Embrionalne komórki macierzyste

Odkrycie komórek macierzystych zarodka nie nastąpiło przypadkowo, lecz pojawiło się na przygotowanym gruncie badań naukowych w dziedzinie biologii rozwoju. Termin „komórka macierzysta” został wprowadzony do medycyny w 1908 roku na kongresie towarzystwa hematologicznego w Berlinie przez Aleksandra Maksimowa w odniesieniu do komórek hematopoetycznych. Na długo przed wyizolowaniem i produkcją stabilnych linii pluripotentnych komórek macierzystych zarodka, komórki macierzyste terato-(embrio-carcinoma) były wykorzystywane w badaniach wczesnych procesów rozwojowych, za pomocą których badano nieznane mechanizmy embriogenezy, w tym sekwencję ekspresji wczesnych genów i białkowe produkty ich aktywności.

Ale czy totipotencja ludzkiego genomu jest bezpowrotnie tracona w procesie ewolucji? Nie, a embriogeneza jest tego dowodem. Jeśli tak, to kiedy w zasadzie zrealizuje się druga ścieżka rozwoju ewolucyjnego? Prawdopodobnie wtedy, gdy człowiek wejdzie w przestrzeń kosmiczną, gdzie warunki środowiskowe będą stosunkowo stałe przez wystarczająco długi czas. Utratę tkanki kostnej (demineralizacja kości w stanie nieważkości), która bardzo powoli ulega przebudowie i regeneracji, można uznać za pierwszy krok w procesie adaptacji człowieka jako gatunku do istnienia w warunkach kosmicznych. Jednak cena za drugą ścieżkę rozwoju ewolucyjnego będzie inna - ceną za powrót totipotencji i absolutnej plastyczności wszystkich komórek będzie bezpłodność. Tak więc w tym świecie „ewolucyjnych kameleonów” będziemy musieli rozmnażać się bez mejozy, przez pączkowanie. Ale będziemy żyć długo. Nieśmiertelność telomerazy jest nieśmiertelnością ameby. W organizmie wielokomórkowym komórki macierzyste są substratem ilościowej i jakościowej długowieczności.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Źródła komórek macierzystych zarodkowych

Obecnie źródłami komórek macierzystych zarodkowych do badań laboratoryjnych są linie potworniaka myszy (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) i potworniaka człowieka (NTERA-2, TERA-2, klon H-9), a także linie Trauneon ESC. Jednak dostępność szczegółowego paszportu komórkowego wskazującego fenotyp immunologiczny, wyniki analizy chromosomowej, profile ekspresji mRNA, odsłonięte receptory i wewnątrzkomórkowe białka sygnałowe nie rekompensują istotnych niedociągnięć linii potworniaka ESC - szybkiej utraty totipotencji i niemożności wykorzystania ich w badaniach klinicznych, podczas gdy mieszane różnicowanie w hodowli bardzo utrudnia wyizolowanie czystej wyspecjalizowanej linii z heterogenicznej populacji komórek. Dlatego też źródłem linii ESC tworzonych do celów klinicznych jest zwykle wewnętrzna masa komórkowa blastocysty, pojedyncze blastomery zarodków w stadium 8-komórkowym, komórki moruli w późniejszych stadiach, a także pierwotne komórki rozrodcze.

Należy zauważyć, że komórki potworniaka, mimo że mają właściwość pluripotencji, charakteryzują się znacznie niższym potencjałem pluripotencjalnym w porównaniu do ESC. Ich integracja z komórkami embrionalnymi rzadko prowadzi do powstania chimer, które zresztą nigdy nie tworzą gamet o genotypie komórek potworniaka. Uważa się, że jest to spowodowane częstym występowaniem nieprawidłowości chromosomalnych podczas hodowli komórek potworniaka: utratą chromosomu Y, różnymi trisomiami, delecjami lub translokacjami.

Próby wyizolowania linii ludzkich ESC podejmowano wielokrotnie, ale zadanie to nie zostało rozwiązane, ponieważ dostęp do normalnych ludzkich blastocyst jest utrudniony. Ponadto częstość występowania nieprawidłowości chromosomalnych u ludzi jest wyższa niż w embriogenezie zwierząt. Przytłaczająca większość wczesnych ludzkich zarodków uzyskanych po zapłodnieniu in vitro wykazuje chaotyczny mozaikowatość chromosomową i często ma aberracje liczbowe i strukturalne. Nawet później, w stadium blastocysty, tylko 20-25% ludzkich zarodków składa się z komórek o normalnym kariotypie. Praktycznie niemożliwe było wykorzystanie takich zarodków do tworzenia ESC, ponieważ zygoty były zwykle hodowane do stadium dwóch lub czterech blastomerów, a następnie przeszczepiane do macicy. Dopiero stosunkowo niedawno opracowano niezawodną technikę hodowli zapłodnionych ludzkich jajeczek do stadium blastocysty. Wprowadzenie tej techniki do praktyki zapłodnienia in vitro nie tylko zwiększyło częstotliwość udanych implantacji, ale również uczyniło normalne blastocysty obiektem bardziej dostępnym.

Innym źródłem pluripotentnych komórek macierzystych są pierwotne komórki rozrodcze, które w przeciwieństwie do bardziej zaawansowanych populacji progenitorowych nabłonka zarodkowego nie mają beta-integryny na swojej powierzchni, ale wykazują wysoką aktywność fosfatazy alkalicznej. Należy zauważyć, że populacje komórek macierzystych, które powstały z pierwotnych komórek rozrodczych, były badane eksperymentalnie od lat 80. W tym czasie opracowano technikę izolowania pierwotnych komórek rozrodczych z zarodka gonady zarodka myszy. Pierwsze nieudane wyniki hodowli pierwotnych komórek rozrodczych in vitro sugerowały daremność tych prób, ponieważ komórki, chociaż przeżyły, nie rozmnażały się i obumierały w ciągu pierwszego dnia. Później ustalono, że pierwotne komórki rozrodcze myszy rozmnażają się in vitro tylko w obecności rozpuszczalnych i związanych z błoną specyficznych czynników wzrostu polipeptydów w podłożu hodowlanym. Wyniki licznych badań wykazały, że do przeżycia i proliferacji pierwotnych komórek rozrodczych konieczna jest obecność w podłożu hodowlanym nie tylko LIF, ale także związanych z błoną i rozpuszczalnych czynników Steel (SIF). Peptydy te są wytwarzane przez komórki somatyczne zarodków homozygotycznych pod względem mutacji Steel, a jeden z nich jest ligandem protoonkogenu cKit.

Pierwotne komórki rozrodcze ssaków i ludzi mają pochodzenie poza gonadami i są źródłem klonalnego rozwoju linii komórek rozrodczych. Początkiem pierwotnej linii komórek rozrodczych, jak również wszystkich tkanek embrionalnych i mezodermy poza zarodkiem, jest epiblast (pierwotna ektoderma) wczesnych zarodków, który ma mozaikową organizację strukturalną. Stosując metodę mikrochirurgicznego usuwania różnych części wczesnego zarodka, ustalono strefę lokalizacji w epiblaście klonu zaangażowanych prekursorów pierwotnych komórek rozrodczych. Stosując rodaminę dekstran, która została użyta jako marker komórkowy, ustalono, że prekursory pierwotnych komórek rozrodczych są zlokalizowane w proksymalnej części epiblastu, w pobliżu ektodermy poza zarodkiem. Pierwotna linia komórek rozrodczych powstaje z 45-komórkowego klonu, którego alokacja następuje na samym początku gastrulacji. Następnie klon segreguje, a podczas gastrulacji pierwotne komórki rozrodcze wchodzą do mezodermy pozazarodkowej i znajdują się u podstawy zawiązku omoczni, za smugą pierwotną. Stamtąd pierwotne komórki rozrodcze migrują w kierunku brzusznej części endodermy jelita tylnego, a następnie aktywnie przemieszczają się wzdłuż krezki, zasiedlając grzbiety płciowe pod koniec migracji. Podczas migracji, jak również w pierwszych 2-3 dniach lokalizacji w zawiązku gonady, pierwotne komórki rozrodcze aktywnie proliferują i przechodzą osiem cykli replikacyjnych. Jeśli na początku migracji jest około 50 pierwotnych komórek rozrodczych, to w grzbietach płciowych zarodków myszy dwunastego dnia rozwoju liczba pierwotnych komórek rozrodczych przekracza 25 000.

Funkcjonalne podobieństwo ESC i pierwotnych komórek rozrodczych jest potwierdzone całkowitą integracją tych ostatnich z blastocystą z zastąpieniem wewnętrznej masy komórkowej i późniejszym pełnoprawnym rozwojem zarodka, którego tkanki składają się wyłącznie z potomków pierwotnych komórek rozrodczych. W innych właściwościach pierwotne komórki rozrodcze myszy okazały się również identyczne z ESC, wykazując zdolność do różnicowania się w różnych kierunkach, tworzenia ciał embrionalnych in vitro i tworzenia potworniaków in vivo po podaniu podskórnym myszom z niedoborami odporności, przypominając spontaniczne potworniaki jąder u myszy 129/ter.

Stwierdzono, że gdy do podłoża dodaje się LIF, związany z błoną komórkową i rozpuszczalny SIF, izolowane pierwotne komórki rozrodcze 8-dniowych zarodków myszy przeżywają i rozmnażają się w hodowli przez 4 dni, ale następnie obumierają. Ponadto okres, w którym obserwuje się obumieranie pierwotnych komórek rozrodczych w hodowli, pokrywa się z etapem rozwoju zarodków myszy (12,5-13,5 dnia), gdy żeńskie pierwotne komórki rozrodcze wchodzą w mejozę w zarodkach gonad, a podziały mitotyczne są blokowane w męskich pierwotnych komórkach rozrodczych. Jednakże, jeśli do podłoża dodaje się nie tylko czynniki wzrostu LIF i SIF, ale także FGF2, pierwotne komórki rozrodcze nadal się rozmnażają, a w subkulturach tworzą się kolonie komórek zdolnych do namnażania się nawet po usunięciu czynników wzrostu (SIF i FGF) z podłoża. Takie komórki można hodować przez długi czas na podłożu fibroblastów zarodkowych bez dodawania rozpuszczalnego czynnika wzrostu LIF. Zaproponowano, aby te stabilne linie komórkowe uzyskane z pierwotnych komórek rozrodczych nazwać komórkami rozrodczymi zarodkowymi. Termin ten nie jest wcale udany, ponieważ nie jest możliwe uzyskanie komórek rozrodczych zarodkowych zdolnych do wykonywania kolejnych etapów oogenezy lub spermatogenezy podczas hodowli komórek EG. Wynika to z faktu, że linie komórkowe EG, chociaż pochodzą z pierwotnych komórek rozrodczych, ale nabywając właściwości komórek macierzystych pluripotentnych zarodkowych w hodowli, tracą zdolność do wiązania się z liniami rozrodczymi. Innymi słowy, pierwotne komórki rozrodcze, gdy są hodowane, tracą właściwości prekursorów gamet i są przekształcane w komórki pluripotentne podobne do ESC.

Zauważono, że potworniaki nie powstają, gdy komórki EG są wprowadzane do myszy z niedoborem odporności. Zakłada się, że utrata zdolności ludzkich komórek EG do wywoływania potworniaków wynika z faktu, że linie te nie zostały utworzone bezpośrednio z hodowanych pierwotnych komórek rozrodczych, ale zostały uzyskane z komórek wyizolowanych z ciał embrionalnych. Dlatego możliwe jest, że są one potomkami pluripotentnych, ale już zaangażowanych komórek.

Należy zauważyć, że istnieją zasadnicze różnice między komórkami EG a pierwotnymi komórkami rozrodczymi. Te ostatnie nie pozwalają na uzyskanie chimerycznych zarodków myszy, co wskazuje na brak zdolności pierwotnych komórek rozrodczych do integracji z wewnętrzną masą komórkową lub trofektodermą. Charakterystyka populacji pierwotnych komórek rozrodczych jest bardziej podobna do zaangażowanych linii komórek somatycznych późniejszych zarodków, których wprowadzenie do blastocysty również nie prowadzi do powstania chimerycznych zarodków.

Modyfikacja techniki hodowli ciał embrionalnych uzyskanych przez agregację komórek EG umożliwiła uzyskanie innej populacji komórek pluripotentnych, zwanych „komórkami pochodzącymi z ciał embrionalnych” (komórki EBD), przy użyciu selekcji na pożywkach selekcyjnych. Zdolność komórek EBD do proliferacji w hodowli przez długi czas umożliwiła stworzenie stabilnych linii komórkowych zaangażowanych komórek. Uzyskano klony komórek wyrażające szeroki zakres mRNA i markerów białkowych wyspecjalizowanych komórek. Podejście to ostatecznie udowodniło, że ludzkie pierwotne komórki rozrodcze są pluripotentne i różnicują się in vitro w różne typy komórek: neurony, neuroglej, śródbłonek naczyniowy, komórki hematopoetyczne, komórki mięśniowe i endodermalne.

Alternatywne źródła komórek macierzystych zarodkowych

Alternatywnym źródłem ludzkich linii ESC mogą być komórki hybrydowe. Implantacja do macicy krów w ciąży rzekomej heterogenicznej konstrukcji uzyskanej przez fuzję przez elektroporację komórek somatycznych płodu ludzkiego z jajeczkiem krowim, z którego wcześniej usunięto przedjądrze, umożliwia uzyskanie wewnętrznej masy komórkowej ze sztucznego zarodka w stadium rozwoju przedimplantacyjnym. W tym celu w pierwszym etapie uzyskuje się blastocystę z jajeczka krowiego z przeszczepionym jądrem komórkowym człowieka.

W drugim etapie z blastocysty izoluje się embrion, z którego metodą Thomsona izoluje się ESC. Warto zauważyć, że najlepsze wyniki w izolowaniu linii ESC tą metodą uzyskano przy użyciu jąder komórek pęcherzykowych lub pierwotnych komórek rozrodczych, które pozostają w organizmie człowieka w stanie hibernacji. Wynika to z faktu, że jądra ludzkich komórek przeszczepianych do jaja krowiego muszą mieć nieskrócone telomery i wysoką aktywność telomeazy, co pomaga uniknąć przedwczesnego starzenia się klonów ESC uzyskanych z jaja hybrydowego (Repin, 2001). Wiadomo, że najważniejszymi wewnątrzkomórkowymi białkami markerowymi ESC są Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, które należą do tzw. białek tłumiących chromatynę. Silencery zapewniają szczególnie zwarty pakiet heterochromatyny, co zapobiega tworzeniu się pętli euchromatyny. Pakowanie chromatyny pośredniczone przez te białka koreluje z totipotencją genomu ESC. Do tej pory ustalono, że dojrzałe oocyty bydlęce i ludzkie są jedynym typem wyspecjalizowanych komórek, które zawierają wysokie stężenia białek wyciszających w cytoplazmie. Na tej podstawie opracowano metodę uzyskiwania hybrydowych ESC poprzez przeniesienie jąder komórek somatycznych do enukleowanych oocytów bydlęcych. Wstępne badania in vitro wykazały, że cytoplazma oocytów bydlęcych przywraca totipotencję genomu jąder komórek somatycznych człowieka po 12-24 godzinach hodowli.

Szczególnie interesujące są dane dotyczące osobliwości rozwoju przedimplantacyjnego ludzkich zarodków, wskazujące na późniejsze zastępowanie komórek totipotencjalnych populacją komórek pluripotentnych niż u myszy. Badanie transformacji komórkowych wykazało, że komórki trofoblastu powstają również z komórek wewnętrznej masy komórkowej ludzkich blastocyst, oprócz ESC, co wskazuje na ich całkowitą moc.

Wiadomo, że w stadium blastocysty powstają dwie odmiennie zaangażowane populacje komórek. Jedna z nich tworzy zewnętrzną warstwę blastocysty - trofektodermę, której pochodnymi są komórki trofoblastu i inne embrionalne składniki łożyska. Druga populacja komórek grupuje się w gęstą masę stykającą się z wewnętrzną powierzchnią trofektodermy. Pochodnymi populacji komórek wewnętrznej masy komórkowej są wszystkie tkanki i zawiązki narządów zarodka. W stadium późnej blastocysty z wewnętrznej masy komórkowej tworzy się endoderma pozazarodkowa i epiblast (pierwotny ektoderm). W tym przypadku komórki epiblastu zachowują pluripotencję, podczas gdy zdolność do różnicowania komórek pozazarodkowej endodermy jest ograniczona.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Pozyskiwanie ludzkich komórek macierzystych zarodkowych

Do niedawna uważano, że nie można uzyskać ESC z trofoblastu. Jednak linia diploidalnych komórek macierzystych trofektodermy wyizolowanych z blastocysty proliferuje i przekształca się w komórki macierzyste w podłożu zawierającym FGF2 i heparynę zamiast LIF. Jeśli FGF2 zostanie usunięte z podłoża, komórki trofektodermy przestają się rozmnażać, rozpoczyna się w nich endoreduplikacja chromosomów, a elementy komórkowe trofektodermy stopniowo przekształcają się w olbrzymie komórki trofoblastu. Prawdopodobnie LIF nie stymuluje proliferacji komórek trofektodermy z uwagi na fakt, że FGF2 uruchamia inny mechanizm trans-sygnalizacji, ponieważ FGF2, wiążąc się z receptorem osocza (FGFR2), aktywuje kinazy MAP w cytoplazmie - ERK1 i ERK2. W konsekwencji, gdy w komórkach blastocysty zostanie włączony jeden szlak sygnałowy (LIF - gpl30 - kinaza JAK - STAT3), komórki masy wewnętrznej komórek ulegają transformacji do pluripotentnych ESC, a gdy zostanie aktywowany drugi mechanizm transbłonowej transdukcji sygnału (FGF2 - FGFR2 - kinaza MAP ERK1/ERK2), w blastocyście powstają komórki macierzyste trofoektodermy. Wybór szlaku sygnałowego zależy z kolei od aktywności genu oct4. Gen ten, należący do domeny POU, znajduje się w locus t autosomu 17 i jest wyrażany podczas oogenezy, w okresie rozszczepienia, a także w komórkach masy wewnętrznej komórek blastocysty i w pierwotnych komórkach rozrodczych. Funkcjonalną rolą genu oct4 jest kodowanie czynnika transkrypcyjnego niezbędnego do powstania komórek pluripotentnych, ich różnicowania i dedyferencjacji.

Ekspresja genu oct4 w ESC zmienia się w zależności od interakcji tego czynnika transkrypcyjnego z kofaktorami. Kierowana regulacja ekspresji oct4 w blastocystach wykazała, że gdy jego aktywność jest zmniejszona, połowa komórek tworzy trofoblast, natomiast gdy indukowana ekspresja oct4 wzrasta, powstają głównie ESC.

W eksperymencie ESC nie mogą być przenoszone do linii podczas hodowli totipotencjalnych blastomerów na etapie bruzdkowania, jak również na etapie gastrulacji i późniejszych stadiach rozwoju embrionalnego. Mysie ESC są zwykle izolowane w 3,5-4,5 dniu ciąży, co odpowiada szóstemu (blastocysta jednowarstwowa) i siódmemu stadium (blastocysta dwuwarstwowa - wczesny cylinder jajowy) prawidłowej embriogenezy. Oczywiste jest, że tylko w okresie preimplantacyjnym zarodki myszy zawierają populacje komórek zdolne do przekształcenia się w ESC. W związku z tym izolacja linii ESC jest możliwa tylko na pewnych etapach embriogenezy. Zygota i blastomery powstające podczas bruzdkowania są totipotencjalne z punktu widzenia możliwości rozwinięcia żywego zarodka z błonami embrionalnymi i łożyskiem. Utrata całkowitej potencji komórek rozrodczych rozpoczyna się w późnym stadium moruli, kiedy dalsze zaangażowanie blastomerów zależy od ich lokalizacji. Wczesne blastomery moruli zachowują totipotencję, ponieważ eksperymentalne manipulacje ze zmianami w ich lokalizacji, takie jak odwrócenie ich lokalizacji, nie zapobiegają rozwojowi w pełni rozwiniętego zarodka.

Ustalono, że skuteczność izolowania ESC do linii zależy od stanu blastocyst w momencie ich eksplantacji. Zastosowanie blastocyst po modelowaniu siedmiodniowej diapauzy w drogach rodnych myszy owariektomizowanych w 3,5. dniu ciąży i otrzymujących progesteron ułatwia skuteczniejszą izolację linii komórek macierzystych zarodka. Zakłada się, że w takich warunkach liczba blastomerów tworzących wewnętrzną masę komórkową wzrasta. Możliwe jest również, że cykl komórkowy ulega wydłużeniu, a większość blastomerów wchodzi w fazę G0.

Ponadto tworzenie stabilnych pluripotentnych linii ESC zależy od genotypu zarodków: ESC są dość łatwo izolowane z blastocyst linii myszy 129, znacznie trudniej je uzyskać przy użyciu myszy CS7BL/6, a wyizolowanie linii ESC z blastocyst myszy CBA/Ca jest praktycznie niemożliwe. Oczywiste jest, że wczesne zarodki mają pewne cechy genetyczne, które wpływają na rozwój pluripotentnej linii ESC. Niemniej jednak podczas hodowli izolowanych epiblastów, a także poprzez selektywną selekcję różnicujących się komórek, linie ESC zostały mimo wszystko wyizolowane z wczesnych zarodków myszy CBA/Ca.

Sprawdzona standardowa technika uzyskiwania linii ESC z blastocyst jest podana w podręcznikach laboratoryjnych dotyczących techniki eksperymentów z wczesnymi zarodkami. Eksperymentalne linie ESC można również uzyskać poprzez hodowlę izolowanego epiblastu (pierwotnego ektodermy) 4,5-dniowych zarodków myszy przy użyciu dość złożonej techniki mikrochirurgicznej i zmodyfikowanych warunków hodowli. Pracochłonność tej procedury jest uzasadniona, ponieważ częstość powstawania linii ESC w tym przypadku okazała się znacznie wyższa niż w pracach z wewnętrzną masą komórkową blastocysty.

Aby wyizolować linie ESC, każdy klon jest przenoszony do mikrostudzienki, hodowany jest agregat 40-60 komórek, a następnie ponownie rozpraszany. Wielokrotne powtórzenia tej procedury pozwalają nam uzyskać zimmortalizowaną linię ESC z maksymalną szybkością proliferacji komórek normokariotypowych przyłączonych do plastiku, które zachowują totipotencję i wysoką aktywność telomerazy po 50-100 pasażach. W procesie utrzymywania linii ESC największym niebezpieczeństwem jest zanieczyszczenie podłoża lub surowicy endotoksynami bakteryjnymi - nawet śladowe stężenia endotoksyn w podłożu hodowlanym powodują masową śmierć niedojrzałych komórek rozrodczych. Przy starannym monitorowaniu wzrostu liniowego i terminowej dyspersji, ESC w hodowli są zdolne do symetrycznego podziału, w którym obie komórki potomne pozostają pluripotentne i zdolne do wykonywania nieograniczonej liczby cykli komórkowych, utrzymując diploidalny kariotyp i całkowitą potencję.

Selekcję czystej populacji ludzkich ESC można przeprowadzić po transfeccji ich genomu cząsteczkami rekombinowanego DNA zawierającymi gen kodujący syntezę zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Ekspresja GFP wzrasta, gdy ESC są hodowane w warunkach sprzyjających ich proliferacji, natomiast wraz z początkiem różnicowania poziom ekspresji tego genu spada, co pozwala na selekcję czystych, stabilnych linii komórek pluripotentnych na podłożu selektywnym. Podczas hodowli ESC izolowanych przy użyciu selekcji GFP, częstość tworzenia kolonii wzrasta wielokrotnie, ponieważ silny efekt antyproliferacyjny zróżnicowanych komórek jest eliminowany w warunkach kultur selekcyjnych.

Translację ludzkich komórek macierzystych zarodkowych do linii przeprowadza się metodą ich izolacji z zarodków przedimplantacyjnych (w stadium 80-120 komórek), które pozostają po procedurze zapłodnienia in vitro. W tym celu sztucznie uzyskane „nadmiarowe” zarodki rozprasza się mechanicznie w podłożu Delbecco-Eagle. Po oznakowaniu komórek selektywnymi przeciwciałami monoklonalnymi znacznikiem fluorescencyjnym, izoluje się komórki zarodka. Zarodek rozprasza się do pojedynczych komórek za pomocą mieszaniny dyspazy-kolagenazy. Oddzielone komórki hoduje się w specjalnym podłożu (80% podłoże Delbecco + 20% surowicy cielęcej w obecności 500 μg/ml IL-6, LIF i SCF) na monowarstwie odżywczej fibroblastów zarodkowych z pierwszych 3 pasaży. W tym przypadku przeżycie i proliferacja komórek macierzystych i progenitorowych są utrzymywane dzięki działaniu IL-6, LIF i SCF. W takim podłożu ESC rosną jako klony zawiesinowe nieprzytwierdzonych komórek kulistych, które muszą zostać rozdzielone przez miękkie, powtarzane pipetowanie. Nowe klony pojawiają się w zawieszonej hodowli w 5-7 dniu. Maksymalne tempo wzrostu ESC osiąga się przez powtarzaną dysocjację klonów na etapie 10-15 komórek. Następnie każdy klon przenosi się do mikrostudzienki i hoduje do agregatu 40-50 komórek. Procedurę powtarza się wiele razy w pasażach, zwiększając objętość hodowli do gęstości 5-10 milionów komórek na 6-centymetrową płytkę. Wykorzystując takie pasażowanie, Thomson wyizolował 10 nieśmiertelnych klonów ludzkich ESC, które po 100 pasażach zachowały wysoką aktywność telomerazy, zdolność do energicznej proliferacji, minimalne cechy fenotypowe i całkowitą moc z możliwością różnicowania się w dowolną z 350 wyspecjalizowanych linii komórkowych pochodzących z ekto-, mezo- i endodermy. Różnicowanie ludzkich ESC rozpoczęło się (po zmianie medium, dodaniu surowicy i wyeliminowaniu LIF) od przyłączenia komórek do podłoża, co wskazuje na rozwój cytoszkieletu i ekspresję receptorów adhezyjnych. Co ważne, przy nieograniczonej proliferacji ludzkie ESC zachowały normalny kariotyp.

Druga metoda izolacji ludzkich linii ESC opiera się na wykorzystaniu pierwotnych komórek rozrodczych. Badania eksperymentalne wykazały, że linie komórek E można uzyskać z fałdów płciowych 12,5-dniowych zarodków myszy. Jednak w tych przypadkach częstość powstawania linii komórek progenitorowych była znacznie niższa niż w eksperymentach z wcześniejszymi zarodkami. Jednocześnie pierwotne komórki rozrodcze z gonad zarodków myszy w 13,5 dniu ciąży w ogóle nie są zdolne do przekształcenia się w linie.

Pierwsze stabilne linie pluripotentnych ludzkich komórek EG uzyskano z pierwotnych gonocytów wyizolowanych z gonad 5-9-tygodniowych zarodków. Wyizolowane komórki hodowano na podłożu inaktywowanych mysich fibroblastów zarodkowych w podłożu DMEM z surowicą płodową uzupełnioną merkaptoetanolem, forskoliną i rekombinowanymi ludzkimi czynnikami wzrostu (FGF i LIF). Po 7-12 dniach w hodowli pojawiły się wielokomórkowe kolonie odpowiadające ludzkim komórkom EG pod względem cech morfologicznych i markerów molekularnych. Po agregacji komórki te utworzyły ciała embrionalne, z których następnie rozwinęły się wyspecjalizowane komórki charakterystyczne dla pochodnych wszystkich trzech warstw zarodkowych. W ciągu 10-20 pasaży linie komórek EG zachowały normalny kariotyp i nie utraciły pluripotencji.

Wykazano również, że połączone działanie czynników LIF, związanych z błoną i rozpuszczalnych Steel oraz TGF-b zmienia program rozwojowy pierwotnych komórek rozrodczych. Zamiast zaprzestać podziałów mitotycznych i zacząć różnicować się w kierunku oogenezy lub spermatogenezy, pierwotne komórki rozrodcze nadal się rozmnażają. Po kilku dodatkowych cyklach mitotycznych stają się podobne do komórek epiblastycznych i tracąc właściwości prekursorów komórek rozrodczych, przekształcają się w pluripotentne komórki macierzyste EG.

Tak więc w 1998 roku po raz pierwszy wyizolowano zmutowane linie pierwotnych komórek rozrodczych z genitalnego zarodka tkanki autopsyjnej płodu ludzkiego. W ludzkiej embriogenezie pierwotne komórki rozrodcze pojawiają się w woreczku żółtkowym w 3. tygodniu rozwoju, a w 4.-5. tygodniu komórki te migrują do strefy guzka narządów płciowych, gdzie tworzą uśpione populacje pierwotnych gonocytów. W stanie nieaktywnym pierwotne komórki rozrodcze są zachowywane w zarodku do narodzin. Linie pierwotnych komórek rozrodczych są izolowane z płodowego guzka narządów płciowych 5-9-tygodniowych zarodków, których wyekstrahowana tkanka jest ex tempore traktowana mieszaniną kolagenaz typu IV-V, hialuronidazy i DNazy w celu zwiększenia ilościowej i jakościowej wydajności komórek. Pierwotne komórki rozrodcze w tkance płodowego guzka płciowego są otoczone komórkami podścieliska (mezenchymalnymi) Sertoliego. Funkcjonalnym celem komórek Sertoliego jest produkcja czynników antyapoptotycznych (ligand Fas), mitogenów i immunosupresantów, które chronią komórki rozrodcze przed atakiem immunologicznym organizmu. Ponadto mikrośrodowisko podścieliska guzka płciowego odgrywa ważną rolę w dojrzewaniu gamet. Wyizolowane pierwotne komórki rozrodcze są sadzone w hodowli nad warstwą podścieliska odżywczego składającą się z fibroblastów płodowych z pierwszych trzech pasaży. Najbardziej skuteczną kombinacją mitogenów jest kompleks składający się z LIF, FGF i forskoliny (stymulator powstawania cAMP). Proliferacja pierwotnych komórek rozrodczych in vitro wymaga dodania surowicy płodowej, w obecności której reprodukcja pierwotnych gonocytów w hodowli jest połączona z tworzeniem klonów komórek kulistych nieprzyłączonych do podłoża.

W Narodowych Instytutach Zdrowia USA, na podstawie podsumowania istniejących danych na temat metod izolowania ludzkich linii ESC z blastocyst, wstępnie wyciągnięto wniosek, że skuteczna izolacja ESC jest najbardziej prawdopodobna w przypadku hodowli blastocyst z dobrze uformowaną masą komórek wewnętrznych (Komórki macierzyste: postęp naukowy i przyszłe kierunki badań. Nat. Inst, of Health USA). Z tego punktu widzenia optymalnym źródłem ESC do tworzenia linii są ludzkie blastocysty w 5. dniu rozwoju, z których trofoblast powinien zostać ostrożnie usunięty podczas izolowania masy komórek wewnętrznych. Wyizolowana masa komórek wewnętrznych, składająca się na tym etapie z 30-35 komórek, powinna być hodowana na podłożu fibroblastów myszy embrionalnych, co jest decydującym warunkiem tworzenia kolonii ESC w hodowli.

Analiza cech fenotypowych komórek macierzystych zarodka

Szczególnie interesująca jest międzygatunkowa analiza porównawcza cech fenotypowych ESC. Stwierdzono, że ludzkie kolonie ESC są gęstymi skupiskami spłaszczonych, nabłonkowych komórek, podczas gdy mysie ciała embrionalne składają się z luźnego konglomeratu zaokrąglonych komórek. W ludzkich ESC wskaźnik stosunku jądro-osocze jest niższy niż w mysich ESC. Embrionalne komórki macierzyste małp tworzą płaskie kolonie komórek o nierównych krawędziach. Pojedyncze komórki są łatwo widoczne we wczesnych klonach naczelnych ESC. Proliferujące ESC wszystkich badanych gatunków zwierząt nie wyrażają cząsteczek MHC klasy I i II. Jednocześnie ludzkie ESC dają pozytywną reakcję na przeciwciała TERA 1-60 i GCTM-2, co wskazuje na obecność proteoglikanów keratyny/siarczanu chondroityny na ich powierzchni, charakterystycznych dla komórek macierzystych embrio-(terato)-carcinoma. Ekspresja genu oct4 w ESC wszystkich gatunków zwierząt sugeruje, że pomimo różnic fenotypowych, ten sam zestaw genów odpowiedzialnych za utrzymanie pluripotencji jest najwyraźniej aktywowany w ludzkich i mysich ESC (Peru, 2001). Ponadto linie ESC wyizolowane z zarodków szczurów, świń, królików, naczelnych i bydła mają podobne cechy morfologiczne, podobny zestaw molekularnych markerów identyfikacyjnych i niemal identyczny mechanizm molekularny do wdrażania programów embriogenezy, co pozwala nam spojrzeć na problem ksenotransplantacji na nowo.

W przeciwieństwie do normalnej embriogenezy in vivo, proliferacja ESC in vitro nie jest połączona z tworzeniem warstw zarodkowych i zachodzi na tle blokowania homeotycznych genów Hox, tj. bez organogenezy. Ponieważ geny segmentacji nie działają, nie można odtworzyć takich okresów embriogenezy, jak składanie somitów, segmentacja zarodka, tworzenie woreczka żółtkowego, omoczni i innych tymczasowych narządów i tkanek w hodowli ESC. Hodowane ESC wydają się być zamrożone na początku procesu tworzenia 350 linii restrykcyjnych wyspecjalizowanych komórek. Tak więc klon potomnych komórek progenitorowych i centralnie zlokalizowany ESC stanowią jedynie model zarodka, podczas którego rozwoju różne linie wyspecjalizowanych komórek są jednocześnie tworzone w różnych obszarach tkanek, które jednak pochodzą od wspólnych prekursorów. Pomimo minimalnego poziomu receptorów na powierzchni ESC zachowują one zdolność do przeprowadzania pierwotnych procesów morfogenetycznych, imitując struktury objętościowe wczesnego zarodka: zawiesina ESC w hodowli agreguje i tworzy struktury przypominające blastocysty lub nawet późniejsze zarodki (cylindry jajowe). Takie agregaty zawiesiny są odpowiednio nazywane prostymi i złożonymi ciałkami embrionalnymi.

W przypadku różnicowania mieszanego wczesne geny ektodermy (oct3, fgf-5, nodal), endodermy (gata-4), mezodermy (brachyury), mezodermy kardiogennej (pkh-2.5), cewy nerwowej (msx3) i hematopoezy (elkf) są jednocześnie wyrażane w różnych komórkach jednego ciała embrionalnego. Stosując różne kombinacje czynników wzrostu i cytokin do ukierunkowanego działania na tworzenie komórek warstwy zarodkowej in vitro, w wielu przypadkach udało się uzyskać ciała embrionalne, w których geny ektodermy lub mezodermy były preferencyjnie wyrażane, co otwiera drogę do modelowania gastrulacji i początkowych faz organogenezy.

Klonalny wzrost ESC jest dowodem asymetrycznego podziału komórek, w którym tylko jedna ESC w centrum klonu zachowuje nieograniczony potencjał proliferacji, podczas gdy druga komórka potomna generuje pokolenie komórek progenitorowych, które już przechodzą różnicowanie. Dlatego tempo proliferacji klonu na obwodzie ciała embrioidalnego jest wyższe niż w centrum. Komórki brzeżne rosnącego klonu przechodzą spontaniczne nieuporządkowane różnicowanie, migrują lub giną w wyniku mechanizmów apoptotycznych. Wydarzenia te determinują los klonu: jeśli tempo proliferacji przekracza tempo migracji i apoptotycznej śmierci komórek, klon nadal zwiększa swój rozmiar, stabilizacja następuje, gdy tempo apoptozy i tempo tworzenia nowych komórek są równe, a regresja następuje, gdy stosunek tych procesów jest odwrotny. Komórki progenitorowe dzielą się symetrycznie, tj. obie komórki potomne następnie różnicują się w dojrzałe wyspecjalizowane linie komórkowe. Stosunek ESC do komórek progenitorowych jest różny, ale liczba ESC zawsze stanowi jedynie ułamek procenta populacji komórek progenitorowych. Dlatego tylko ostrożne pipetowanie i terminowa dezagregacja klonów mogą zwiększyć liczbę ESC w hodowli. Dezagregacja klonów na etapie 10-12 komórek okazała się najskuteczniejsza w celu uzyskania maksymalnej wydajności ESC. Kierunek i stopień różnicowania komórek w ciele zarodkowym zależą od ich lokalizacji. Zewnętrzne komórki ciała zarodkowego nie wyrażają genu oct4 i ulegają różnicowaniu w komórki pierwotnego endodermy, z których następnie powstają komórki nabłonkowe okładzinowego i trzewnego pozazarodkowego endodermy. Wewnętrzne komórki ciała zarodkowego wyrażają gen oct4 i zachowują pluripotencję przez 48 godzin hodowli. Jednakże kultura jest następnie morfologicznie restrukturyzowana w monowarstwę nabłonkową i rozpoczyna się ekspresja genów kontrolujących rozwój pierwotnego ektodermu. Następnie rozpoczyna się proces całkowitego nieuporządkowanego cytodyferencjacji wraz z pojawieniem się różnych typów komórek, które są pochodnymi wszystkich trzech warstw zarodkowych. W procesie spontanicznego różnicowania komórek ciała embrionalnego, jako pierwsze pojawiają się agregaty z markerami endodermy w postaci fragmentów (cyst) woreczka żółtkowego. Następnie w tych strukturach pojawiają się angioblasty i komórki śródbłonka rosnących naczyń włosowatych. W końcowych stadiach spontanicznego różnicowania, z wewnętrznych komórek ciała embrionalnego rozwijają się różne końcowo zróżnicowane komórki, w tym neurony, elementy glejowe, kardiomiocyty, makrofagi i erytrocyty. W pewnym zakresie (biorąc pod uwagę przestrzenną inwersję formowania się warstw tkanki zarodkowej) wykorzystując ciała embrionalne, możliwe jest badanie procesów morfogenetycznych in vitro i analiza mechanizmów molekularnych początkowych okresów cytodyferencjacji zarodkowej,jak również ustalenie roli poszczególnych genów w realizacji tych procesów.

Tak więc w obrębie klonu znajdują się komórki, w których odkryto różne programy rozwoju genetycznego - ESC, wczesne progenitory i różnicujące się populacje progenitorowe. Hodowla ESC metodą wiszącej kropli lub masowej hodowli bez warstwy podającej i bez dodawania LIF do podłoża nieuchronnie prowadzi do powstania ciałek embrionalnych. Morfologia komórek zewnętrznej i wewnętrznej warstwy ciałek embrionalnych jest różna. Warstwa zewnętrzna składa się z dużych, rozgałęzionych komórek. Ich powierzchnia zwrócona do środowiska jest pokryta licznymi mikrokosmkami. Zewnętrzna warstwa komórek jest oddzielona od warstwy wewnętrznej błoną podstawną przypominającą błonę Reicherta, podczas gdy komórki wewnętrznej warstwy ciałek embrionalnych są nabłonkiem kolumnowym. Morfologicznie warstwa wewnętrzna, chociaż zawiera wiele dzielących się komórek, bardziej przypomina niezróżnicowane kolonie ESC.

Charakterystyka ludzkich komórek macierzystych zarodkowych

Brak interakcji sygnałowych miąższowo-mezenchymalnych na tle blokowania genu homeozy prowadzi do nieuporządkowanego wzrostu ESC w hodowli, ponieważ zakłóca to powstawanie i rozwój infrastruktury narządów tymczasowych. Niezorganizowany wzrost i nieuporządkowane spontaniczne różnicowanie ESC w hodowli wynikają z braku mezenchymalnego znakowania szkieletu podścieliska przyszłych narządów: in vitro całkiem możliwe jest utworzenie milionów hepatocytów, ale niemożliwe jest uzyskanie pojedynczego zrazika wątroby, który zawierałby takie elementy strukturalne i funkcjonalne, jak zatoki, przestrzenie Dissego i komórki Kupffera.

Uważa się, że pluripotencja ESC jest realizowana wyłącznie w embriogenezie z formowaniem tkanek i narządów zarodka, podczas gdy łożysko i pępowina są pochodnymi trofoblastu. ESC zamknięte w błonie trofoektodermalnej sekwencyjnie generują klony komórek tymczasowych, które realizują program rozwoju poprzez kombinatoryczny mRNA objętościowej macierzy topograficznej Nokhteyova, która z góry określa układ przestrzenny, kształt i rozmiar, liczbę komórek narządów tymczasowych i ostatecznych, a także montaż miąższu w jednostki strukturalne i funkcjonalne. Jednocześnie ESC pozostają jedynym typem komórek, w których mechanizm molekularny realizacji ich potencji jest całkowicie odłączony od programu rozwoju genetycznego, a same ESC są pozbawione zdolności do interakcji z innymi komórkami z powodu blokowania zarówno percepcji receptorowych, jak i układów transsygnałowych. Jednak odpowiednia aktywacja ESC prowadzi do stopniowego rozwoju programu embriogenezy, kończącego się narodzinami w pełni uformowanego organizmu, składającego się z miliardów komórek, gotowego do życia pozamacicznego. Na tej krótkoterminowej, ale niewyobrażalnie długoterminowej ścieżce w przestrzeni komórkowej nieuchronnie pojawiają się błędy zarówno w mechanizmach molekularnych, które zapewniają żywotną aktywność komórek, jak i w programach, które kontrolują ich proliferację, różnicowanie i specjalizację. Dlatego we współczesnej farmakogenomice choroby struktury molekularnej i choroby programowania komórkowego są rozpatrywane oddzielnie. Ponadto działanie większości nowych leków ma na celu korygowanie programów różnicowania, proliferacji i organogenezy, a także regenerację narządów i tkanek. W organizmie dorosłym ESC umożliwiają kontrolowanie zachowania komórek macierzystych/progenitorowych przeszczepianych do mózgu, wątroby, śledziony, szpiku kostnego i innych narządów ludzkich w celu przywrócenia uszkodzonego miąższu narządów biorcy poprzez różnicowanie i specjalizację komórek dawcy na zachowanej macierzy mezenchymalnej. W istocie program totipotencji zaczyna być realizowany na poziomie genomów oocytu, zygoty i blastomerów; jednak komórki te nie zostały jeszcze sklonowane i pasażowane w ilościach niezbędnych dla potrzeb medycyny eksperymentalnej i praktycznej. Dlatego ESC pozostają unikalnym źródłem informacji genetycznej zawierającej kody trójwymiarowej mapy zarodka i kody liniowej restrykcji wyspecjalizowanych linii komórkowych podczas gastrulacji.

Praktycznie nieograniczony potencjał regeneracyjny ESC wynika z faktu, że ich genom, w przeciwieństwie do aparatu genetycznego zróżnicowanych komórek somatycznych, zachowuje pluripotentność. Jednym z przejawów uśpienia informacji genetycznej osadzonej w ESC jest tzw. fenotyp minimalny - ograniczona liczba receptorów jest wyrażona na powierzchni ESC, a zatem bardzo niewiele programów trans-sygnałowych jest wdrażanych do interakcji aparatu jądrowego komórki z jej mikrośrodowiskiem. Na tle hibernacji genów odpowiedzialnych za ograniczenie wyspecjalizowanych linii komórkowych i różnicowanie komórek, aktywowanych jest tylko około 30 z 500 genów, których produkty zapewniają połączenie komórki z otaczającym ją mikrośrodowiskiem. Wykorzystując metodę seryjnej analizy ekspresji genów wykazano, że przy wspólnej pracy głównych funkcjonalnych skrzynek genomu regulujących energetykę i metabolizm w komórkach somatycznych i ESC, te ostatnie mają bardzo niski poziom mRNA receptorów, białek G, wtórnych przekaźników, transkryptaz, kofaktorów ekspresji i represji, tj. całego systemu transbłonowej transmisji sygnału regulacyjnego do komórki. Wynika to z braku lub bardzo niskiej ekspresji genów transsygnałowych. W okresie indukowanego różnicowania w genomie ESC 18 funkcjonujących genów synchronicznie przestaje działać na tle aktywacji 61 genów transsygnałowych kontrolujących syntezę receptorów adhezji komórkowej, składników macierzy zewnątrzkomórkowej, transkryptaz restrykcyjnych i elementów przekaźnikowych systemu transmisji sygnału do aparatu jądrowego z receptorów błony komórkowej. Jednocześnie blokowana jest ekspresja genów odpowiedzialnych za syntezę białek tłumiących, a także koinhibitorów ekspresji genów, które zapewniają totipotencję genomu ESC.

Znaleziono markery genetyczne dla komórek wszystkich trzech warstw zarodkowych. Identyfikację warstwy komórek ektodermalnych przeprowadza się poprzez ekspresję genów węzłowych, oct3 i fgf-5, komórek mezodermy - poprzez ekspresję genu brachyury, genów zeta-globiny, endodermy - poprzez ekspresję genu gata-4. W normalnej embriogenezie w okresie gastrulacji obserwuje się aktywną migrację niedojrzałych populacji komórek macierzystych i progenitorowych, lokalnie oznaczających strefy rozwoju kości twarzowych czaszki, niektórych części mózgu, obwodowego układu nerwowego, układu przewodzącego serca i grasicy, której tkanki powstają z klonów komórek migrujących. Oznaczanie komórek wczesnymi genami warstw zarodkowych ułatwia zadanie analizy topograficznej procesów migracji komórek prekursorowych w rozwijającym się zarodku. W szczególności ustalono, że w agregatach komórek zarodkowego raka P19 ekspresja pierwszego genu mezodermy brachyury rozpoczyna się w okresie zmniejszonej ekspresji genów tkankowego aktywatora plazminogenu, a-fetoproteiny, keratyny 8 i keratyny 19, które są markerami pierwszych migrujących populacji mezodermy. W konsekwencji formowanie się tkanek pochodzenia mezodermalnego rozpoczyna się dopiero po zakończeniu procesu punktowej migracji i rozproszenia komórek progenitorowych mezodermy.

Pomimo niezwykle ograniczonych cech fenotypowych i braku większości jednostek trans-sygnalizacyjnych, ESC nadal wyrażają niektóre cząsteczki receptorowe, które mogą być wykorzystane do ich identyfikacji. Warto zauważyć, że antygeny markerowe ESC u ludzi i naczelnych okazały się powszechne. Najczęściej do znakowania ESC stosuje się znakowane przeciwciała do antygenów związanych z błoną SSEA-3, SSEA-4 (unikalne antygeny lipidowe reprezentujące kompleks glikolipidu GL7 z kwasem sialowym), a także wysokopolimerowe glikoproteiny TRA-1-81, TRA-1-60. Ponadto ESC wyrażają specyficzny antygen embrionalny SSEA-1 i endogenną fosfatazę alkaliczną, a także specyficzny czynnik transkrypcyjny Oct4. Ten ostatni jest niezbędny do utrzymania mechanizmów proliferacji ESC - specyficzny czynnik transkrypcyjny Oct4 aktywuje ekspresję genu czynnika wzrostu fibroblastów 4 i stabilizuje ekspresję zestawu genów odpowiedzialnych za nieograniczoną replikację DNA w niedojrzałych komórkach. Najważniejszymi białkami markerowymi wewnątrzkomórkowymi są Oct3, Oct4, Tcf i Groucho, które są spokrewnione z białkami tłumiącymi chromatynę.

Prawie natychmiast po wielu latach prób hodowli ESC poza organizmem, które zakończyły się sukcesem i uzyskano pierwsze hodowle komórek macierzystych izolowanych z blastocyst myszy oraz hodowle pierwotnych komórek rozrodczych, rozpoczął się etap badań nad pluripotentnym potencjałem ESC, gdy wprowadzono je do zarodków na wczesnych etapach rozwoju. Wykazano, że w stadium moruli i blastocysty ESC są zdolne do tworzenia zarodków chimerycznych, w których potomkowie dawcy ESC są wykrywani we wszystkich tkankach somatycznych, a nawet w gametach. Tak więc w biologii rozwoju, wykorzystując ESC, ustanowiono „pomost” między badaniami eksperymentalnymi in vivo i in vitro, co znacznie rozszerzyło możliwości badania procesów powstawania pierwotnych tkanek i narządów, ich różnicowania i organogenezy embrionalnej.

Jest jasne, że in vivo podczas embriogenezy ESC są integrowane z masą komórkową wczesnego zarodka, a ich pochodne znajdują się we wszystkich narządach i tkankach. ESC kolonizują linię komórek rozrodczych w chimerycznym zarodku, których potomkowie tworzą pełnoprawne jaja i plemniki. Komórki macierzyste zarodka są klonogeniczne - pojedynczy ESC jest zdolny do stworzenia genetycznie identycznej kolonii komórek z markerami molekularnymi, które obejmują ekspresję genu oct4 i fosfatazy alkalicznej, wysoką aktywność telomerazy i ekspresję niektórych antygenów embrionalnych.

Aby zbadać mechanizmy embriogenezy przy użyciu ESC, opracowano metodę chimeryzacji moruli poprzez stworzenie konstruktu biologicznego, na zewnątrz którego znajduje się warstwa tetraploidalnych blastomerów biorcy, a do środka wprowadzane są dawcze ESC. W ten sposób trofoblast powstaje z potomków tetraploidalnych blastomerów biorcy, co zapewnia implantację i łożysko, a dawcze ESC działają jako wewnętrzna masa komórkowa, z której powstaje ciało żywego zarodka i linia pierwotnych komórek progenitorowych. Wartość badawcza ESC polega nie tylko na tym, że pluripotencja jest zachowana podczas manipulacji in vitro ich genomem, ale również na tym, że zachowana jest zdolność ESC do uczestniczenia w formowaniu pierwotnych komórek rozrodczych chimerycznego zarodka. Wykazano, że potomkowie tylko jednego genetycznie zmodyfikowanego ESC zasiedlają wszystkie pierwotne zarodki i rozwijające się tkanki chimerycznego zarodka uzyskanego przez agregację lub kokultywację tej komórki z 8-komórkowym zarodkiem. Kiedy ESC transfekowane genem zielonego białka fluorescencyjnego zostały przeszczepione do moruli myszy, fluorescencyjni potomkowie tej komórki zostali znalezieni we wszystkich badanych tkankach rozwijającego się zarodka (Shimada, 1999). Przeszczepienie ESC do moruli pozwala na stworzenie żywych myszy, których organizm składa się wyłącznie z potomków dawcy ESC, co otwiera perspektywy dla różnych opcji klonowania terapeutycznego. To podejście metodologiczne jest obecnie z powodzeniem stosowane do badania problemów biologii rozwojowej, w szczególności jest wykorzystywane do analizy mechanizmów genetycznej inaktywacji chromosomu X lub niestabilności epigenetycznej ESC. Transplantację komórek macierzystych układu rozrodczego (ESC) do wczesnego zarodka stosuje się również w biotechnologii rolniczej, a także w eksperymentach z terapią genową.

Transplantacja genetycznie zmodyfikowanych ESC jest wykorzystywana do testowania komórek docelowych zmutowanych genów. Hodowane in vitro ESC są wykorzystywane w biotechnologii do tworzenia myszy knockout. W tym celu badany gen jest usuwany z ESC przez homologiczną rekombinację (knockout), a komórki pozbawione tego genu są izolowane na selektywnych podłożach. Następnie Knockout ESC są wprowadzane do blastocysty lub agregowane z blastomerami moruli. Uzyskane w ten sposób chimeryczne wczesne zarodki są przeszczepiane do samic biorczyń, a osobniki z gametami nullizygotycznymi dla danego genu są wybierane spośród nowonarodzonych myszy. Technologia ta została wykorzystana do stworzenia wielu linii myszy knockout, które są szeroko stosowane w biologii eksperymentalnej i medycynie eksperymentalnej. Takie modele biologiczne są wykorzystywane do badania znaczenia niektórych genów w rozwoju embrionalnym, a także ich roli w mechanizmach chorób ludzkich i stanów patologicznych. Ponadto linie zwierząt knockout są wykorzystywane w przedklinicznych testach nowych metod terapii genowej. Przykładowo, poprzez transfeccję normalnego allelu zmutowanego genu do genomu ESC, możliwe jest skuteczne skorygowanie mutacji wpływającej na układ krwiotwórczy. Wprowadzenie obcych genów do ESC pozwala na szybkie tworzenie linii homozygotycznych transgenicznych zwierząt laboratoryjnych. Należy jednak zauważyć, że technika ukierunkowanej rekombinacji delecji genu została do tej pory wiarygodnie opracowana tylko w odniesieniu do mysich ESC. Wykorzystując podwójne knockoutowe mysie ESC, ustalono funkcjonalną rolę regionu klastra genów na chromosomie 7 (kopia regionu genomowego na ludzkim chromosomie 19) i regionu proksymalnego chromosomu 11 (kopia ludzkiego chromosomu 5g) - usunięcie tych genów w mysich ESC umożliwiło ocenę funkcji ich analogów u ludzi.

Rozszerzyły się możliwości badania funkcji ludzkich genów embriogenezy, których transfekcja do genomu ESC zwierząt laboratoryjnych umożliwiła w szczególności wyjaśnienie roli genu krypto w formowaniu i rozwoju mezodermy kardiogennej, genu pax-6 - w embriogenezie oka. Opracowywane są pierwsze mapy ekspresji genów w niedojrzałych proliferujących ESC potworniaka i blastocyst myszy, a także potwierdzono supresyjną represję genów transsygnałowych w ESC. Połączenie 60-80 zmutowanych ESC i 20-30 komórek normalnych przedimplantacyjnych zarodków myszy prowadzi do rozwoju chimerycznych zarodków, w których zawiązki narządów składają się z komórek dawcy i biorcy, co umożliwia wyjaśnienie roli nieznanych genów w gastrulacji i organogenezie. Mapę funkcjonalną genów rozwijających się zarodków myszy uzupełniono o informacje dotyczące roli genu sf-1 w kształtowaniu nadnerczy i gonad, genu wt-1 w kształtowaniu nerek, genów rodziny myoD w kształtowaniu mięśni szkieletowych oraz genów rodziny gata-1-4 w dojrzewaniu restrykcyjnym zaczątków erytropoezy i limfopoezy.

Kierunkowe wyłączanie alleli matczynych i ojcowskich genów w ESC przy użyciu rekombinaz wektorowych pozwoliło na wyjaśnienie funkcji różnych genów we wczesnym okresie embriogenezy, a technologia ukierunkowanego transferu nieznanych ludzkich genów do mysich ESC przyczynia się do odkrycia nowych zmutowanych genów odpowiedzialnych za rozwój ciężkiej patologii dziedzicznej. Stosując metodę knockoutu określono obligatoryjne znaczenie niektórych genów dla formowania tkanek embrionalnych: gata-4 - dla mięśnia sercowego, gata-1 - dla linii erytrocytów tkanki krwiotwórczej, myoD - dla mięśni szkieletowych, brachyury - dla mezodermy, restrykcyjne transkryptazy hnf3 i hnf4 - dla komórek macierzystych wątroby, rag-2 - dla formowania klonów limfocytów T i B (Repin, 2001). Podwójne usunięcie genów w ESC otworzyło dostęp do badań nad funkcjonalną rolą genów warstwy zarodkowej, segmentacją i homeozą, a przeszczep ESC umożliwił uzyskanie żywotnych międzygatunkowych hybrydowych zarodków. Wykorzystując ulepszoną technikę przeszczepiania pojedynczego dawcy ESC do 8-komórkowego zarodka, udowodniono fakt chimeryzacji na poziomie komórkowym wielu narządów zarodka biorcy. Należy zauważyć, że wypustki komórkowe ludzkiej tkanki znaleziono w narządach myszy biorcy po wprowadzeniu ludzkich komórek macierzystych hematopoezy do blastocysty. Ustalono, że pluripotentne ESC krążą we krwi zarodków myszy w okresie formowania się narządów. Możliwe, że ich funkcja biologiczna leży w organizacji embrionalnej przyszłego układu odpornościowego. Za pomocą ESC odtworzono w warunkach laboratoryjnych odpowiednie modele ludzkiej patologii genetycznej: podwójne wybicie genu dystrofiny modeluje dystrofię mięśniową Duchenne'a u myszy, a wyłączenie genu atm (kontrola syntezy kinazy sygnałowej chromatyny) - ataksja-teleangiektazje. W tej śmiertelnej chorobie dziedzicznej u dzieci, zwyrodnienie komórek Purkinjego w móżdżku rozwija się z powodu defektów w naprawie DNA, czemu towarzyszy inwolucja grasicy z powodu śmierci proliferujących komórek. Obraz kliniczny, patofizjologia i patomorfologia ataksji-teleangiektazje, odtworzone przez wprowadzenie patologicznej informacji genetycznej do ESC, u myszy chimerycznych odpowiadają tym u ludzi. Oprócz ataksji-teleangiektazji, przy użyciu komórek macierzystych (ESC) i myszy knockout opracowano eksperymentalne modele niektórych dziedzicznych homozygotycznych chorób ludzkich, związanych z patologią metabolizmu węglowodanów i lipidów, katabolizmu aminokwasów oraz wydalania miedzi i bilirubiny, co znacznie poszerzyło możliwości medycyny eksperymentalnej na etapie przedklinicznych testów nowych metod leczenia odpowiednich chorób ludzkich.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Zastosowanie cytohybryd komórek macierzystych

Komórki hybrydowe uzyskane przez fuzję ESC z komórkami somatycznymi są odpowiednim i obiecującym modelem do badania pluripotencji komórek macierzystych i przeprogramowania chromosomów zróżnicowanych komórek. Cytohybrydy uzyskane przez fuzję ESC z zróżnicowanymi komórkami dorosłego zwierzęcia umożliwiają badanie zależności między genomami w różnym „wieku”: wyjątkowa sytuacja powstaje, gdy homologiczne chromosomy pochodzące z komórek na różnych etapach różnicowania i różnym stopniu dojrzałości znajdują się w tym samym jądrze, gdzie mogą łatwo wymieniać trans-działające sygnały regulacyjne. Trudno przewidzieć, w jaki sposób cisregulacyjne układy epigenetyczne homologicznych chromosomów, uformowane w trakcie rozwoju osobniczego, zareagują na wpływ trans-działających sygnałów pochodzących z genomów spokrewnionych z zarodkiem. Ponadto w komórkach hybrydowych zachodzi segregacja chromosomów rodzicielskich, co pozwala nam badać interakcje genomów na poziomie pojedynczych chromosomów, czyli potencjalnie identyfikować udział określonych chromosomów w utrzymaniu pluripotencji lub odwrotnie, wyjściu do różnicowania.

Cytohybrydy uzyskane przez fuzję pluripotentnego potworniaka i zróżnicowanych komórek somatycznych zostały wykorzystane jako pierwszy model eksperymentalny do badania interakcji genomów o różnych „historiach rozwoju”. W niektórych przypadkach takie komórki hybrydowe zachowały właściwości pluripotentne na dość wysokim poziomie. W szczególności komórki hybrydowe potworniaka i somatycznego potworniaka in vivo indukowały rozwój prawdziwych potworniaków zawierających pochodne wszystkich trzech listków zarodkowych, a in vitro w hodowlach zawiesinowych tworzyły ciała embrionalne. Nawet w międzygatunkowych cytohybrydach tego typu obecność antygenów embrionalnych odnotowano w przypadkach, gdy partnerami somatycznymi w fuzji z komórkami potworniaka były limfocyty lub tymocyty. Warto zauważyć, że cytohybrydy utworzone przez fuzję komórek potworniaka z fibroblastami odpowiadały fibroblastom pod względem fenotypu.

Najważniejszym ustalonym faktem jest to, że w hybrydowych komórkach teratocarcinoma-somatycznych pojawiły się oznaki przeprogramowania zróżnicowanego genomu komórkowego, które charakteryzowało się reaktywacją albo pojedynczych genów, albo nieaktywnego chromosomu X partnera somatycznego. Tak więc wyniki badań nad cytohybrydami typu komórek teratocarcinoma-somatycznych wskazują, że pluripotencja jest często zachowana w komórkach hybrydowych i występują oznaki przeprogramowania genomu partnera somatycznego.

W eksperymentach nad uzyskaniem wewnątrzgatunkowych embrionalnych komórek hybrydowych poprzez fuzję mysich ESC z dorosłymi splenocytami badano cechy takich cytohybryd, analizowano segregację chromosomów rodzicielskich i oceniano pluripotencję genomu hybrydowego. Wewnątrzgatunkowe komórki hybrydowe uzyskane poprzez fuzję komórek potworniaka z komórkami somatycznymi charakteryzują się zazwyczaj niskim poziomem segregacji chromosomów z kariotypem tetraploidalnym lub prawie tetraploidalnym. Podobny skład chromosomów obserwowano w cytohybrydach podczas fuzji pierwotnych komórek rozrodczych z limfocytami. Jednocześnie międzygatunkowe komórki hybrydowe uzyskane poprzez fuzję komórek potworniaka z limfocytami norek wykazywały intensywną segregację chromosomów partnera somatycznego.

Jakościowo nowy etap w badaniach nad segregacją chromosomów rodzicielskich u mieszańców wewnątrzgatunkowych rozpoczął się po opracowaniu metody analizy mikrosatelitów z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy, dzięki której dla każdego chromosomu myszy znaleziono kilkaset markerów, pozwalających na wiarygodne rozróżnienie dowolnej pary homologicznych chromosomów w komórkach hybrydowych.

Poprzez fuzję ESC (komórek HM-1 pozbawionych aktywności fosforybozylotransferazy hipoksantynowej, 2n = 40, XY, wyizolowanych z blastocyst myszy 129/01a) ze splenocytami kongenicznych myszy DD/c, możliwe było uzyskanie zestawu klonów hybrydowych morfologicznie podobnych do ESC. Wszystkie klony wyizolowano na selektywnym podłożu, w którym mogą rosnąć tylko komórki z aktywną fosforybozylotransferazą hipoksantynową. Analiza elektroforetyczna wykazała, że wszystkie klony miały wariant alleliczny fosforybozylotransferazy hipoksantynowej charakterystyczny dla myszy DD/c. Analiza cytogenetyczna wykazała, że trzy z czterech klonów hybrydowych miały niemal diploidalny zestaw chromosomów. Jeden niemal tetraploidalny klon zawierał dwie populacje komórek hybrydowych, z których jedna była tetraploidalna, a druga, mniejsza, była diploidalna.

Analiza mikrosatelitarna, która umożliwia rozróżnienie dowolnej pary homologicznych chromosomów myszy 129/01a i DD/c, w klonach hybrydowych z niemal diploidalnym zestawem wykazała, że w dwóch klonach wystąpiła wyraźna preferencyjna eliminacja autosomów partnera somatycznego. Większość autosomów w klonach HESS2 i HESS3 miała markery linii 129/01a, tj. partnera pluripotentnego. Wyjątkiem były chromosomy 1 i I: w klonach HESS2 i HESS3, obok markerów komórek HM-1, markery partnera somatycznego były obecne w niewielkich ilościach. Takie wyniki mogą odzwierciedlać niepełną segregację chromosomów 1 i I partnera somatycznego i są zgodne z danymi cytogenetycznymi, że trisomię tych chromosomów obserwuje się w 30-40% komórek klonów HESS2 i HESS3. Klon HESS4 różnił się znacząco pod względem składu chromosomowego: wiele autosomów w tym klonie pochodziło z genomu ESC (chromosomy 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 i 17), ale chromosomy 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 i 19 były reprezentowane przez homologi obojga rodziców. Ilościowy stosunek mikrosatelitów oznaczających te homologiczne chromosomy wynosił w przybliżeniu 1:1. Pozwoliło to autorom założyć, że jeden homolog pochodził z genomu ESC, a drugi ze zróżnicowanych komórek. W niektórych subklonach klonu HESS4 obecne były tylko markery chromosomów 18 i 19 partnera somatycznego. Uzyskane wyniki wskazują, że w komórkach klonu HESS4 oprócz segregacji chromosomów partnera somatycznego nastąpiła eliminacja jednego lub obu homologów wyżej wymienionych chromosomów genomu pluripotentnego, czyli nastąpiła obustronna segregacja chromosomów obojga rodziców – jest to zjawisko bardzo nietypowe, gdyż segregacja chromosomów tylko jednego z rodziców jest charakterystyczna dla cytohybryd.

Ponadto po 20. pasażu wszystkie klony komórek hybrydowych zawierały tylko markery chromosomu X partnera somatycznego, tj. chromosom X ESC został zastąpiony chromosomem X partnera somatycznego w klonach. Ten ważny fakt potwierdzają dane hybrydyzacji in situ przy użyciu sondy znakowanej FITC specyficznej dla chromosomu X myszy: pozytywny sygnał wykryto tylko na jednym chromosomie. Należy zauważyć, że na wcześniejszych etapach hodowli (przed 15. pasażem), zgodnie z danymi cytogenetycznymi, wiele komórek zawierało dwa chromosomy X. Dlatego zastosowanie selektywnych mediów pozwala na manipulowanie składem chromosomowym komórek hybrydowych i selektywną selekcję klonów niosących pojedyncze chromosomy partnera somatycznego na tle genomu ESC.

Ponieważ unikalną cechą genomu cytohybrydowego jest lokalizacja genomów rodzicielskich w jednym jądrze, naturalnie pojawia się pytanie o zachowanie właściwości pluripotentnych genomu embrionalnego w hybrydach ESC-komórki somatyczne w warunkach jego bliskiego kontaktu z genomem zróżnicowanej komórki. Morfologicznie cytohybrydy ESC i komórek somatycznych były podobne do linii rodzicielskiej ESC. Ocena pluripotencji wykazała, że wszystkie klony z niemal diploidalnym zestawem chromosomów były zdolne do tworzenia ciał embrionalnych w kulturach zawiesinowych, w których obecne były pochodne trzech warstw zarodkowych.

Większość komórek hybrydowych zawierała antygen ECMA-7, marker charakterystyczny dla wczesnych zarodków myszy, a także miała wysoką aktywność fosfatazy alkalicznej. Najbardziej przekonujące dane na temat wysokich właściwości pluripotentnych komórek hybrydowych uzyskano w eksperymentach nad uzyskaniem serii chimer iniekcyjnych z udziałem komórek hybrydowych klonu HESS2. Analiza markerów biochemicznych wykazała, że potomkowie komórek hybrydowych dawcy byli obecni w większości tkanek chimer. Dlatego komórki hybrydowe uzyskane przez fuzję ESC i somatycznych zróżnicowanych komórek zachowują pluripotentność na wysokim poziomie, w tym zdolność do tworzenia chimer po wstrzyknięciu do jamy blastocysty.

Klony HESS2 i HESS4 różniły się znacząco składem chromosomów rodzicielskich, ale miały podobne właściwości pluripotentne. Można by założyć, że pluripotencja w genomie hybrydowym przejawia się jako cecha dominująca, ale możliwe jest, że nie wszystkie chromosomy genomu embrionalnego biorą udział w procesie utrzymywania pluripotentności. Jeśli to założenie jest słuszne, to można oczekiwać, że eliminacja niektórych chromosomów partnera pluripotentnego z genomu komórek hybrydowych nie będzie wiązała się ze zmianą ich statusu pluripotentnego. W tym przypadku analiza segregacji chromosomów rodzicielskich w embrionalnych komórkach hybrydowych pozwoliłaby nam zbliżyć się do identyfikacji chromosomów odpowiedzialnych za kontrolę pluripotentności komórek embrionalnych.

O. Serov i in. (2001) nie znaleźli żadnego potomstwa wśród 50 potomstwa uzyskanego przez skrzyżowanie chimer z myszami normalnymi, które miały genotyp myszy 129/01a i nosiły chromosom X myszy DD. Autorzy uważają, że jest to spowodowane spadkiem pluripotencji w komórkach hybrydowych pod wpływem genomu somatycznego. Alternatywnym wyjaśnieniem może być negatywny wpływ trisomii na niektóre autosomy i nierównowaga chromosomów płciowych (XXY obserwowano w komórkach do 15. pasażu) w komórkach hybrydowych podczas mejozy. Wiadomo, że komórki XXY nie są w stanie przejść mejozy i utworzyć gamet. Trisomia może również powodować spadek aktywności proliferacyjnej komórek hybrydowych, w wyniku czego selektywna przewaga w rozwoju chimer może należeć do komórek zarodka biorcy. Zatem w celu właściwej oceny potencjału pluripotentnego komórek hybrydowych konieczne jest uzyskanie klonów hybrydowych z prawidłowym diploidalnym zestawem chromosomów.

W eksperymentach O. Serova i współpracowników (2001) po raz pierwszy wykazano możliwość przeprogramowania chromosomu X komórki somatycznej w genomie komórek hybrydowych. Wniosek ten autorów wynika z analizy ekspresji genu hprt (markera chromosomu X) w chimerach: obecność wariantu allelicznego hprt myszy DD/c wykryto we wszystkich analizowanych tkankach chimerycznych. Należy podkreślić, że po wprowadzeniu komórek hybrydowych do jamy blastocysty cytohybrydy popadają w warunki nieselektywne, a zachowanie chromosomu X w genomie komórek hybrydowych oznacza, że stał się on jego obligatoryjnym składnikiem i genom nie odróżnia go od chromosomu Y partnera pluripotentnego.

Podsumowując wyniki analizy interakcji genomu somatycznego i pluripotentnego w hybrydowych komórkach embrionalnych, autorzy dochodzą do wniosku, że w niektórych cytohybrydach pluripotencja przejawia się jako cecha dominująca. Genom hybrydowy jest zdolny do przeprogramowania poszczególnych chromosomów zróżnicowanych komórek, co jednak nie wyklucza możliwości odwrotnego wpływu genomu somatycznego na pluripotentność genomu embrionalnego. Podczas hodowli komórek hybrydowych indukcja różnicowania zachodzi znacznie częściej niż w pierwotnej linii rodzicielskiej ESC HM-1. Podobny efekt obserwuje się podczas formowania kolonii pierwotnych: wiele kolonii pierwotnych embrionalnych komórek hybrydowych różnicuje się na wczesnych etapach formowania, przy dużych stratach klonów podczas ich selekcji i reprodukcji.

Tak więc cytohybrydy utworzone przez fuzję ESC z komórkami somatycznymi, pomimo bliskiego kontaktu z genomem zróżnicowanych komórek, zachowują pluripotentność jako unikalną właściwość genomu embrionalnego. Ponadto w takich komórkach hybrydowych możliwe jest przeprogramowanie pojedynczych chromosomów pochodzących ze zróżnicowanych komórek. Nadal niejasne jest, w jakim stopniu właściwości pluripotentne genomu embrionalnego są zachowywane w komórkach hybrydowych, w szczególności ich zdolność do uczestniczenia w tworzeniu linii zarodkowej w chimerach. Wymaga to uzyskania embrionalnych komórek hybrydowych o normalnym kariotypie. W każdym razie pluripotentne embrionalne komórki hybrydowe mogą stać się prawdziwym modelem genetycznym do identyfikacji chromosomów zaangażowanych w utrzymanie pluripotentności lub jej kontrolowanie, ponieważ dwustronna segregacja chromosomów rodzicielskich potencjalnie zapewnia taką możliwość.

Nie mniej atrakcyjne jest badanie zjawiska, które O. Serov i in. (2001) definiują jako „pamięć chromosomową”. W genomie hybrydowym homologiczne chromosomy znajdują się w dwóch alternatywnych konfiguracjach: homologi partnera somatycznego przeszły już kiedyś różnicowanie, podczas gdy w homologach partnera pluripotentnego proces ten dopiero się zaczyna. W konsekwencji zachowanie wysokich właściwości pluripotentnych przez komórki hybrydowe wskazuje, że „pluripotentna” konfiguracja homologów ESC jest wystarczająco stabilna w genomie hybrydowym, pomimo wpływu czynników transakcyjnych pochodzących od partnera somatycznego. Opisane powyżej oznaki przeprogramowania homologicznych chromosomów zróżnicowanego genomu podczas rozwoju chimer nie wykluczają możliwości, że na pierwszych etapach formowania i hodowli cytohybryd in vitro zachowują one swój status nabyty podczas różnicowania in vivo. Według ostatnio uzyskanych danych, gdy embrionalne komórki hybrydowe zostaną przeniesione do nieselektywnego środowiska, wykazują one intensywną eliminację chromosomów tylko partnera somatycznego, tj. genom komórek hybrydowych łatwo rozróżnia homologi po hodowli in vitro przez 10-15 pasaży. Tak więc embrionalne komórki hybrydowe stanowią obiecujący model eksperymentalny do badania nie tylko tak fundamentalnej właściwości genomu embrionalnego, jak pluripotencja, ale także jej alternatywy - różnicowania embrionalnego.

Skuteczność terapeutyczna przeszczepu komórek macierzystych zarodka

Przed analizą skuteczności terapeutycznej przeszczepu ESC i ich pochodnych, podsumowujemy powyższy materiał. Możliwości ESC w zakresie pełnej realizacji embriogenezy in vitro są niewystarczające, ponieważ wady rozwojowe w tym przypadku wynikają z braku komórek macierzystych mezenchymalnych, które powstają w organizmie autonomicznie i niezależnie od ESC. Potencjał genetyczny ESC jest mniejszy niż potencjał genetyczny zygoty, dlatego ESC nie są wykorzystywane bezpośrednio do klonowania zarodków. Unikalny potencjał biologiczny ESC jako jedynych komórek, w których programy rozwojowe są w pełni wdrażane w spójnej realizacji, jest wykorzystywany w badaniach funkcji genów. Za pomocą ESC dekodowane są pierwsze kombinacje sygnałów aktywujących ekspresję wczesnych i późnych genów kodujących rozwój trzech warstw zarodkowych. Zachowanie pluripotencji genomu ESC in vitro czyni je unikalnym narzędziem regeneracji naprawczej, zdolnym do automatycznego uzupełniania strat komórkowych w przypadku uszkodzenia narządów i tkanek. W idealnym hipotetycznym scenariuszu można założyć, że „...podczas przeszczepiania embrionalnych komórek macierzystych dawcy, do organizmu biorcy przenoszone są kompaktowo spakowane programy, które w sprzyjających warunkach realizowane są w konstrukcji nowej tkanki”7, zdolnej do „...skutecznego zintegrowania się z organizmem biorcy zarówno na poziomie morfologicznym, jak i funkcjonalnym”.

Naturalnie, po opracowaniu metod monodyferencjacji ESC, rozpoczęto badanie in vivo aktywności funkcjonalnej komórek uzyskanych in vitro z jednego wyspecjalizowanego klonu. Proliferujący klon ESC generuje populacje migrujących komórek progenitorowych, które są naprawdę zdolne do aktywnej integracji w obszarach uszkodzenia tkanki biorcy, co jest wykorzystywane w medycynie regeneracyjno-plastycznej. Ustalono, że przeszczep neuronów DOPA do istoty czarnej zmniejsza objawy kliniczne w eksperymentalnym hemiparkinsonizmie. Regionalne przeszczepy macierzystych komórek nerwowych dawcy zmniejszają stopień zaburzeń motorycznych spowodowanych urazem lub stłuczeniem rdzenia kręgowego i mózgu. Uzyskano również pierwsze pozytywne wyniki przeszczepu komórek macierzystych w chorobach demielinizacyjnych. Wydaje się, że potencjał regeneracyjno-plastyczny ESC otwiera nieograniczone możliwości wykorzystania przeszczepu komórek w medycynie praktycznej. Jednak po przeszczepieniu do stref ektopowych, ESC nieuchronnie przekształcają się w guzy. Potworniaki powstają, gdy ESC są wstrzykiwane podskórnie myszom z niedoborem odporności. Gdy zawiesiny ESC są przeszczepiane pod torebkę jądra u myszy syngenicznych, powstają również potworniaki, składające się z różnych tkanek, których komórki są pochodnymi wszystkich trzech listków zarodkowych. W takich potworniakach procesy zmniejszonej organogenezy są niezwykle rzadkie.

Wiele badań dostarcza informacji na temat pozytywnych wyników przeszczepiania wczesnych pochodnych ESC zwierzętom z patologią eksperymentalną. Neurotransplantacja komórkowa z wykorzystaniem pochodnych ESC jest dalej rozwijana w eksperymentach i pierwszych badaniach klinicznych w celu korygowania zaburzeń czynnościowych w urazach mózgu i kręgosłupa oraz w leczeniu syringomielii i stwardnienia rozsianego (Repin, 2001). Wraz z pojawieniem się techniki neurogenezy in vitro z ESC, zamiast stosowania tkanki mózgowej zarodka, opracowywane są metody przeszczepiania pochodnych neurosfer uzyskanych z kultur tkanki nerwowej zarodka. Takie zawiesiny przeszczepów są znacznie bardziej jednorodne i zawierają zaangażowane prekursory neuronów i neuroglii.

Przy regularnym dodawaniu kwasu retinowego w dawce 10 μg/ml do pożywki hodowlanej przez 6 tygodni, w linii ludzkiego zarodka-(terato)-raka NTERA-2 powstaje ponad 80% neuronów postmitotycznych. Całkowitą jednorodność populacji neuronów uzyskuje się poprzez sortowanie przepływowe dojrzałych neuronów znakowanych markerami immunofenotypowymi, co pozwala pozbyć się pozostałości potworniaka i niedojrzałych komórek. Po przeszczepieniu do różnych obszarów mózgu zwierząt doświadczalnych, takie neurony nie tylko przeżywają, ale także integrują się z regionalnymi sieciami neuronowymi. U zwierząt z modelami doświadczalnymi lokalnych defektów OUN, neurotransplantacja zmniejsza kliniczne objawy takich patologii u ludzi, jak skutki urazowego uszkodzenia mózgu, udaru, chorób demielinizacyjnych, dziedzicznych defektów rozwoju móżdżku, chorób odkładania lipidów i polisacharydów.

Aby zoptymalizować procesy regeneracji w chorobach zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego, opracowywane są technologie pozyskiwania oligodendrocytów wytwarzających mielinę z ESC. Pierwszy etap tradycyjnie obejmuje proliferację ESC z reprodukcją liczby komórek wymaganych do przeszczepu. W drugim etapie przeprowadza się ukierunkowane różnicowanie komórek w populację prekursorów oligodendrocytów wytwarzających mielinę, które jest kontrolowane przez selektywne antygeny markerowe.

Pewne perspektywy otwierają się przed wykorzystaniem pochodnych ESC w celu opracowania metod korygowania niedoborów odporności wywołanych defektami genetycznymi w dojrzewaniu grasicy. W badaniach na myszach knockout (rag 1) z indukowanym defektem genu - zaburzeniem mechanizmu rekombinacji loci V(D)J genów TCR, prowadzącym do utraty funkcji limfocytów T, przeszczepienie wczesnych pochodnych ESC do grasicy zwierząt przywraca dojrzewanie normalnych populacji klonów odpornościowych odpowiedzialnych za odporność komórkową. Trwają badania kliniczne przeszczepu preformowanych in vitro ESC w leczeniu śmiertelnych dziedzicznych anemii u dzieci.

Sprzeciwy wobec szybkiego wprowadzenia transplantacji komórek macierzystych do kliniki opierają się na ograniczonej liczbie stabilnych linii ludzkich komórek macierzystych zarodkowych i konieczności ich standaryzacji. Aby zwiększyć czystość standaryzowanych linii ESC, a także dorosłych ludzkich komórek macierzystych, proponuje się zastosowanie metody selekcji linii opartej na molekularnej analizie genetycznej krótkich tandemowych powtórzeń DNA. Konieczne jest również testowanie linii ESC pod kątem obecności małych przegrupowań chromosomowych i mutacji genetycznych, których potencjał wystąpienia w warunkach hodowli komórkowej jest dość wysoki. Przedstawiono tezę o obowiązkowym testowaniu właściwości wszystkich typów ESC i regionalnych pluripotentnych komórek macierzystych, ponieważ ich reprodukcja in vitro może prowadzić do pojawienia się nowych cech, które nie są nieodłączne dla komórek macierzystych zarodkowych lub tkanek ostatecznych. W szczególności zakłada się, że długotrwała hodowla w mediach z cytokinami zbliża linie ESC do komórek nowotworowych, ponieważ przechodzą one podobne zmiany w szlakach regulacji cyklu komórkowego wraz z nabyciem zdolności do przeprowadzania nieograniczonej liczby podziałów komórkowych. Niektórzy autorzy, opierając się na potencjale rozwoju guza, uważają transplantację wczesnych pochodnych komórek macierzystych zarodkowych do ludzi za lekkomyślną. Ich zdaniem znacznie bezpieczniej jest używać zaangażowanych potomków ESC, tj. linii zróżnicowanych komórek progenitorowych. Jednak obecnie nie opracowano jeszcze niezawodnej techniki uzyskiwania stabilnych linii komórek ludzkich, które różnicują się w pożądanym kierunku.

W związku z tym w literaturze pojawia się coraz więcej danych na temat pozytywnego efektu terapeutycznego przeszczepu pochodnych ludzkich komórek macierzystych zarodka. Jednak wiele z tych badań jest recenzowanych i krytykowanych. Niektórzy badacze uważają, że wyniki wczesnych badań klinicznych mają charakter wstępny i wskazują jedynie na to, że komórki macierzyste są zdolne do wywierania korzystnego wpływu na przebieg kliniczny danej choroby. Dlatego konieczne jest uzyskanie danych na temat odległych wyników przeszczepu komórek. Jako argument przytaczane są etapy rozwoju klinicznej neurotransplantologii. Rzeczywiście, początkowo w literaturze przeważały publikacje na temat wysokiej skuteczności przeszczepu fragmentów mózgu zarodka w chorobie Parkinsona, ale później zaczęły pojawiać się doniesienia negujące skuteczność terapeutyczną tkanki nerwowej zarodka lub płodu przeszczepionej do mózgu pacjentów.

Pierwsze badania kliniczne przeprowadzono w celu oceny bezpieczeństwa przeszczepu neuroblastów pochodzących z teratocarcinoma ESC NTERA-2, których niedojrzałe komórki poddano proliferacji w hodowli do momentu zgromadzenia masy 100 milionów komórek. Część komórek uzyskanych w ten sposób wykorzystano do scharakteryzowania fenotypu i określenia zanieczyszczeń komórkowych, a także do zbadania ewentualnego zanieczyszczenia wirusami i bakteriami. LIF i warstwę odżywczą komórek podścieliska płodu usunięto z pożywki hodowlanej, a następnie stworzono warunki do ukierunkowanego różnicowania ESC w neuroblasty przy użyciu kombinacji cytokin i czynników wzrostu. Następnie neuroblasty oczyszczono z niedojrzałych komórek teratocarcinoma na sorterze przepływowym. Po wtórnym oczyszczeniu i charakterystyce fenotypowej przeszczepionych komórek, zawiesinę neuroblastów (10-12 milionów) wstrzyknięto do jądra podstawnego mózgów pacjentów (w siódmym miesiącu po udarze krwotocznym) za pomocą specjalnej mikrokaniuli i strzykawki pod kontrolą stereotaktyczną i tomografii komputerowej. Roczne badanie przesiewowe po przeszczepie następstw przeszczepu neuronów do strefy udarowej nie wykazało żadnych skutków ubocznych ani niepożądanych. U połowy pacjentów zaobserwowano poprawę funkcji motorycznych w okresie od 6 do 12 miesięcy po przeszczepie. Pozytywnym zmianom klinicznym towarzyszyło zwiększenie ukrwienia strefy udarowej po przeszczepie komórek: średni wzrost absorpcji znakowanej fluorescencyjnie 2-deoksyglukozy, według pozytonowej tomografii emisyjnej, osiągnął 18%, a u niektórych pacjentów - 35%.

Jednakże amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia przeprowadziły niezależne badanie klinicznej skuteczności neurotransplantacji u pacjentów z chorobą Parkinsona. Pacjentom z pierwszej grupy przeszczepiono fragmenty tkanki nerwowej zarodka, które produkują dopaminę, podczas gdy druga grupa pacjentów przeszła operację pozorowaną. Wyniki wskazują na zerową skuteczność kliniczną takiego neurotransplantacji, pomimo faktu, że neurony zarodkowe produkujące dopaminę przetrwały w mózgach biorców. Co więcej, 2 lata po przeszczepie tkanki nerwowej zarodka u 15% pacjentów rozwinęła się trwała dyskineza, której nie było u pacjentów w grupie placebo (Komórki macierzyste: postęp naukowy i przyszłe kierunki badań. Nat. Inst, of Health. USA). Obserwacje dalszego rozwoju choroby u tych pacjentów są w toku.

Niektórzy autorzy wiążą sprzeczne dane literaturowe dotyczące oceny skuteczności klinicznej neurotransplantacji z odmiennym podejściem do doboru grup pacjentów, nieodpowiednim doborem metod obiektywnej oceny ich stanu, a przede wszystkim z różnym okresem rozwoju tkanki nerwowej zarodka i różnymi obszarami mózgu, z których ta tkanka została pobrana, różnymi rozmiarami przeszczepu i metodologicznymi cechami interwencji chirurgicznej.

Należy zauważyć, że próby bezpośredniego przeszczepu pluripotentnych komórek macierzystych zarodka do obszaru prążkowia mózgu szczurów z doświadczalnym hemiparkinsonizmem wiązały się z proliferacją ESC i ich różnicowaniem w neurony dopaminergiczne. Należy założyć, że nowo powstałe neurony zostały skutecznie zintegrowane w sieciach neuronowych, ponieważ po przeszczepie ESC zaobserwowano korekcję anomalii behawioralnych i asymetrii ruchowej w teście apomorfinowym. Jednocześnie niektóre zwierzęta zmarły z powodu przekształcenia przeszczepionych ESC w guzy mózgu.

Eksperci z National and Medical Academys of the USA, specjaliści z National Institute of Health of the USA uważają, że potencjał kliniczny ESC zasługuje na najpoważniejszą uwagę, ale podkreślają potrzebę szczegółowego zbadania ich właściwości, prawdopodobieństwa powikłań i długoterminowych konsekwencji w eksperymentach na odpowiednich biologicznych modelach chorób człowieka (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press.; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Z tego punktu widzenia ważne jest, że porównawcza analiza histologiczna eksperymentalnych potworniaków uzyskanych przez przeszczepienie zawiesiny ESC do jądra z potworniakami powstałymi w wyniku przeszczepienia wczesnego zarodka, który również zawiera ESC, wykazała, że ESC, niezależnie od źródła pochodzenia lub interakcji z niektórymi otaczającymi komórkami, realizują swój potencjał nowotworowy w ten sam sposób. Udowodniono, że takie potworniaki mają pochodzenie klonalne, ponieważ guzy składające się z pochodnych wszystkich trzech warstw zarodkowych mogą powstać z jednego ESC (Rega, 2001). Warto zauważyć, że gdy klonowane ESC o prawidłowym kariotypie zostały przeszczepione myszom z niedoborami odporności, powstały również potworniaki składające się z różnych typów zróżnicowanych komórek somatycznych. Te dane eksperymentalne są niepodważalnym dowodem na klonalne pochodzenie potworniaków. Z punktu widzenia biologii rozwoju wskazują one, że nie wiele zaangażowanych komórek progenitorowych, ale pojedyncza pluripotentna komórka macierzysta działa jako źródło zróżnicowanych pochodnych wszystkich trzech listków zarodkowych, które tworzą potworniaka. Jednak na drodze do praktycznego przeszczepu komórek wyniki tych badań są, jeśli nie zakazem, to przynajmniej znakiem ostrzegawczym potencjalnego zagrożenia, ponieważ inokulacja ESC lub pierwotnych komórek zarodkowych do różnych tkanek dorosłych myszy z niedoborem odporności nieuchronnie powoduje rozwój guzów z przeszczepionych komórek macierzystych. Zwyrodnienie nowotworowe ektopowo przeszczepionych ESC towarzyszy pojawieniu się satelitarnych populacji zróżnicowanych komórek - z powodu częściowego różnicowania ESC i klonów progenitorowych w wyspecjalizowane linie. Co ciekawe, gdy ESC są przeszczepiane do mięśni szkieletowych, neurony najczęściej powstają obok komórek potworniaka. Jednakże wprowadzenie ESC do dzielącego się jaja lub blastocysty wiąże się z całkowitą integracją komórek z zarodkiem bez tworzenia elementów nowotworowych. W tym przypadku ESC są integrowane praktycznie ze wszystkimi narządami i tkankami zarodka, w tym z zawiązkiem narządów płciowych. Takie zwierzęta allofenowe uzyskano po raz pierwszy przez wprowadzenie komórek teratocarcinoma 129 do wczesnych zarodków w stadiach 8-100 komórek. U myszy allofenowych populacje heterogenicznych komórek pochodzących z ESC dawcy są integrowane z tkankami szpiku kostnego, jelita, skóry, wątroby i narządów płciowych, co umożliwia tworzenie nawet międzygatunkowych chimer komórkowych w eksperymencie. Im krótszy okres rozwoju wczesnego zarodka, tym wyższy procent chimeryzacji komórek, przy czym najwyższy stopień chimeryzacji obserwowano w układzie krwiotwórczym, skórze, układzie nerwowym, wątrobie i jelicie cienkim zarodka allofenowego. W organizmie dorosłym tkanki chronione przed układem odpornościowym biorcy przez bariery histokrwinkowe są podatne na chimeryzację:przeszczepienie pierwotnych komórek rozrodczych do miąższu jąder wiąże się z włączeniem komórek macierzystych dawcy do warstwy tkanki zarodkowej biorcy. Jednakże, podczas przeszczepiania ESC do blastocysty, nie dochodzi do powstania chimerycznych zarodków narządów płciowych z wytworzeniem pierwotnych komórek rozrodczych dawcy. Pluripotencję ESC, gdy zostaną stworzone specjalne warunki, można również wykorzystać do klonowania: przeszczepienie mysich ESC do 8-16-komórkowego zarodka myszy, w którym mitozy komórkowe są blokowane przez cytokasynę, promuje realizację normalnej embriogenezy z rozwojem zarodka z dawczych ESC.

Dlatego alternatywą dla allogenicznego przeszczepu ESC jest klonowanie terapeutyczne oparte na przeszczepieniu jąder komórek somatycznych do enukleowanego jaja w celu stworzenia blastocysty, z której wewnętrznej masy komórkowej izoluje się linie ESC genetycznie identyczne z dawcą jądra somatycznego. Technicznie rzecz biorąc, pomysł ten jest całkiem wykonalny, ponieważ możliwość tworzenia linii ESC z blastocyst uzyskanych po przeszczepieniu jąder somatycznych do enukleowanych jaj została wielokrotnie udowodniona w eksperymentach na zwierzętach laboratoryjnych (Nagy, 1990; Munsie, 2000). W szczególności u myszy homozygotycznych pod względem mutacji genu rag2, fibroblasty uzyskane w hodowli komórek tkanki podnaskórkowej zostały wykorzystane jako dawcy jąder, które przeszczepiono do enukleowanych oocytów. Po aktywacji oocytu „zygotę” hodowano do momentu uformowania blastocysty, z której wewnętrznej masy komórkowej wyizolowano ESC i przeniesiono do linii komórek nullizygotycznych dla genu zmutowanego (rag2~/~). Mutację jednego genu allelicznego korygowano w takich ESC metodą rekombinacji homologicznej. W pierwszej serii eksperymentów ciała embrionalne uzyskano z ESC z rekombinowanym przywróconym genem, ich komórki transfkowano rekombinowanym retrowirusem (HoxB4i/GFP) i po reprodukcji wstrzykiwano do żyły myszy rag2~/~. W drugiej serii tetraploidalne blastomery agregowano z genetycznie zmodyfikowanymi ESC i przeszczepiano samicom biorczyń. Otrzymane immunokompetentne myszy służyły jako dawcy szpiku kostnego do przeszczepu myszom z mutacją rag2~/~. W obu seriach wynik był pozytywny: po 3-4 tygodniach u wszystkich myszy stwierdzono dojrzałe, normalne komórki mieloidalne i limfoidalne zdolne do produkcji immunoglobulin. Tak więc przeszczep jąder somatycznych do oocytów może być stosowany nie tylko do uzyskania linii ESC, ale także do cytogenoterapii - korekty anomalii dziedzicznych, wykorzystując ESC jako wektor do transportu korygującej informacji genetycznej. Jednak ten kierunek przeszczepiania komórek, oprócz problemów bioetycznych, ma swoje ograniczenia. Nie jest jasne, jak bezpieczny będzie przeszczep terapeutycznie klonowanych komórek o genotypie identycznym z genotypem konkretnego pacjenta, ponieważ takie komórki mogą wprowadzać mutacje, które tworzą predyspozycje do innych chorób. Normalne ludzkie jaja pozostają trudno dostępnym obiektem, podczas gdy nawet przy przeszczepianiu jąder somatycznych do enukleowanych jaj zwierzęcych, tylko 15-25% skonstruowanych „zygot” rozwija się do stadium blastocysty. Nie ustalono jeszcze, ile blastocyst jest potrzebnych do uzyskania jednej linii pluripotentnych sklonowanych ESC. Warto również zwrócić uwagę na wysoki poziom kosztów finansowych związanych ze złożonością terapeutycznej metodologii klonowania.

Podsumowując, należy zauważyć, że w ESC pluripotencja genomu z hipometylowanym DNA łączy się z wysoką aktywnością telomerazy i krótką fazą C^ cyklu komórkowego, co zapewnia ich intensywną i potencjalnie nieskończoną reprodukcję, podczas której ESC zachowują diploidalny zestaw chromosomów i „młodzieńczy” zestaw cech fenotypowych. Klonalny wzrost ESC w hodowli nie zakłóca ich różnicowania w żadną wyspecjalizowaną linię komórkową organizmu, gdy proliferacja zostanie zatrzymana i dodane zostaną odpowiednie sygnały regulacyjne. Restrykcyjne różnicowanie ESC w linie komórek somatycznych in vitro odbywa się bez udziału mezenchymy, z pominięciem Nochteys, poza organogenezą i bez formowania zarodka. Ektopowe wprowadzenie ESC in vivo nieuchronnie prowadzi do powstawania potworniaków. Transplantacja komórek macierzystych zarodka do blastocysty lub wczesnego zarodka wiąże się z ich integracją z tkankami zarodka i stabilną chimeryzacją jego narządów.

Technologie regeneratywno-plastyczne oparte na przeszczepie komórek są punktem przecięcia zainteresowań przedstawicieli biologii komórki, biologii rozwojowej, genetyki doświadczalnej, immunologii, neurologii, kardiologii, hematologii i wielu innych dziedzin medycyny doświadczalnej i praktycznej. Najważniejsze wyniki badań eksperymentalnych dowodzą możliwości przeprogramowania komórek macierzystych z ukierunkowaną zmianą ich właściwości, co otwiera perspektywy sterowania procesami cytodyferencjacji za pomocą czynników wzrostu - do regeneracji mięśnia sercowego, przywracania uszkodzeń OUN i normalizacji funkcji aparatu wyspowego trzustki. Jednak dla powszechnego wprowadzenia przeszczepu pochodnych ESC do medycyny praktycznej konieczne jest dokładniejsze zbadanie właściwości ludzkich komórek macierzystych i kontynuowanie eksperymentów z ESC na eksperymentalnych modelach chorób.

Kwestie bioetyczne i problem odrzucenia allogenicznego przeszczepu komórek mogą zostać rozwiązane dzięki odkrytej plastyczności genomu regionalnych komórek macierzystych dorosłego organizmu. Jednak początkowe informacje, że podczas przeszczepiania izolowanych i starannie scharakteryzowanych autologicznych komórek hematopoetycznych do wątroby, z których pochodzą nowe hepatocyty, integrujące się z zrazikami wątroby, są obecnie rewidowane i krytykowane. Niemniej jednak opublikowano dane, że przeszczepianie nerwowych komórek macierzystych do grasicy powoduje powstawanie nowych kiełków limfocytów T i B dawcy, a przeszczepianie nerwowych komórek macierzystych mózgu do szpiku kostnego prowadzi do powstawania kiełków hematopoetycznych z długoterminową mielo- i erytropoezą dawcy. W konsekwencji pluripotentne komórki macierzyste zdolne do przeprogramowania genomu do potencjału ESC mogą przetrwać w narządach dorosłego organizmu.

Źródłem pozyskiwania ESC do celów medycznych pozostaje ludzki embrion, co z góry przesądza o nieuchronności nowego skrzyżowania kwestii moralnych, etycznych, prawnych i religijnych w punkcie pochodzenia ludzkiego życia. Odkrycie ESC dało potężny impuls do wznowienia trudnych dyskusji na temat tego, gdzie przebiega granica między żywymi komórkami a materią, bytem a osobowością. Jednocześnie nie ma uniwersalnych norm, reguł i praw dotyczących stosowania ESC w medycynie, pomimo wielokrotnych prób ich tworzenia i przyjmowania. Każde państwo, w ramach swojego ustawodawstwa, rozwiązuje ten problem niezależnie. Ze swojej strony lekarze na całym świecie nadal próbują wyprowadzić medycynę regeneracyjno-plastyczną poza zakres takich dyskusji, przede wszystkim poprzez wykorzystanie rezerw komórek macierzystych dorosłych, a nie komórek macierzystych embrionalnych.

Krótka historia izolacji komórek macierzystych zarodka

Komórki raka terato(zarodkowego) wyizolowano ze spontanicznie występujących potworniaków jąder myszy 129/ter-Sv, spontanicznych potworniaków jajników myszy Lt/Sv oraz z potworniaków pochodzących z ektopowo przeszczepionych komórek lub tkanek zarodkowych. Spośród stabilnych linii komórkowych raka terato(zarodkowego) myszy uzyskanych w ten sposób, niektóre były pluripotentne, inne różnicowały się tylko w jeden określony typ komórek, a niektóre były całkowicie niezdolne do cytodyferencjacji.

W pewnym okresie koncentrowano się na badaniach, których wyniki wskazywały na możliwość przywrócenia komórkom potworniaka (rak zarodka) normalnego fenotypu po ich wprowadzeniu do tkanek rozwijającego się zarodka, a także na pracach nad tworzeniem in vitro genetycznie zmodyfikowanych komórek potworniaka (rak zarodka), za pomocą których uzyskano zmutowane myszy do biologicznego modelowania ludzkiej patologii dziedzicznej.

Do wyizolowania linii komórkowych terato-(embrio)-carcinoma zastosowano hodowlę w zawiesinie warunkowej. W hodowli komórki terato-(embrio)-carcinoma, takie jak ESC, rosną, tworząc ciała embrionalne i wymagają obowiązkowej dysocjacji w celu przeniesienia linii, utrzymując pluripotentność na warstwie odżywczej fibroblastów embrionalnych lub podczas hodowli w zawiesinie w podłożu warunkowym. Komórki pluripotentnych linii terato-(embrio)-carcinoma są duże, kuliste, charakteryzują się wysoką aktywnością fosfatazy alkalicznej, tworzą agregaty i są zdolne do wielokierunkowego różnicowania. Po wprowadzeniu do blastocysty łączą się z morulą, co prowadzi do powstawania chimerycznych zarodków, w składzie różnych narządów i tkanek, w których znajdują się pochodne komórek terato-(embrio)-carcinoma. Jednakże zdecydowana większość takich chimerycznych zarodków umiera w macicy, a w narządach przeżywających noworodków chimerycznych rzadko wykrywa się obce komórki i występują one w niskiej gęstości. Jednocześnie częstość występowania nowotworów (włókniakomięsaka, mięśniakomięsaka prążkowanokomórkowego, innych rodzajów nowotworów złośliwych i gruczolaka trzustki) gwałtownie wzrasta, a zwyrodnienie guza często występuje w okresie wewnątrzmacicznego rozwoju chimerycznych zarodków.

Większość komórek raka terato-(zarodkowego) w mikrośrodowisku normalnych komórek embrionalnych niemal naturalnie nabywa cech nowotworowych złośliwych. Uważa się, że nieodwracalna złośliwość jest spowodowana aktywacją protoonkogenów w procesie strukturalnych przegrupowań. Jednym z wyjątków są komórki linii raka terato-(zarodkowego) SST3, uzyskane z potworniaków jąder myszy (linia 129/Sv-ter), które wykazują wysoką zdolność do integracji z tkankami i narządami zarodka bez późniejszego tworzenia się guza u myszy chimerycznych. Pochodne linii komórek raka terato-(zarodkowego) u myszy chimerycznych praktycznie nie uczestniczą w tworzeniu pierwotnych gonocytów. Najwyraźniej jest to spowodowane wysoką częstością aberracji chromosomowych charakterystycznych dla większości linii raka terato-(zarodkowego), w których komórkach obserwuje się zarówno aneuploidię, jak i nieprawidłowości chromosomowe.

W warunkach laboratoryjnych uzyskano kilka stabilnych linii komórek ludzkiego potworniaka (raka zarodkowego) charakteryzujących się pluripotencją, wysoką aktywnością proliferacyjną i zdolnością do różnicowania się podczas wzrostu w hodowlach. W szczególności linię ludzkich komórek potworniaka (raka zarodkowego) NTERA-2 wykorzystano do zbadania mechanizmów cytodyferencjacji nerwowej. Po przeszczepieniu komórek tej linii do okolicy podkomorowej przedniego mózgu nowonarodzonych szczurów obserwowano ich migrację i neurogenezę. Podejmowano nawet próby przeszczepienia neuronów uzyskanych w hodowli komórek linii potworniaka (raka zarodkowego) NTERA-2 pacjentom z udarami, co według autorów doprowadziło do poprawy przebiegu klinicznego choroby. Jednocześnie nie odnotowano przypadków złośliwości przeszczepionych komórek linii potworniaka (raka zarodkowego) NTERA-2 u pacjentów z udarem.

Pierwsze linie niezróżnicowanych pluripotentnych mysich komórek macierzystych zarodkowych uzyskali na początku lat 80. Evans i Martin, którzy wyizolowali je z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty – embrioblastu. Wyizolowane linie ESC przez długi czas zachowywały pluripotentność i zdolność do różnicowania się w różne typy komórek pod wpływem czynników w specjalnym podłożu hodowlanym.

Termin „embrionalna pluripotentna komórka macierzysta” należy do Leroya Stevensa, który badając wpływ smoły tytoniowej na częstość występowania nowotworów, zwrócił uwagę na spontaniczne występowanie potworniaka jąder u liniowych (129/v) myszy z grupy kontrolnej. Komórki potworniaka jąder charakteryzowały się wysokim wskaźnikiem proliferacji, a w obecności płynu z jamy brzusznej spontanicznie różnicowały się z tworzeniem neuronów, keratynocytów, chondrocytów, kardiomiocytów, a także fragmentów włosów i kości, ale bez żadnych oznak uporządkowanej cytoarchitektury odpowiadającej tkanki. Po umieszczeniu w hodowli komórki potworniaka rosły jako pluripotentne klony oderwane od podłoża i tworzyły ciała embrionalne, po czym przestawały się dzielić i ulegały spontanicznemu nieuporządkowanemu różnicowaniu w neurony, glej, komórki mięśniowe i kardiomiocyty. Stevens odkrył, że potworniak 129/v myszy zawiera mniej niż 1% komórek zdolnych do różnicowania się w szereg wyspecjalizowanych linii somatycznych, a samo różnicowanie zależy od czynników, które na nie wpływają (skład płynu otrzewnowego, produkty dojrzałych komórek lub tkanki dodane do hodowli). Hipoteza Leroya Stevensona dotycząca obecności embrionalnych komórek progenitorowych linii zarodkowej wśród komórek potworniaka została potwierdzona: zawiesina komórek embrioblastycznych z zarodków przedimplantacyjnych w tkankach dorosłych myszy utworzyła potworniaki, a czyste linie komórkowe wyizolowane z nich po dootrzewnowym podaniu zwierzętom biorcom różnicowały się w neurony, kardiomiocyty i inne komórki somatyczne pochodzące ze wszystkich trzech listków zarodkowych. W eksperymentach in vivo przeszczepienie ESC (pobranych z embrioblastu, ale nie z trofoblastu) do zarodków myszy innej linii w stadiach blastomerycznych 8–32 skutkowało narodzinami zwierząt chimerycznych (bez rozwoju guzów), w których narządach znaleziono kiełki tkanki dawcy. Chimeryzm obserwowano nawet w linii komórek zarodkowych.

Pierwotne komórki progenitorowe wyizolowane z zarodka genitalnego zarodka myszy odpowiadały pod względem morfologii, fenotypu immunologicznego i cech funkcjonalnych ESC uzyskanym przez Stevensona z potworniaka i embrioblastu. W chimerach urodzonych po wprowadzeniu ESC do blastocysty, allofenowa morfogeneza narządów charakteryzowała się mozaikową przemianą strukturalno-funkcjonalnych jednostek dawcy i biorcy wątroby, płuc i nerek. W niektórych przypadkach obserwowano powstawanie krypt jelitowych lub zrazików wątroby składających się zarówno z komórek biorcy, jak i dawcy. Jednak morfogeneza zawsze była realizowana zgodnie z programem genetycznym gatunku, do którego należał biorca, a chimeryzm był ograniczony wyłącznie do poziomu komórkowego.

Następnie ustalono, że proliferacja ESC bez cytodyferencjacji na warstwie odżywczej komórek pochodzących z mezenchymu (fibroblastów płodowych) zachodzi przy obowiązkowej obecności LIF w selektywnych pożywkach odżywczych, które selektywnie zapewniają przeżycie tylko komórek macierzystych i progenitorowych, podczas gdy zdecydowana większość wyspecjalizowanych elementów komórkowych ginie. Stosując takie metody, w 1998 roku James Thomson wyizolował pięć zimmortalizowanych linii komórek macierzystych zarodków z wewnętrznej masy komórkowej ludzkiej blastocysty. W tym samym roku John Gerhart opracował metodę izolowania nieśmiertelnych linii ESC z guzka narządów płciowych cztero- do pięciotygodniowych ludzkich zarodków. Ze względu na ich unikalne właściwości, zaledwie dwa lata później, komórki macierzyste zarodków i komórki macierzyste tkanek ostatecznych zaczęto stosować w praktyce medycyny regeneracyjnej i terapii genowej.