażonych patogennym biologiczny środki z grup III-IV patogenności "; 1.3.1794-03 "Organizacja pracy w badaniu materiału PCR, zakażonego mikroorganizmami z grup patogenności I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 „do odkażania materiału, zainfekowane komórki bakteryjne grup patogenności I-IV, jeśli za pomocą PCR,” 2001 dodatkiem 11 ujednoliconej instrukcji mikrobiologicznych metod badania w celu identyfikacji, diagnozowania i leczenia gruźlicy.

[76], [77], [78]

Personel

Kliniczna diagnostyka laboratoryjna, lekarze bakteriologiczni, wirusolodzy, biolodzy klinicznego laboratorium diagnostycznego, a także specjaliści z wykształceniem średnim medycznym, którzy przeszli specjalizację i zaawansowany trening w ustalonej kolejności, mogą prowadzić badania biologii molekularnej.

Rozmieszczenie pomieszczeń laboratoryjnych

Wymagane są następujące pomieszczenia laboratoryjne:

• Obszar obsługi próbek jest laboratorium przystosowanym do pracy z czynnikami zakaźnymi z grup patogenności III-IV, zgodnie z Instrukcjami metodycznymi 13.1888-04.
• Strefa do przygotowania mieszanin reakcyjnych PCR - pomieszczenie laboratoryjne, które zapewnia ochronę przed wewnętrznym zanieczyszczeniem laboratorium - strefa "czysta".
• • Jeśli do analizy produktów PCR stosuje się elektroforezę lub hybrydyzację. Pomieszczenie laboratoryjne, w których zwielokrotnionego fragmentów DNA pochodzących z amplifikacji rur i, odpowiednio, może przedostać się do otoczenia, zgodnie z wymaganiami laboratoriów PCR (1.3.1794-03 wytyczne, Guidance 1.3.1888-04) musi być w pełni jest odizolowany od przesłanek wskazanych w poprzednich punktach. Należy unikać przemieszczania się z obszaru elektroforezy do obszaru obsługi próbek i "czystej" strefy jakiegokolwiek personelu, sprzętu, jakichkolwiek materiałów i przedmiotów, a także transportu powietrza przez system wentylacyjny lub w wyniku przeciągów. Ta strefa nie jest wymagana do fluorymetrycznego wykrywania produktów PCR.
• Pomieszczenie do dokumentacji i przetwarzania wyników jest wyposażone w komputery i niezbędny sprzęt biurowy. Pomieszczenie to może zawierać sprzęt zapewniający wykrywanie produktów PCR bez otwierania tuby. - fluorescencyjne detektory PCR i termocyklery do PCR w czasie rzeczywistym.

Wymagania sanitarne i epidemiologiczne dotyczące pierwotnego traktowania plwociny są podobne do standardowych wymagań mikrobiologicznych dotyczących pracy z prątkami gruźlicy.

[79], [80], [81], [82],

Uzupełnienie wyposażenia laboratoryjnego do diagnostyki PCR

Laboratorium obejmuje sprzęt do następujących pomieszczeń.

• pomieszczenie do przygotowania próbki, zawiera następujący sprzęt: laminarny II klasy ochrony "SP-1.2": termostat półprzewodnikowy z osłoną grzejną do probówek typu "Eppendorf"; mikrowirówka przy 13000 rpm; wirówka (wir); lodówka o zakresie temperatur od -20 ^о do +10 ^о С; pipety o zmiennej objętości serii "Rroline"; pompa z kolbą pułapki OM-1; statyw na pipety; stanowisko pracy z statywem 200x0,5 ml; stanowisko pracy z statywem 50x1,5 ml; Stojaki do przechowywania probówek 80 x 1,5 ml;
• Pokój do przygotowania mieszaniny reakcyjnej: komora ochronna PCR-box ("Laminar-C 110 cm); wirówka - wir; Pipety o zmiennej objętości serii Proline; statyw na pipety; statyw do pracy 200x0,2 ml; Stojaki do przechowywania probówek 80 x 1,5 ml; lodówka o zakresie temperatur od -20 ^о do + 10 ^о С;
• miejsce do elektroforezy: kamera do poziomej elektroforezy; zasilanie; transiluminator;
• Wzmacniacze DNA lub analizator kwasów nukleinowych (PCR w czasie rzeczywistym) z komputerem i oprogramowaniem; można umieścić w dowolnym wolnym pokoju. Jeśli używana jest technologia PCR w czasie rzeczywistym. Miejsce do elektroforezy nie jest potrzebne.

[83], [84], [85], [86]

Zewnętrzna kontrola jakości

Aby mieć pewność uzyskania obiektywnie wiarygodnych wyników, laboratoria powinny uczestniczyć w systemie zewnętrznej oceny jakości badań laboratoryjnych.

Uczestnicy systemu kontroli jakości otrzymują; 12 ampułek z liofilizowanymi zawiesinami komórek bakteryjnych, z których dwie zawierają E. Coli E. Coli, 3 ampułki z prątkami gruźlicy (niezjadliwy szczep) w stężeniu 10 ² / ml; 3 ampułki z komórkami podobnego szczepu w stężeniu 10 ⁴ / ml; 2 ampułki z prątkami bez gruźlicy M. Avium-intracellulare i M. Kansasii w stężeniu 10 ⁵ / ml.

Testy rozproszone do zewnętrznej oceny jakości są wstępnie testowane w dwóch niezależnych laboratoriach z dużym doświadczeniem w tej dziedzinie.

[87], [88]