Embrionalne komórki macierzyste

Odkrycie embrionalnych komórek macierzystych - nie było przypadkiem, i pojawił się na przygotowanej badań gleb w zakresie rozwoju badań biologii. Termin "komórka macierzysta" został wprowadzony do medycyny już w roku 1908 na kongresie towarzystwa hematologicznego w Berlinie przez Aleksandra Maksimova w związku z komórkami hematopoetycznymi. Długo zanim Izolacja i wytwarzanie stabilnych linii pluripotencjalnych komórek macierzystych we wczesnym rozwoju procesu badawcze stosowane terato- macierzystych (komórki zarodków i raka, którym badane nieznanych mechanizmów embriogenezy, w tym sekwencji ekspresji genów wczesnych i produktów białkowych pracy.

Ale czy totipotencja ludzkiego genomu jest nieodwracalnie utracona w procesie ewolucji? Nie, a embriogeneza jest dowodem. Jeśli tak, to kiedy zrealizuje się druga ścieżka ewolucyjnego rozwoju? Prawdopodobnie, gdy osoba opuszcza Kosmos, gdzie warunki środowiskowe będą względnie stałe przez dość długi czas. Utrata kości (demineralizacja kości w stanie nieważkości) powoli podatne remodeling i regenerację można uznać jako pierwszy etap procesu adaptacyjnego dla ludzi jako gatunek istnienia w przestrzeni. Jednak płatność za drugą ścieżkę ewolucyjnego rozwoju będzie inna - sterylność będzie ceną za zwrócenie wszystkich komórek totipotencji i bezwzględnej plastyczności. Tak więc mnożenie się w tym świecie "ewolucyjnych kameleonów" nie będzie miało mejozy, otpochkovaniem. Ale będziemy żyć długo. Nieśmiertelność telomerazy to nieśmiertelność ameby. W organizmie wielokomórkowym komórki macierzyste są podłożem ilościowej i jakościowej długowieczności.

[1], [2], [3], [4]

Źródła embrionalnych komórek macierzystych

Źródła dzisiaj embrionalnych komórek macierzystych do badań laboratoryjnych Linia mysi potworniak (129 / SV, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) i potworniaka ludzki (NTERA-2, TERA-2 H-klon 9), a także Hess Trauneona. Jednakże obecność szczegółowo paszport komórkowego wskazując fenotyp odporności, wyniki analizy chromosomu profili ekspresji mRNA poddanych receptory oraz białka sygnalizacji wewnątrzkomórkowej nie rekompensuje istotnych wad teratokartsinomnyh linii ESC - szybkiej utraty totipotency i niemożliwość zastosowania w badaniach klinicznych i mieszano różnicowania w hodowli jest bardzo trudny do wyizolowania czysta wyspecjalizowana linia z heterogenicznej populacji komórek. Dlatego też, zazwyczaj źródło linii ESC wytwarzany dla celów klinicznych, służy jako wewnętrzny masy komórkowej blastocysty, zarodki poszczególne blastomery w etapie 8 komórek rozwoju komórki Morula późniejszych etapów i pierwotne komórki zarodkowej.

Należy zauważyć, że komórki potworniaka, chociaż mają właściwość pluripotencji, mają znacznie niższy potencjał pluripotentny w porównaniu z ESC. Ich integracja z komórkami zarodkowymi rzadko prowadzi do tworzenia chimer, w których gametach z genotypem komórek potworniaka nigdy nie powstają. Uważa się, że jest to spowodowane częstym pojawieniem się nieprawidłowości chromosomalnych w hodowli komórek teratocarcin: utrata chromosomu Y, różnych trisomów, delecji lub translokacji.

Próby rozróżnienia ludzkiej linii ESC były wielokrotnie podejmowane, ale tego zadania nie można było rozwiązać, ponieważ normalne ludzkie blastocysty są trudne do uzyskania dostępu do obiektów. Ponadto u ludzi częstość występowania nieprawidłowości chromosomowych jest wyższa niż w embriogenezie zwierząt. Przeważająca większość wczesnych ludzkich embrionów uzyskanych po zapłodnieniu in vitro wykazuje chaotyczny mozaikowat chromosomowy i często występują aberracje liczbowe i strukturalne. Nawet później, na etapie blastocysty, jedynie 20-25% ludzkich embrionów składa się z komórek o prawidłowym kariotypie. Niemożliwe było użycie takich zarodków do wytworzenia ESC, ponieważ zygoty zwykle hodowano do stadiów dwóch lub czterech blastomerów, a następnie przeszczepiano do macicy. Dopiero stosunkowo niedawno opracowano niezawodną technikę do uprawy zapłodnionych ludzkich jajeczek na stadium blastocysty. Wprowadzenie tej techniki do praktyki zapłodnienia in vitro nie tylko zwiększyło częstotliwość udanych wyników implantacji, ale również uczyniło z normalnych blastocyst bardziej dostępnym obiektem.

Innym źródłem pluripotencjalnych komórek macierzystych jest pierwotnych komórek płciowych, które, w przeciwieństwie do bardziej zaawansowanych populacji progenitorowych germenativnogo nabłonka nie znajdują się na powierzchni integryny beta, ale ekspresja wysoka aktywność shelochnoy fosfatazy. Należy zauważyć, że w doświadczeniu badano populację komórek macierzystych, które powstały z komórek pierwotnych płci, od lat 80. Ubiegłego wieku. W tym samym czasie opracowano technikę izolacji pierwotnych komórek rozrodczych z rdzenia mysiej zarodkowej gonady. Pierwsze nieudane wyniki hodowli pierwotnych komórek rozrodczych in vitro zasugerowały beznadzieję tych prób, ponieważ komórki, mimo że przeżyły, nie rozmnażały się i nie umarły w ciągu pierwszych 24 godzin. Później stwierdzono, że pierwotne komórki mysie myszy rozmnażają się in vitro tylko w obecności rozpuszczalnych i związanych z błoną specyficznych polipeptydowych czynników wzrostu w pożywce hodowlanej. Liczne badania wykazały, że konieczna jest obecność w pożywce hodowlanej nie tylko LIF, ale membrannosvyazannyh i czynnik Steel rozpuszczalne (SIF) dla przeżycia i proliferacji pierwotnych komórek rozrodczych. Peptydy te są wytwarzane przez komórki somatyczne zarodków homozygotycznych pod względem mutacji Steel, a jeden z nich jest ligandem protoonkogenu cKit.

Pierwotne komórki rozrodcze ssaków i ludzi mają pochodzenie pozagałdowe i są źródłem klonalnego rozwoju linii komórek płciowych. Począwszy od linii komórek rozrodczych pierwotnym, jak również wszystkich tkanek zarodka i pozazarodkowej mezodermy daje epiblast (pierwotne ektodermy) wczesne zarodki posiadające mozaika organizację strukturalną. Mikrochirurgiczne usunięcie różnych części wczesnego zarodka ustaliło strefę lokalizacji w epiblerze klonu zaangażowanych prekursorów pierwotnych komórek płciowych. Za pomocą rodaminy dekstranu, który został użyty jako marker komórkowy, ustalono, że prekursory pierwotnych komórek płciowych znajdują się w proksymalnym regionie epiblastu, obok pozartogórkowej ektodermy. Pierwotna seksualna linia komórkowa wyłania się z klonu 45-komórkowego, którego podział następuje na samym początku gastrulacji. Następnie dochodzi do segregacji klonów, a podczas gastrulacji pierwotne komórki płciowe wchodzą do pozazarodkowej mezodermy i znajdują się w podstawie pąka owsianego, za pierwotnym pasmem. Stąd główne komórki rozrodcze migrują w kierunku brzusznej części endodermy, a następnie aktywnie poruszają się wzdłuż krezki, wypełniając wałeczki narządów płciowych pod koniec migracji. W procesie migracji, jak również w pierwszych 2-3 dniach lokalizacji w gonadowym rdzeniu, podstawowe komórki płciowe aktywnie proliferują i przechodzą osiem cykli replikacyjnych. Jeśli na początku migracji występuje około 50 pierwotnych komórek rozrodczych, w cystach reprodukcyjnych zarodków myszy w rozwoju 12-dniowym liczba komórek pierwotnych przekracza 25 000.

Funkcjonalnego podobieństwa RSG i pierwotnych komórek rozrodczych wykazuje pełną integrację tego ostatniego na zastąpieniu blastocysty masy wewnętrzną wnęką i późniejszego pełnego rozwoju zarodka, tkanki, która składa się tylko z potomkami pierwotnych komórek rozrodczych. Według innych cech mysie pierwotne komórki rozrodcze PGC są identyczne, wykazujące zdolność do różnicowania się w różnych kierunkach, w celu wytworzenia ciał embrioidalnych, in vitro, in vivo potworniaki powstają, gdy wstrzyknięto podskórnie do myszy z niedoborem odporności przypominających spontaniczne potworniaki myszy jąder linia 129 / ter.

Stwierdzono, że po dodaniu LIF, związanego z błoną i rozpuszczalnego SIF do wyizolowanych pierwotnych komórek rozrodczych, 8-dniowe zarodki myszy przeżywają i rozmnażają się w hodowli przez 4 dni, ale potem umierają. Ponadto, okres gdy hodowla obserwowano śmierci pierwotnych komórek rozrodczych zbiega się w czasie z etapem rozwoju zarodka myszy (12,5-13,5 dni), gdy kubki pierwotne komórki rozrodcze żeńskie gonad wprowadzić mejozy i męskich pierwotnych komórek rozrodczych są zablokowane mitotycznego podział. Jednakże, jeśli dodać do środowiska czynniki nie tylko wzrost LIF i z FUS, ale również z FGF2, komórki pierwotne kiełków kontynuować proliferirovat i subkultury powstają kolonie komórek można odtworzyć nawet po wyjęciu z otoczenia czynników wzrostowych (SIF i FGF). Takie komórki można hodować przez długi czas na zarodkowym podłożu fibroblastów bez dodatku rozpuszczalnego czynnika wzrostu LIF. To właśnie te stabilne linie komórkowe pochodzące z pierwotnych komórek rozrodczych zostały zasugerowane jako nazywane zarodkowymi komórkami zarodkowymi. Tego terminu nie można uznać za udane, ponieważ niemożliwe jest wytwarzanie embrionalnych komórek płciowych podczas hodowli komórek EG, które mogą prowadzić kolejne etapy oogenezy lub spermatogenezy. Wynika to z faktu, że linie komórek EG, chociaż pochodzą z komórek pierwotnych, ale nabywają właściwości zarodkowych pluripotencjalnych komórek macierzystych w kulturze, tracą zdolność do angażowania się w hermetyczne linie. Innymi słowy, pierwotne komórki płciowe tracą właściwości prekursorów gamet po ich hodowli i są przekształcane w pluripotencjalne komórki podobne do ESC.

Należy zauważyć, że kiedy podaje się myszy z niedoborem odporności, potworniaki nie pojawiają się. Przyjmuje się, że utrata zdolności ludzkich komórek EG do inicjacji potworniaków wynika z faktu, że linie te nie zostały utworzone bezpośrednio z hodowanych pierwotnych komórek płciowych, ale zostały uzyskane z komórek izolowanych z ciał embrioidalnych. Dlatego możliwe jest, że są potomkami pluripotentnych, ale już zaangażowanych komórek.

Należy zauważyć, że istnieją zasadnicze różnice między komórkami EG a głównymi komórkami zarodkowymi. Te ostatnie nie umożliwiają uzyskania chimerycznych zarodków myszy, co wskazuje na brak zdolności pierwotnych komórek płciowych do integracji z wewnętrzną masą komórkową lub trophektodermą. Charakterystyka populacji komórek płci pierwotnej jest bardziej zbliżona do linii komórek somatycznych późniejszych zarodków, których wprowadzenie do blastocysty również nie prowadzi do tworzenia chimerycznych zarodków.

Techniki modyfikacji hodowanie ciał embrioidalnych uzyskane z np agregację komórki pozostawia przez selekcję na pożywce selekcyjnej, żeby odebrać kolejną populacji komórek pluripotencjalnych, zwane „komórki pochodzące z ciał embrioidalnych (embrionalne komórki ciała - EBD uzyskanych komórek). Zdolność komórek EBD do namnażania przez długi czas w hodowli pozwoliła na stworzenie stabilnych linii komórkowych zaangażowanych komórek. Otrzymano klony komórek eksprymujących szerokie spektrum mRNA i markerów białkowych wyspecjalizowanych komórek. Podejście to w rezultacie okazało się, że seksualna Pierwotne ludzkie komórki pluripotencjalne i różnicują się in vitro na różne typy komórek: neuronów, gleju, śródbłonku naczyń, komórki krwiotwórcze, mięśni i komórek endodermalnego.

Alternatywne źródła zarodkowych komórek macierzystych

Alternatywnym źródłem ludzkich linii ESC mogą być komórki hybrydowe. Wszczepieniem macicy struktury rzekomej krowiego geterogenomnoy otrzymanego podczas łączenia poprzez elektroporację fetusa ludzkich komórek somatycznych z krowami jaj, które uprzednio zostały usunięte z przedjądrza, pozwala, aby otrzymać wewnętrzną masę komórek przed wszczepieniem zarodka sztucznych stadiach rozwojowych. W tym celu, blastocysta z jaja krowy z przeszczepionym jądrem komórki ludzkiej otrzymuje się w pierwszym etapie.

W drugim etapie embrioblast jest ekstrahowany z blastocysty, a z niego - ESC według metody Thomsona. Warto zauważyć, że najlepsze wyniki izolacji linii ESC przy użyciu tej metody uzyskano przy użyciu jąder komórek pęcherzykowych lub pierwotnych komórek płciowych, które utrzymują się w organizmie człowieka w stanie hibernacji. Wynika to z faktu, że jajo krowie przeszczepione ludzkie komórki jądra neukorochennye powinien mieć wysoką aktywność i telomerów telomeazy że unika klonów ESC przedwczesne starzenie pochodzące z hybrydowego jaja (Repin, 2001). Wiadomo, że najważniejszymi wewnątrzkomórkowymi markerowymi białkami EGF są Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, które należą do tak zwanych białek tłumika chromatyny. Tłumiki zapewniają szczególnie kompaktowe upakowanie heterochromatyny, co zapobiega tworzeniu się pętli euchromatyny. Pakiet chromatyny, w którym pośredniczą te białka, koreluje z totipotencją genomu ESC. Do tej pory ustalono, że dojrzałe jajeczkowanie bydła i ludzi jest jedynym rodzajem wyspecjalizowanych komórek zawierających wysokie stężenia białek tłumiących w cytoplazmie. Na tej podstawie opracowano metodę produkcji hybrydowych ESC poprzez przeniesienie jąder komórek somatycznych do niejądrowych owulek krów. Wstępne badania in vitro wykazały, że cytoplazma komórek jajowych krów przywraca totipotencję genomu ludzkiego jądra komórki somatycznej w 12-24 godzinach hodowli.

Szczególnie interesujące są dane dotyczące cech rozwoju przedimplantacyjnego ludzkich zarodków, które wskazują na późniejszą wymianę totipotencjalnych komórek przez populację komórek pluripotencjalnych niż na myszach. Badanie transformacji komórek wykazało, że komórki wewnętrznej masy komórkowej ludzkiego blastocysty, oprócz ESC, również wytwarzają komórki trofoblastu, co wskazuje na ich całkowitą siłę działania.

Wiadomo, że na etapie blastocysty występują dwie różne populacje komórek. Jedną z nich jest zewnętrzna warstwa blastocysty, trofektoderma, pochodząca z komórek trofoblastów i innych zarodkowych składników łożyska. Druga populacja komórek jest zgrupowana w gęstą masę, która styka się z wewnętrzną powierzchnią tropodermodermy. Populacja komórek wewnętrznej masy komórek pochodzi ze wszystkich tkanek i zarazków organów zarodkowych. Na etapie późnego blastocysty tworzy się zewnętrzna endoderma z wewnętrznej masy komórek i tworzy się epiblast (główny ektoderma). Równocześnie komórki epiblastu zachowują pluripotencję, podczas gdy zdolność do różnicowania komórek endogennej części zarodkowej jest ograniczona.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Pozyskiwanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych

Do niedawna sądzono, że trofoblastu uzyskane z hESC niemożliwych. Jednakże diploidalne linia trophectoderm komórki macierzyste izolowane z blastocysty na nośniku, który zawiera, zamiast LIF i FGF2 heparyny proliferuje i transformuje do komórek macierzystych. Jeśli usuniesz z pośród FGF2, komórki trophectoderm zatrzymać hodowlę, zaczynają Endoreduplikacja chromosomów i elementów komórkowych trofektodermalnye stopniowo przekształcona w komórkach trofoblastu olbrzymich. Prawdopodobnie LIF nie stymuluje proliferację komórek trophectoderm ze względu na fakt, że FGF2 wyzwala transsignalizatsii mechanizm jako FGF2, wiązanie do cytoplazmatycznego receptora (FGFR2), aktywują kinazę MAP w cytoplazmie - ERK1 i ERK2. W związku z tym, po wprowadzeniu do komórek blastocysty jednego szlaku sygnalizacyjnego (LIF - gpl30 - JAK kinazy - STAT3) wewnętrzne komórki masy komórkowej są przetwarzane w pluripotencjalnych hESC, podczas aktywacji drugiego mechanizmu sygnalizacji przezbłonowej (FGF2 - FGFR2 - MAP kinazy ERK1 / ERK2) komórki macierzyste w trophectoderm blastocysty osad. Wybór ścieżki sygnałowej z kolei zależy od aktywności Oct4 genów. Ten gen należące POU domeny, położone w locus t 17 autosomy i jest wyrażone w oogenezy w okresie kruszenie, jak również w komórkach wewnętrznej masy komórkowej blastocysty, i pierwotnych komórek rozrodczych. Funkcjonalnego genu rolę Oct4 jest kodujący czynnik transkrypcyjny niezbędne do występowania komórek pluripotencjalnych, ich różnicowania i odróżnicowania.

Ekspresja genu okt4 w ESC jest różna w zależności od interakcji tego czynnika transkrypcyjnego z kofaktorami. Kierunkowa regulacja ekspresji okt4 w blastocystach wykazała, że gdy aktywność ta spada, połowa komórek tworzy tropodermoderma, podczas gdy wraz ze wzrostem indukowanej ekspresji okta 4 występuje głównie ESC.

W eksperymencie nie można przekształcić ESC w linię podczas hodowli totipotencjalnych blastomerów na etapie kruszenia, a także na etapie gastrulacji i późniejszych stadiów rozwoju zarodkowego. Myszy RSG zazwyczaj rozdzielają 3,5-4,5 dni ciąży, która pokrywa się z szóstym (jednowarstwowych blastocysty) i siódmym etapie (dwuwarstwowych blastocysty - wczesny jaj cylindrów) prawidłowej embriogenezy. Oczywiście, tylko w okresie przedimplantacyjnym zarodki myszy zawierają populacje komórek, które można przekształcić w ESC. W konsekwencji izolacja linii ESC jest możliwa tylko na pewnych etapach embriogenezy. Totytipotencjalne, z punktu widzenia możliwości rozwoju żywotnego zarodka z błonami zarodkowymi i łożyskiem, są zygota i blastomy powstające podczas kruszenia. Utrata całkowitej siły komórek zarodkowych rozpoczyna się na etapie późnej moruli, kiedy dalsze rozdrabnianie blastomerów zależy od ich lokalizacji. Wczesne blaetomery Morula zachowują totipotencję, ponieważ eksperymentalne manipulacje ze zmianami w ich lokalizacji, na przykład odwrócenie ich położenia, nie uniemożliwiają rozwoju pełnego zarodka.

Stwierdzono, że na wydajność uwalniania ESC w linii wpływ ma stan blastocyst w momencie ich eksplantacji. Zastosowanie symulacji blastocysty po siedmiodniowego diapauzy w drogach rodnych u myszy, owariektomii na 3,5 dnia ciąży i leczonych progesteronem, przyczynia się do bardziej udanym rozdzieleniu linii embrionalnych komórek macierzystych. Zakłada się, że w takich warunkach zwiększa się liczba blastomerów tworzących wewnętrzną masę komórkową. Możliwe jest również, że cykl komórkowy rozciąga się i większość blastomerów wchodzi w fazę G0.

Ponadto, tworzenie stabilnych pluripotencjalnych linii hESC zależy embrionów genotypu: łatwo odróżnić od RSG Mysi blastocysty linią 129, jest znacznie trudniej uzyskać je przy użyciu myszy CS7BL / 6 i praktycznie niemożliwe do izolowania linii z hESC blastocysty myszy CBA / CA. Oczywiście wczesne zarodki mają pewne cechy genetyczne, które wpływają na rozwój pluripotencjalnej linii ESC. Jednakże, gdy hoduje epiblast izolowane, a także selektywnego wyboru różnicowania linii komórkowej hESC od wczesnych zarodków myszy CBA / CA nadal przydzielone.

Sprawdzona standardowa technika uzyskiwania linii ESK z blastocyst jest podana w podręcznikach laboratoryjnych dotyczących techniki eksperymentowania z wczesnymi zarodkami. Eksperymentalne linie ESK można również uzyskać przez hodowanie izolowanej epiblastu (ektodermy pierwotnej) 4,5-dniowych zarodków myszy z dość złożoną techniką mikrochirurgiczną i zmodyfikowanymi warunkami hodowli. Złożoność tej procedury jest uzasadniona, ponieważ częstotliwość powstawania linii ESC była znacznie wyższa niż w pracy z wewnętrzną masą komórkową blastocysty.

Aby wyizolować linie ESC, każdy klon przenosi się do mikro-studzienki, zagregowuje się 40-60 komórek, ponownie rozprasza. Wielokrotne powtórzenie tej procedury pozwala uzyskać unieśmiertelnioną linię ESC z maksymalną szybkością proliferacji komórek normokaryotycznych przyłączonych do plastiku, które poprzez 50-100 pasaży utrzymują totipotencję i wysoką aktywność telomerazy. W procesie wspomagania linii ESC najbardziej niebezpieczne jest zanieczyszczenie środowiska lub surowicy endotoksynami bakteryjnymi - nawet śladowe stężenie endotoksyny w pożywce hodowlanej powoduje masową śmierć niedojrzałych komórek płciowych. Dzięki starannej kontroli wzrostu liniowego i terminowego dyspersji RSG w kulturze są zdolne do symetrycznego rozszczepienia, w którym obie komórki potomne pozostają pluripotencjalne i stanie wykonać nieograniczoną liczbę cykli komórkowych, utrzymując diploidalnej kariotyp oraz całkowitą moc.

Wybór czystej populacji ludzkich ESC można przeprowadzić po transfekcji do ich genomu rekombinowanych cząsteczek DNA zawierających gen kodujący syntezę zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Ekspresja GFP wzrasta wraz ze wzrostem ESC w warunkach, które wspierają jego proliferację, podczas gdy wraz z rozpoczęciem różnicowania poziom ekspresji tego genu jest zmniejszony, co umożliwia selekcję czystych, stabilnych pluripotencjalnych linii komórkowych na selektywnym podłożu. Przy uprawianiu selekcji ESC przez GFP częstotliwość występowania kolonii jest znacznie zwiększona, ponieważ w warunkach upraw selekcyjnych wyeliminowane jest silne działanie antyproliferacyjne zróżnicowanych komórek.

Tłumaczenie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, zgodnie z wykorzystaniem sposobu ich izolacji zarodków przedimplantacyjnej (etap 80-120 komórek), które pozostają po procedurze zapłodnienia in vitro. W tym celu sztucznie uzyskane "nadmiarowe" zarodki są mechanicznie zdyspergowane w środowisku Delbecco-Needle. Po zaznaczeniu komórek selektywnymi przeciwciałami monoklonalnymi za pomocą znacznika fluorescencyjnego, komórki embrionu są izolowane. Zarodkowy zarodek jest zdyspergowany w poszczególnych komórkach przy użyciu mieszaniny disaspazy-kolagenazy. Zdysocjowane komórki hodowano w specjalnej pożywce (80% średniej Delbekko + 20% płodowej surowicy cielęcej w obecności 500 ug / ml IL-6, LIF i SCF) na monowarstwy embrionalnych fibroblastach podajnik 3 pierwszych pasaży. W tym przypadku przeżycie i proliferacja komórek macierzystych i progenitorowych jest potwierdzona przez ekspozycję na IL-6, LIF i SCF. W takim środowisku ESC wzrastają przez klony zawiesinowe nieposortowanych zeskrobanych komórek, które muszą zostać zdysocjowane przez delikatne wielokrotne pipetowanie. Nowe klony pojawiają się w kulturze zawieszonej w dniach 5-7. Maksymalną szybkość wzrostu ESC osiąga się przez powtarzaną dysocjację klonów na etapie 10-15 komórek. Następnie każdy klon przenosi się do mikrokomórki i hoduje do agregatu 40-50 komórek. Procedurę powtarza się wielokrotnie w pasażach, zwiększając objętość hodowli do gęstości 5-10 milionów komórek na 6-centymetrowy kubek. Za pomocą takiego Thomson pasażowanie Wydzielono 10 klonów nieśmiertelnych ludzkich RSG, która poprzez przejścia 100 zachowują wysoką aktywność telomerazy, zdolność do intensywnego proliferacji i cech fenotypowych minimalna całkowita moc, z różnicowaniem w każdym z 350 specjalnych linii komórkowych, które są pochodnymi ekto-, mezo - i endoderma. Różnicowanie ludzkich ESC się rozpoczęła (po zmianie ośrodka, dodatek i eliminacji LIF) w surowicy z przylegania komórek do podłoża, co wskazuje na rozwój cytoszkieletu i ekspresję receptorów adhezji. Ważne jest, aby przy nieograniczonej proliferacji ludzkich RSG zachował się prawidłowy kariotyp.

Druga metoda izolowania ludzkich linii ESC opiera się na wykorzystaniu pierwotnych komórek płciowych. Eksperymentalne badania wykazały, że linie komórkowe Eu można uzyskać z blaszek narządów płciowych 12.5-dniowych zarodków myszy. Jednak w tych przypadkach częstotliwość tworzenia linii komórek progenitorowych była znacznie niższa niż w doświadczeniach z wcześniejszymi zarodkami. Jednocześnie pierwotne komórki płciowe z gonad mysich embrionów o 13,5-dniowym wieku ciążowym są generalnie niezdolne do przekształcenia się w linie.

Pierwsze stabilne linie pluripotencjalnych ludzkich komórek EG uzyskano z pierwotnych gonocytów izolowanych z pąków narządów płciowych zarodków 5-9 tygodniowych. Wyizolowane komórki hodowano na podłożu inaktywowanego mysich embrionalnych fibroblastach w pożywce DMEM z surowicą płodu, do którego dodano merkaptoetanolu forskolinę, jak i rekombinowanych ludzkich czynników wzrostu (FGF) i LIF. Po 7-12 dniach pojawiły się w hodowli kolonie wielokomórkowe, zgodnie z cechami morfologicznymi i markerami molekularnymi odpowiadającymi ludzkim komórkom EG. Po agregacji komórki te wytworzyły ciałka zarodkowe, z których dalszym rozwojem pojawiły się wyspecjalizowane komórki, charakterystyczne dla pochodnych wszystkich trzech liści embrionalnych. W ciągu 10-20 pasaży linie komórkowe EG zachowały prawidłowy kariotyp i nie utraciły pluripotencji.

Pokazano również, że połączony efekt LIF, związanego z błoną i rozpuszczalnego czynnika Steel, jak również TGF-b, modyfikuje program rozwoju pierwotnych komórek płciowych. Zamiast zatrzymywać podziały mitotyczne i zaczynając różnicować się w kierunku oogenezy lub spermatogenezy, pierwotne komórki płciowe nadal proliferują. Po kilku dodatkowych cyklach mitotycznych stają się one podobne do komórek epiblastu, a utrata właściwości prekursorów komórek zarodkowych przekształca się w pluripotentne zarodkowe komórki macierzyste EG.

Tak więc, w 1998 roku, unieśmiertelnione linie pierwotnych komórek płciowych zostały po raz pierwszy wyizolowane z seksualnych rdzeni ludzkiej tkanki zwłok płodu. Embriogeneza ludzkich pierwotnych komórek płciowych pojawiają się woreczka żółtkowego w trzecim tygodniu rozwoju, a na 4-5 tygodnie, komórki te migrują do powierzchni guzka płciowego, gdzie tworzą populację pierwotnych gonocytes dormantnye. W stanie nieaktywnym pierwotne komórki rozrodcze pozostają w zarodku aż do porodu. Pierwotne linie komórkowe, z kiełków ekstrahowano z narządów płodów guzek 5-9-tygodniowych zarodków pobranych ex tempore materiał, który traktuje się mieszaniną kolagenaza typu IV i V, hialuronidazy DNazy do jakościowej i ilościowej wydajności wzrost komórek. Pierwotne komórki rozrodcze w tkankach guzka płodowego narządów płciowych są otoczone przez komórki zrębu Sertoli (mezenchymalne). Celem funkcjonalne komórek Sertoliego jest wytwarzanie czynników anty-apoptotycznych (ligand Fas), mitogeny i środkami immunosupresyjnymi, które chronią komórki macierzyste seksualnych ataku immunologicznego przez organizm. Ponadto mikrośrodowisko podścieliska gruźlicy narządów płciowych odgrywa ważną rolę w dojrzewaniu gamet. Wyizolowane pierwotne komórki rozrodcze sadzi się w hodowli na warstwie podścieliska z zarodkami składającymi się z płodowych fibroblastów z pierwszych trzech pasaży. Najskuteczniejszą kombinacją mitogenów jest kompleks składający się z LIF, FGF i forskoliny (stymulator do tworzenia cAMP). Proliferacji pierwotnych komórek rozrodczych in vitro, wymagają dodawania surowicy płodowej, w obecności pierwszorzędowej gonocytes rozrodu klonów hodowli towarzyszy powstawanie kulistych, komórki nieprzylegające do podłoża.

US National Institutes of Health na podstawie podsumowujący dotychczasowe informacje na temat metod alokacji linii ludzkich ESC z blastocysty powstał wstępny wniosek, że sukces alokacja ESC jest najbardziej prawdopodobne, gdy hodowane blastocysty z dobrze uformowanej masy wewnętrzna komórek (komórki macierzyste: postępu naukowego i przyszłe kierunki badań Nat. Inst, of Health USA). Z tego punktu widzenia, najlepszym źródłem RSG tworzyć linie są ludzkie blastocysty dnia 5 rozwoju, którego przydział wewnętrznej masy komórkowej należy ostrożnie wyjąć trophectoderm. Izolowane komórki wewnętrzna masa składająca się na tym etapie 30-35 komórek musi być hodowany na podłożu mysich embrionalnych fibroblastów, która jest decydująca dla tworzenia się kolonii w hodowli hESC.

Analiza fenotypowych cech embrionalnych komórek macierzystych

Szczególnie interesująca jest międzygatunkowa analiza porównawcza fenotypowych cech ESC. Stwierdzono, że ludzkie kolonie ESC A - gęste skupiska spłaszczone nabłonkowych komórek, podczas gdy u myszy embrioidalnych łydki składa się z luźnego konglomeratu komórek zaokrąglone. W ludzkim ESC wskaźnik stosunku jądro-plazma jest niższy niż w ESK myszy. Embrionalne komórki macierzyste małp tworzą bardziej płaskie kolonie komórek o nierównych krawędziach. We wczesnych klonach naczelnych ESC łatwo widać pojedyncze komórki. Rozprzestrzenianie się ESC wszystkich badanych gatunków zwierząt nie wyraża cząsteczek MHC z pierwszej i drugiej klasy. W tym samym czasie, ludzkie RSG daje pozytywną odpowiedź przeciwciał TERA 1-60 i GCTM-2, co wskazuje na obecność na powierzchni ich keratyny / proteoglikanów siarczanu chondroityny, typowe embrionalnej (potworniakami) -kartsinomnyh komórek macierzystych. Ekspresja w hESC wszystkie rodzaje genu zwierzęta Oct4 sugeruje, że pomimo różnic fenotypowych RSG ludzkich i mysich, najwyraźniej aktywowane przez ten sam zestaw genów, odpowiedzialnych za utrzymanie pluripotencja (Peru, 2001). Ponadto, linie pochodzące z ESC z embrionów szczurów, świń, królików, naczelnych i bydła, mają podobne właściwości morfologiczne, podobny zestaw identyfikacji molekularnej markerów i prawie identyczny mechanizm cząsteczkowy realizacji programu embriogenezy, który pozwala się świeży wygląd w kwestii ksenotransplantacja .

W przeciwieństwie do prawidłowej embriogenezy in vivo proliferacji in vitro hESC nie towarzyszy powstawanie zarodkowych warstw i przechodzi do bloku homeotyczne Nohgenov tła, to jest bez tworzenia się narządów. Ponieważ geny segmentacji nie funkcjonują w kulturze hESC niemożliwe do odtworzenia takie okresy embriogenezy jako zakładka somitów segmentacja jądra, tworzenie woreczka żółtkowego, omocznia prowizoryczna i innych narządów i tkanek. ESC hodowlane zamrożono na początku tworzenia 350 linii restrykcyjnych wyspecjalizowanych komórek. Zatem, komórki progenitorowe pomocnicze, klonu i zlokalizowane centralnie PGC jest jedynym modelem zarodek w czasie rozwoju, w której różne obszary tkanki są wykonane w jednym etapie są inne wyspecjalizowane komórki pochodzą jednak ze wspólnych prekursorów. Mimo, że minimalny poziom receptorów na powierzchni hESC zachowują one zdolność do wykonywania symulacji procesów pierwotnych morfogenetyczne większość wczesnych zarodków strukturze: hESC szlamu w hodowli i kruszyw tworzy strukturę podobną blastocysty lub nawet później zarodków (cylindry jaj). Takie agregaty zawiesinowe zostały odpowiednio nazwane prostymi i złożonymi ciałami zarodkowymi.

Po zmieszaniu różnicują się w różnych komórki embrionalne ciała równocześnie wyrażane przez geny wczesne ektodermy (oct3, FGF-5, węzłowy) endodermy (GATA-4), mezodermy (brachyury) kardiogenny mezodermy (PKH-2,5), cewy nerwowej (msx3 ) i hematopoeza (elkf). Przy użyciu różnych kombinacji z cytokin i czynników wzrostu o Kierowanie tworzenie komórek warstwy zarodkowej in vitro w wielu przypadkach możliwe było uzyskanie ciał embrioidalnych, które korzystnie ekspresją genów ektodermę lub mezodermy, co otwiera drogę do modelowania gastrulacji i wczesnej fazie organogenezy.

Klonalną wzrost hESC dowody asymetrycznego podziału komórkowego, w której tylko jeden z ESC w klonie środkowej zachowuje nieograniczający zdolność rozrodczą, druga komórka potomna wywołuje wytwarzanie komórek progenitorowych, różnicowania się już w najbliższych. Dlatego tempo namnażania klonu na obrzeżach ciała zarodkowego jest wyższe niż w centrum. Komórki brzeżne rosnącego klonu ulegają spontanicznemu zaburzonemu różnicowaniu, migrują lub giną dzięki mechanizmom apoptozy. Zdarzenia te określają los klonu jeśli tempo proliferacji przekracza szybkość migracji i apoptozy śmierci komórek, klon rozmiary nadal wzrastać, stabilizacja występuje z równą apoptozy i szybkości tworzenia nowej prędkości komórek, regresja - odwrotnej proporcji tych procesów. Komórki progenitorowe dzielą się symetrycznie, to znaczy obie komórki potomne są dalej różnicowane w dojrzałe wyspecjalizowane linie komórkowe. Stosunek komórek ESC / progenitorów jest różny, ale zawsze ilość ESC stanowi zaledwie ułamek procenta populacji komórek progenitorowych. Dlatego tylko staranne pipetowanie i terminowa dezagregacja klonów może zwiększyć liczbę ESC w kulturze. Aby uzyskać maksymalną wydajność ESC, najskuteczniejsza była dezagregacja klonów na etapie 10-12 komórek. Kierunek i stopień różnicowania komórek w ciałku zarodkowym zależy od ich lokalizacji. Zewnętrzne embrionalne komórki organizmu nie zachodzi ekspresja genu i Oct4 ulegają różnicowaniu w pierwotnych komórkach endodermy z którego następnie utworzonych komórek nabłonka i ciemieniowej pozazarodkowe trzewnego endodermy. Wewnętrzne komórki ciała embrionalnego wyrażają gen okt4 i zachowują pluripotencję przez 48 godzin hodowli. Jednak wówczas morfologiczna rearanżacja kultury zachodzi w pojedynczej warstwie nabłonka i rozpoczyna się ekspresja genów kontrolujących rozwój pierwotnej ektodermy. Następnie rozpoczyna się proces całkowitej nieuporządkowanej cytodróżnicowania z pojawieniem się różnych typów komórek, które są pochodnymi wszystkich trzech arkuszy zarodkowych. W trakcie spontanicznego różnicowania się embrionalne komórki pierwszego korpusu agregatów powstają znaczniki endodermy w postaci fragmentów (torbieli) woreczka żółtkowego. Ponadto w tych strukturach pojawiają się angioblasty i komórki śródbłonka rosnących naczyń włosowatych. W końcowych etapach spontanicznego różnicowania wewnętrznych komórki embrionalne organizm produkuje różne końcowo zróżnicowanych komórek, między innymi komórek nerwowych, elementy glejowych, komórkach mięśnia sercowego, makrofagów i erytrocytów. W pewnym przybliżeniem (biorąc pod uwagę inwersję przestrzenną arkuszy tworzących tkanek embrionalnych) przez embrionalne organów in vitro może zbadania procesy morfogenetyczne i analiza mechanizmów molekularnych embrionalnych cytodifferentiation okresu początkowego i ustalenia roli poszczególnych genów realizacji tych sposobów.

Zatem w klonie są komórki, w których odkryto różne programy rozwoju genetycznego - ESC, wczesne progenitory i różnicujące populacje progenitorowe. Hodowanie ESC metodami opadania kropli lub hodowli masowej bez warstwy odżywczej i bez dodawania LIF w pożywce prowadzi nieuchronnie do powstania ciał embrioidalnych. Morfologia komórek zewnętrznej i wewnętrznej warstwy ciał embrionalnych jest różna. Zewnętrzna warstwa składa się z dużych, procesowych komórek. Ich powierzchnia, zwrócona w stronę środowiska, pokryta jest licznymi mikrokosmkami. Zewnętrzna warstwa komórek jest oddzielona od wewnętrznej błony podstawnej przypominającej membranę Reicherta, podczas gdy komórki wewnętrznej warstwy ciał zarodkowych są cylindrycznym nabłonkiem. Morfologicznie, wewnętrzna warstwa, chociaż zawiera wiele dzielących się komórek, bardziej przypomina niezróżnicowane kolonie ESC.

Cechy ludzkich zarodkowych komórek macierzystych

Brak interakcji miąższowych-mezenchymalnych w blokowaniu genów homeoza powoduje nieuporządkowany wzrost PGC w kulturze, ponieważ ta karta jest uszkodzona, a infrastruktura powstawanie narządów prowizoryczna sygnału tła. Niezorganizowany wzrost i zakłócanie spontaniczne zróżnicowanie hESC w kulturze brakiem oznakowania zrębowej ramy przyszłych ciał mezenchymalnych: in vitro jest możliwe tworzenie milionów hepatocytów, ale nie można uzyskać żadnych segmentów wątroby, w tym takich elementów konstrukcyjnych i funkcjonalnych, takich jak zatok, przestrzeń komórek disse i Kupffera.

Uważa się, że pluripotencja RSG realizowane wyłącznie w celu utworzenia embriogenezy tkanek i narządów zarodka, podczas gdy pępowina i łożysko pochodzą trofoblastu. Zamknięty w powłoce trofektodermalnuyu ESK wytwarzałyby klony komórkowe prowizoryczne realizacji programu rozwoju przez kombinatorycznych mRNA luzem Nohteyaov topograficzne macierzy, co przesądza układ przestrzenny, kształt, wymiary, liczba i tymczasowych ostatecznych komórek i narządów i zespół miąższu w jednostki strukturalne i funkcjonalne. Jednocześnie ESC są wyłącznie typu komórki, w której mechanizm cząsteczkowy realizacji ich potencjału całkowicie oddzielona od programu genetycznego rozwoju i usług energetycznych się pozbawione możliwości oddziaływania z innymi komórkami w wyniku zablokowania obu percepcji receptora i systemów transsignalizatsii. Jednak odpowiednie RSG aktywacja skutkuje stopniowym embriogenezy rozmieszczenie końcowym Program urodzeniu jest całkowicie ukształtowane i gotowe do pozamacicznej życia organizmu złożonego z miliardów komórek. W tym krótkim czasie, ale dług nie do pomyślenia w komórkowej ścieżki przestrzeń nieuniknionego występowania błędów w mechanizmach molekularnych, które dostarczają funkcji życiowych komórek, oraz w programach, które kontrolują ich proliferację, różnicowanie i specjalizację. Dlatego w nowoczesnych farmakogenomiki rozpatrywane oddzielnie choroba Molecular Devices, a programowanie komórka choroba. A działanie większości nowych leków mających na celu skorygowanie nazwę programu różnicowania, proliferacji i organogenezy, a także regeneracji narządów i tkanek. W dorosłym organizmie poprzez RSG, możliwe staje się kontrolować zachowanie komórek macierzystych / progenitorowych przeszczepionych w mózgu, wątrobie, śledzionie, szpik kostny i inne narządy ludzkie, aby naprawić uszkodzone biorcy narządów miąższowych powodu zróżnicowania i specjalizacji komórki dawcy mezenchymalnych zachowanych matrycy. Zasadniczo program totipotency wprowadza kolejne oocyt genomu poziomu, zygoty i blastomery, ale te komórki nie jest jeszcze możliwe do klonowania i pasażowano w ilościach niezbędnych dla potrzeb experiental i medycyny praktycznej. W związku z tym, ESC jest unikalnym źródłem informacji genetycznej zawierającego trójwymiarową liniową mapę restrykcyjną zarodka i kody wyspecjalizowanych linii komórkowych podczas gastrulacji.

Praktycznie nieograniczone możliwości regeneracyjnego ESC z uwagi na fakt, że ich genomu, w przeciwieństwie do urządzenia genetycznej zróżnicowanych komórek somatycznych, utrzymuje pluripotencja. Przejawem stanie uśpienia zakorzenione w RSG informacji genetycznej jest tzw minimum fenotyp - na powierzchni ESC wyrażania ograniczoną liczbę receptorów, a zatem rozmieszczone bardzo mało programów do interakcji transsignalizatsii aparatury jądrowej komórki z jego mikrośrodowiska. Tle hibernacji genów odpowiedzialnych za ograniczenie specjalistycznych linii komórek i różnicowanie komórek, aktywowane tylko około 30 500 genów, których produkty zapewniają komórki łączności z otaczającą mikrośrodowiska. Stosując metodę analizy szeregowego ekspresji genu wykazano, że ogólności głównych funkcyjnych genomu pola regulujących energii i metabolizm w komórkach somatycznych i ERS w ostatnich określonej bardzo małej ilości mRNA receptorów, białek G, wtórne przekaźniki, transkryptazy, kofaktory ekspresję i represje to znaczy cały system transbłonowego transferu sygnału regulacyjnego do komórki. Wynika to z braku lub bardzo niskiej ekspresji genów transsanalizacji. Podczas różnicowania indukowane w genomie ESC 18 operacji zostaje zatrzymany synchronicznie działa geny t transsignalizatsii aktywacji 61 genu kontrolnego syntezę receptorów adhezyjnych, składników macierzy zewnątrzkomórkowej, ograniczenie transkryptaz elementy messendzhernyh i system transmisji sygnałów do jednostki jądrowego, receptory błonowe komórek osocza. Jednocześnie zablokowaną ekspresję genów odpowiedzialnych za syntezę białek tłumików, a także ekspresją genu koingibitorov zapewniając hESC totipotency genomu.

Markery genetyczne znaleziono dla komórek wszystkich trzech ulotek zarodkowych. Identyfikacja warstwy komórek ektodermy przeprowadzono na ekspresję genów węzłowych, oct3 i FGF-5, komórki mezodermy - brachyury gen zeta-globiny, endodermy - w GATA-4 ekspresji genów. W prawidłowej embriogenezy podczas gastrulacji obserwowano aktywną migrację niedojrzałych populacji komórek macierzystych i progenitorowych, lokalnie wyznaczania obszarów kości twarzy czaszki, niektóre części mózgu, obwodowego układu nerwowego, zaburzenia układu przewodzącego i tkanki grasicy, które są utworzone z klonów przesunięty komórek. Znakowania genów wczesnych komórek zarodkowych warstw ułatwia topograficznych analizę migracji komórek progenitorowych w krajach rozwijających się zarodków. Jest to w szczególności, że komórki w zarodkowym agregaty P19 ekspresji pierwszy gen mezodermy brachyury rozpoczyna się podczas redukcji ekspresji genów aktywatora plazminogenu tkankowego, a-fetoproteiny, keratynę 8 i keratyny 19, które są markerami początku mezodermy populacji migrujących. W związku z tym tworzenie tkanki pochodzenia mezodermalnego rozpoczyna się dopiero po zakończeniu procesu migracji i punkty osadzania komórek progenitorowych mezodermalnego.

O bardzo ograniczonych funkcji fenotypowych i nieobecność wielu bloków transsignalizatsii jednak ESC ekspresję pewnych cząsteczek receptorowych, które można stosować do ich identyfikacji. Warto zauważyć, że antygeny markerów ESC u ludzi i naczelnych uznano za powszechne. Najczęściej stosowane do hESC znakowania przeciwciała znakowane antygeny membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (unikalne antygeny lipidowe stanowiące kompleks glikolipidu GL7 z kwasu sialowego), jak i o dużej masie cząsteczkowej glikoproteiny TRA-1-81, TRA-1-60. Ponadto hESC wyrażania konkretnego zarodkowych antygenu SSEA-1 i endogennej fosfatazy alkalicznej, jak również specyficzny czynnik transkrypcyjny Oct4. Jest ona potrzebna do utrzymania hESC mechanizmy proliferacji - specyficzny czynnik transkrypcji genu Oct4 aktywuje ekspresję czynnika wzrostu fibroblastów 4 ekspresji genu i stabilizuje boks odpowiedzialny nieograniczające powtórzeń DNA do komórek niedojrzałych. Do najważniejszych wewnątrzkomórkowych białek markerowych są Oct3, Oct4 TCF i Groucho, w odniesieniu do białek chromatyny tłumików.

Prawie natychmiast po długim okresie hodowli RSG prób nie powiodła się i organizm został najpierw wytwarza się przez hodowlę komórek macierzystych izolowanych z blastocysty myszy i hodowli komórek zarodkowych podstawowej rozpoczęła stadium badań zdolności ESC pluripotencja po podaniu we wczesnych stadiach rozwoju zarodka. Wykazano, że w moruli i blastocysty PGC są zdolne do tworzenia zarodków chimeryczne, w których wykryty PGC dawcy we wszystkich potomków tkanek somatycznych i nawet gamet. Tak więc, w Developmental Biology stosując ESC skryptowy „most” między eksperymentalnych badań in vivo i in vitro, co znacznie zwiększyło możliwość badania procesów z zakładek tkanek pierwotnych i narządów, ich różnicowanie i organogenezy embrionalnej.

Jest dobrze ustalone, że w warunkach in vivo w trakcie embriogenezy ESK zintegrowane masy komórek wczesnego zarodka lub ich pochodnych, występują we wszystkich narządów i tkanek. PGC kolonizują linii zarodkowej chimerycznego komórek rozrodczych, z których potomkowie tworzą pełną jaj i plemników. Embrionalne komórki macierzyste są klonogenna - pojedyncze PGC mogą tworzyć genetycznie identyczne kolonii komórek markerów molekularnych, które zawierają Oct4 ekspresji genów i fosfatazę alkaliczną, wysoką aktywność telomerazy, a także ekspresją antygenów specyficznych dla zarodka.

W celu zbadania mechanizmów embriogenezy stosując technikę hESC chimeryzacja moruli tworząc strukturę biologiczną, która znajduje się na zewnątrz warstwy tetraploidalne blastomery PGC dawcy i biorcy są podawane do. W ten sposób wytwarza się z trofoblastu potomków tetraploidalny blastomery odbiorcy, który umożliwia implantację i placentation i PGC dawcy działające jako wewnętrzny masy komórek, który jest utworzony z żywotnej linii zarodkowej z głównego korpusu i progenitorowych gamet. Wartość badania ESC nie polega tylko na tym, że podczas manipulacji in vitro genomu zachowane pluripotencja, ale również z faktu, że przy zachowaniu zdolności do uczestniczenia w tworzeniu hESC komórek pierwotnych zarodków chimerycznego zarodka. Wykazano, że tylko jeden potomkiem genetycznie zmodyfikowanych PGC kolonizacji wszystkie pierwszorzędowe i zarazków formujące chimeryczne zarodka otrzymanego przez agregację lub wspólną hodowlę komórek z zarodka 8 komórek. Gdy myszy przeszczepiono RSG Morula transfekowanych gen zielonego białka fluorescencyjnego, potomstwo fluorescencyjne komórek były we wszystkich badanych tkankach rozwijających się zarodków (Shimada, 1999). Transplantacja ESC w moruli może stworzyć realne myszy, ciało, które składa się wyłącznie z potomkami przekazał ESC, która otwiera nowe możliwości dla różnych opcji terapeutycznych klonowania. Teraz takie metodyczne podejście zostało z powodzeniem zastosowane do badania problemów biologii rozwojowej, w szczególności, może analizować genetycznych mechanizmów inaktywacji chromosomu X lub epigenetycznego niestabilności hESC. Transplantacja ESC we wczesnym stadium zarodkowym jest również wykorzystywana w biotechnologii w rolnictwie, a także w eksperymentach terapii genowej.

Przeszczepy genetycznie zmodyfikowanych ESC są stosowane do testowania docelowych komórek zmutowanych genów. Hodowane ESC in vitro są wykorzystywane w biotechnologii do tworzenia myszy z nokautem. W tym celu, w drodze homologicznej rekombinacji być usunięte z genu RSG badania (odcięcia) i selektywnych pożywkach komórek nie wydzielają tego genu. Następnie ESC znokautowane są wstrzykiwane do blastocysty lub agregowane z blastomórami moruli. Uzyskane w ten sposób chimeryczne wczesne zarodki przeszczepia się samicy biorcy i nowonarodzonych myszy wybrany spośród osób z gamet, nullizigotnymi tego genu. Dzięki tej technologii stworzono wiele linii myszy nokautowych, które są szeroko stosowane w biologii eksperymentalnej i medycynie eksperymentalnej. W tych modelach biologicznych badane wartości niektórych genów w rozwoju embrionalnym, a także ich rolę w mechanizmach chorób i stanów patologicznych u ludzi. Ponadto linie nokautowych zwierząt są wykorzystywane w fazie badań przedklinicznych nowych metod terapii genowej. Na przykład, za pomocą transfekcji genów w ESK normalnego allelu zmutowanego genu udaje się skutecznie skorygowane mutację uderza układu hematopoetycznego. Wprowadzania obcych genów do RSG umożliwia szybkie tworzenie linii homozygotycznych transgenicznych zwierząt laboratoryjnych. Jednak należy zauważyć, że delecja genu techniką rekombinacji skierowany niezawodnie działało jak dotąd jedynie stosunkowo myszy ESC. Stosując mysie ERS podwójnego nokautu zainstalowany funkcjonalną rolę obszaru klastra genów na chromosomie 7 (kopia genomowego regionu chromosomu 19 minut człowieka), a bliższa część chromosomu 11 (kopia ludzki chromosom 5d) - usunięcie tych genów w Myszy ESK pozwoliły na ocenę funkcji ich analogów u ludzi.

Badania funkcji pojemności ludzkich zarodkowych genów transfekcji genem zwierzęta laboratoryjne dopuszczalnych hESC zwłaszcza krypto wyjaśnienia roli genu w zakładce i tworzących gen kardiogenny mezodermy, os-6 - w embriogenezy oka. Stanowi pierwszy ekspresję genów w niedojrzały karty proliferujących ESC potworniaka i blastocysty myszy potwierdził zdecydowaną represje w ESK genów transsignalizatsii. Połączenie zmutowanych RSG 60-80 i 20-30 komórkach normalnych wstępnie implantacji zarodków mysich prowadzi do rozwoju chimerycznych zarodków w którym zakładek ciało zbudowane z komórek dawcy i biorcy, który pozwala nam określić rolę nieznanych genów w gastrulacji i organogenezy. Mapa funkcjonalną genu rozwijających się zarodków mysich powiększonymi szczegółami roli genu karcie SF-1 w nadnerczu i narządów zawiązków, WT-1 gen - w nerkach zakładka MyoD genów rodziny - w karcie szkieletowych rodziny genów mięśni GATA-1-4 - w dojrzewaniu restrykcyjnym podstawy erythro- i limfopoeza.

Skierowany od alleli matczynych i ojcowskich genów w hESC użyciem wektora rekombinazy służył do wyjaśnienia funkcji poszczególnych genów podczas wczesnego embriogenezy i technologii kierowania ludzkich nieznanych genów w RSG myszy przyczynić się do odkrycia nowych genów zmutowanych odpowiedzialnych za rozwój poważnych chorób dziedzicznych. Przy użyciu metody nokaut zdefiniowane bezwzględnym znaczenia pewnych genów do układania embrionalnych: GATA-4 - do mięśnia sercowego, GATA-1 - w przypadku erytrocytów krwiotwórczych, MyoD - tkanki mięśni szkieletowych, brachyury - do ograniczenia mezodermy transkryptaz hnf3 i HNF4 - dla komórki macierzyste wątroby rag-2 - zakładki dla klonów limfocytów T i B (Řepín, 2001). Podwójną delecją genów w hESC otwiera dostęp do analizy funkcjonalnej roli genów zarodkowego warstw, segmentacja i homeoza i przeszczepu ESC ze względu na możliwość uzyskania zarodków żywotnych międzygatunkowych hybryd. Z ulepszonych metod przeszczepiania PGC dawcy na podstawie jednego zarodka 8-ogniwowym udowodnione, że chimeryzacja na poziomie komórkowym wielu narządów zarodka biorcy. Zauważ, że kiełki komórkowe znajdują się w tkankach ludzkich narządach myszy biorców po podaniu ludzkich macierzystych komórek krwiotwórczych do blastocysty. Stwierdzono, że w zarodkach myszy podczas formowania korpusów krwi krążącej hESC pluripotencjalne. Jest możliwe, że ich funkcja biologiczna jest w embrionalnej organizacji przyszłego układu odpornościowego. ESC odtworzone in vitro odpowiednich modeli ludzkich chorób genetycznych: double knockout modele gen dystrofiny u myszy dystrofii mięśniowej Duchenne'a, wyłączenie genu (atm sygnału sterującego synteza kinaz chromatyny) - ataksja-teleangektaziyu. W tym przypadku, śmiertelnych chorób dziedzicznych u dzieci z powodu wad naprawy DNA rozwija degeneracji komórek Purkinjego w móżdżku, która towarzyszy w inwolucję grasicy z powodu śmierci komórek proliferujących. Clinic patofizjologii i patomorfologija ataksja-teleangek- tazii powielane poprzez wprowadzenie do ESC nieprawidłowej informacji genetycznej chimerami od myszy odpowiadają tym u ludzi. Ponadto ataksja-teleangektazii pomocą PGC i myszy z nokautem opracowano model doświadczalny, pewne dziedziczne homozygotycznych ludzkich chorób związanych z zaburzeniami metabolizmu wodorowęglanów i tłuszczy, katabolizmu aminokwasów usuwanie miedzi i bilirubiny, co znacznie zwiększoną możliwość lek eksperymentalny na przedklinicznych badań nowych sposobów leczenia odpowiednich chorób prawa.

[12], [13], [14], [15]

Zastosowanie cytohybrydowego komórek macierzystych

Komórki hybrydowe otrzymywane przez fuzję komórek somatycznych z hESC, są wystarczające i obiecującym modelem do badań nad komórkami macierzystymi pluripotencja i przeprogramowania zróżnicowanych chromosomów komórek. Tsitogibridy uzyskane przez połączenie ESC z zróżnicowanych komórek dorosłego zwierzęcia, zapewniają możliwość zbadania zależności genomach różnych „wiek”: tworzy unikalny sytuacji, w której homologiczne chromosomy pochodzący z komórek różnych stadiach różnicowania i stopnie dojrzałości w tym samym pierścieniu, gdzie można łatwo transdeystvuyuschimi dzielić sygnały regulacyjne. Trudno jest przewidzieć, jak zareaguje tsisregulyatornye epigenetyczne układ chromosomów homologicznych istniejący podczas yn dividual rozwoju, w odpowiedzi na sygnały transdeystvuyuschih wpływ embrionalnych powiązanych genomów. Ponadto, komórki hybrydowe występuje segregacja chromosomów macierzystego, który umożliwia badanie oddziaływania genomów na osobną chromosomie, to potencjalnie określić część konkretnych chromosomów w utrzymaniu pluripotencjalność lub wręcz przeciwnie, wyjście w różnicowaniu.

Jako pierwszy eksperymentalny model do badania interakcji genomów o różnej "historii rozwoju" wykorzystano cytohydrobrydy uzyskane w wyniku fuzji pluripotencjalnego potworniaka i zróżnicowanych komórek somatycznych. W niektórych przypadkach takie hybrydowe komórki zachowały właściwości pluripotencjalne na wystarczająco wysokim poziomie. W szczególności, komórki hybrydoma somatycznego raka somatycznego indukowały rozwój prawdziwych potworniaków zawierających wszystkie trzy listki zarodkowe, a ciałka embrioidalne in vitro utworzono w hodowlach zawiesinowych. Nawet w tego typu międzygatunkowych tsitogibridov zauważyć obecność antygenów płodowych w przypadkach, gdy partnerem somatyczne w połączeniu z komórek potworniaka były limfocyty lub tymocytów. Warto zauważyć, że cyto-hybrydy wytworzone przez fuzję komórek potworniaka z fibroblastami odpowiadały fibroblastom zgodnie z fenotypem.

Najważniejszym z nich jest to, że ustalone, że w-teratokartsinomno somatyczne komórki hybrydowe pojawił podpisuje genomu przeprogramowania zróżnicowanych komórek, charakteryzujący się reaktywację poszczególnych genów lub nieaktywne chromosomu X partnera somatycznej. Tak więc, wyniki badań nad cytohybrydami, takimi jak komórki somatotropowe, wskazują, że komórki hybrydowe często zachowują pluripotencję i występują oznaki przeprogramowania genomu partnera somatycznego.

W doświadczeniach do uzyskania zarodkowych komórek hybrydowych wewnątrzgatunkowych przez fuzję splenocytów zwierząt RSG dorosłych myszy badanych właściwości, takie tsitogibridov, analizy segregacji chromosomów rodzicielskich i oceniano pluripotencja hybrydowy genomu. Dla międzygatunkowych hybryd komórek w wyniku fuzji komórek potworniaka z komórek somatycznych, na ogół charakteryzują się niską segregacji chromosomów z tetraploidalnej lub prawie tetraploidalnej kariotypu. Podobną kompozycję chromosomową obserwowano w cytohybrydach w wyniku fuzji komórek pierwotnych z limfocytami. W tym samym czasie, międzygatunkowe komórki hybrydowe uzyskane w wyniku połączenia komórek potworniaka myszy z limfocytami norki, zaznaczyły intensywną segregację chromosomu partnera somatycznego.

Jakościowo nowy etap badania segregacji chromosomów rodzicielskie w krzyżówkach nastąpiło po rozwoju mikrosatelitarnych metodą analizy z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy, przy czym każdy chromosom myszy znaleziono kilkaset znaczników, dzięki czemu niezawodnie dyskryminuje każdej parze homologicznych chromosomów u hybrydowych komórek.

Przez połączenie ESK (stosując HM-1 w komórkach z niedoborem aktywności gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY wyizolowany ze szczepu blastocysty myszy 129 / 01A) ze splenocytami od myszy kongenicznego linii DD / C nie pojawia się szereg klonów hybrydowych morfologicznie miały podobny do hESC. Wszystkie klony wyizolowano na pożywce selekcyjnej, w której wzrost jest możliwe tylko przy aktywnym gipoksantinfosforiboziltransferazoy komórek. Analiza elektroforetyczna wykazała obecność wszystkich klonach alleliczny wariant gipoksantinfosforiboziltransferazy charakterystyczne myszy DD / C. Za pomocą analizy cytogenetyczne, okazało się, że miał trzy cztery hybrydowe klony okolodiploidny zestaw chromosomów. Jeden prawie tetraploidalny klon zawierał dwie populacje komórek hybrydowych, z których jeden był tetraploidalny, a drugi, mniejszy - diploidalny.

Analiza mikrosatelity pozwalający na rozróżnienie jakiegokolwiek parze homologicznych chromosomów mysz 129 / 01A DD / c w hybrydowych klonów okolodiploidnym zestawu wykazało, że klony wystąpił w dwóch różnych preferencyjne eliminacji autosomami partnera somatycznej. Większość klonów autosomalne HESS2 i HESS3 miał markery linii 129 / 01A, czyli pluripotencjalne partnera. Wyjątek chromosomu 1 i I: klony HESS2 i HESS3 wraz ze znacznikami HM-1 komórek niewielkiej liczby markerów obecnym tam partnerem somatycznej. Wyniki te mogą odzwierciedlać niepełne segregacji chromosomów 1 i i partnera somatycznych i są zgodne z danymi cytogenetycznych że trisomia chromosomów, która występuje w 30-40% HESS2 i klonów komórek HESS3. HESS4 klon różni się znacznie w składzie chromosomalnym: wielu autosomami Klon ten pochodzi z genomu ESK (chromosomy 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 i 17), ale chromosomy 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 i 19 byli reprezentowani przez homologi obojga rodziców. Ilościowy stosunek mikrosatelitów znakujących te homologiczne chromosomy odpowiadał w przybliżeniu 1: 1. Pozwoliło to autorzy sugerują, że jeden homolog pochodzi z genomu ESC, a drugi - od zróżnicowanych komórek. W niektórych subklonów klonu HESS4 obserwowano jedynie symboliczną obecność chromosomów 18 i 19 somatycznej partnera. Uzyskane wyniki wskazują, że komórki sklonować HESS4, w uzupełnieniu do segregacji chromosomów partnerskiego somatyczny, było wyeliminowanie jednej lub obu homologi wyżej chromosomu pluripotencjalne genomu, czyli był dwustronny segregacja chromosomów obojga rodziców - zjawisko jest dość nietypowa, bo tsitogibridov charakterystyczny segregacja chromosomów tylko jeden z rodziców.

Ponadto, po 20 pasażu, wszystkie klony komórek hybrydowych zawierają tylko markerów chromosomu X partnera somatycznej, czyli w klonach została zastąpiona chromosomu X ESC na chromosomie X partnera somatycznej. Potwierdzają to dane hybrydyzacji in situ przy użyciu sondy znakowanej FITC specyficznej dla mysiego chromosomu X: pozytywny sygnał został wykryty tylko na jednym chromosomie. Należy zauważyć, że na wcześniejszych etapach hodowli (do 15 pasażu), zgodnie z danymi cytogenetycznymi, w wielu komórkach były dwa chromosomy X. W związku z tym zastosowanie selektywnych pożywek umożliwia manipulowanie składem chromosomowym komórek hybrydowych i selektywne celowanie w klony niosące pojedyncze chromosomy partnera somatycznego na tle genomu ESC.

Jako unikalną cechą tsitogibridov genomu umiejscowienie genomów rodzicielskich pojedynczym rdzeniem oczywiście podnosi kwestię zachowaniu właściwości pluripotencjalnych genomu ESC somatycznych hybryd komórek w warunkach, w bliskim kontakcie z genomem zróżnicowanych komórek. Morfologicznie cytohybryd ESC i komórek somatycznych przypominał linię rodzicielską ESC. Kwalifikacja pluripotencja wykazała, że wszystkie klony okolodiploidnym zestaw chromosomów są w stanie utworzyć w kulturach zawiesinowych ciał embrioidalnych w których pochodne trzech listków zarodkowych obecne.

Większość komórek hybrydowych zawierała antygen ECMA-7, marker charakterystyczny dla wczesnych zarodków myszy, a także wykazywał wysoką aktywność fosfatazy alkalicznej. Najbardziej przekonujące dane na temat wysokich właściwości pluripotentnych komórek hybrydowych uzyskano w doświadczeniach w celu uzyskania serii chimer iniekcyjnych z udziałem komórek hybrydowych klonu HESS2. Analiza markerów biochemicznych wykazała, że potomstwo komórek hybryd dawcy znaleziono w większości tkanek chimery. W związku z tym komórki hybrydowe uzyskane przez fuzję ESC i komórek zróżnicowanych somatycznie zachowują pluripotencję na wysokim poziomie, w tym zdolność do tworzenia chimer w momencie wprowadzenia do jamy blastocysty.

Klony HESS2 i HESS4 różniły się znacznie składem chromosomów macierzystych, ale miały podobne właściwości pluripotencjalne. Można sądzić, że pluripotencja w genomie hybrydowym przejawia się jako cecha dominująca, ale możliwe jest, że nie wszystkie chromosomy zarodkowego genomu są zaangażowane w proces zachowywania pluripotencji. Jeżeli to założenie jest prawidłowe, można oczekiwać, że eliminacji niektórych chromosomów pluripotencjalnego partnera z genomu hybrydomy nie towarzyszyć będzie zmiana ich statusu pluripotencjalnego. W tym przypadku analiza segregacji chromosomów rodzicielskich w embrionalnych komórkach hybrydowych pozwoliłaby na ścisłe podejście do identyfikacji chromosomów odpowiedzialnych za kontrolowanie pluripotencji komórek embrionalnych.

O. Serow i współautorzy (2001) nie znaleźli się wśród 50 potomków uzyskanych przez krzyżowanie chimer z normalnymi myszami, tak jak mieliby genotyp myszy 129 / 01a i niosący chromosom X myszy DD. Autorzy widzą przyczynę tego zjawiska w redukcji pluripotencji w komórkach hybrydowych pod wpływem genomu somatycznego. Alternatywnym wyjaśnieniem może być negatywny wpływ trisomii na niektóre autosomy i zaburzenia równowagi w chromosomach płciowych (XXY obserwowano w komórkach do 15 pasażu) w komórkach hybrydowych po przejściu mejozy. Wiadomo, że komórki XXY nie mogą przechodzić przez mejozę i tworzyć gamety. Trisomia może również powodować obniżenie aktywności proliferacyjnej komórek hybrydowych, w wyniku czego selektywna przewaga w rozwoju chimer może należeć do komórek biorcy zarodka. Wynika z tego, że aby odpowiednio ocenić pluripotentny potencjał komórek hybrydowych, konieczne jest uzyskanie klonów hybrydowych o normalnym diploidalnym zestawie chromosomów.

W doświadczeniach Serova O. I inni (2001), pierwszy wykazano możliwość przeprogramowanie chromosomu X w genomie komórek somatycznych hybryd komórek. Wniosek ten wynika z autorzy analizy ekspresji genu HPRT chimer (marker chromosomu X) występowanie wariantów allelicznych HPRT DD / c myszy wykryto we wszystkich analizowanych tkankach chimeryczna. Należy podkreślić, że po wprowadzeniu komórek hybrydowych w jamie blastocysty tsitogibridy wchodzą w warunkach nieselektywnych, a zachowanie chromosomu X w genomie komórki hybrydowe oznacza, że staje się obligatoryjnym składnikiem swoim genomie i nie odróżnienia go od partnera chromosom pluripotencjalnych Y.

Podsumowując wyniki analizy interakcji genomów somatycznych i pluripotencjalnych w hybrydowych komórkach embrionalnych autorzy wyciągnęli wniosek, że w niektórych cytohybrydach pluripotencja przejawia się jako cecha dominująca. Hybrydowy genom jest zdolny do przeprogramowania poszczególnych chromosomów zróżnicowanych komórek, co jednak nie wyklucza możliwości odwrotnego działania somatycznego genomu na pluripotencję zarodkowego genomu. W hodowli komórek hybrydowych indukcja różnicowania występuje znacznie częściej niż w pierwotnej linii rodzicielskiej ESC NM-1. Podobny efekt obserwuje się w tworzeniu pierwotnych kolonii: wiele pierwotnych kolonii embrionalnych komórek hybrydowych różnicuje we wczesnych stadiach powstawania z dużymi stratami klonów podczas ich selekcji i namnażania.

Zatem cytohybidy wytworzone przez fuzję ESC z komórkami somatycznymi, pomimo bliskiego kontaktu z genomem zróżnicowanych komórek, zachowują pluripotencję jako unikalną właściwość zarodkowego genomu. Ponadto w takich komórkach hybrydowych możliwe jest przeprogramowanie poszczególnych chromosomów pochodzących z rozproszonych komórek. Nie jest jasne, w jakim stopniu pluripotencjalne właściwości zarodkowego genomu w komórkach hybrydowych utrzymują się, w szczególności, ich zdolność do uczestniczenia w tworzeniu ścieżki embrionalnej w chimerach. W tym celu konieczne jest uzyskanie embrionalnych komórek hybrydowych o prawidłowym kariotypie. W każdym przypadku, pluripotencjalne komórki embrionalne hybrydowe może być prawdziwym wzorem dla identyfikacji genetycznej chromosomów zaangażowanych w utrzymanie pluripotencji lub jej kontroli jako dwustronna segregacja chromosomów rodzicielskich potencjalnie zapewnia taką możliwość.

Nie mniej atrakcyjne jest badanie zjawiska, które O. Serow i współautorzy (2001) definiują jako "pamięć chromosomalną". W genomie hybrydowym, homologiczne chromosomy są w dwóch alternatywnych konfiguracjach: homologi partnera somatycznego zostały kiedyś zróżnicowane, podczas gdy w pluripotentnych homologach partnera, proces ten dopiero się rozpoczyna. W związku z tym, przy zachowaniu dobrych właściwości pluripotencjalnych komórek hybrydowych, oznacza, że „pluripotencjalne” homologi konfiguracji ESC stosunkowo stabilny w genomie hybrydowych pomimo wpływu czynników transdeystvuyuschih pochodzących od partnera somatycznej. Opisane powyżej cechy przeprogramowania zróżnicowane chromosomach homologicznych genomu w trakcie rozwoju chimer nie wyklucza możliwości, że pierwszy etap tworzenia się in vitro i hodowaniu tsitogibridov zachowują swój stan zdobytą podczas różnicowania in vivo. Według ostatnich danych po przeniesieniu embrionalnych komórek hybrydowych w nieselektywnej pożywce, w której znajduje się tylko intensywne chromosomy eliminacji partnerem somatycznych, to genom komórki hybrydowe łatwo rozróżnia homologi po hodowli in vitro do 10-15 pasaży. Tak więc embrionalne komórki hybrydowe stanowią obiecujący eksperymentalny model do badania nie tylko tak fundamentalnej właściwości zarodkowego genomu, jak pluripotencja, ale także jej alternatywy - różnicowanie embrionalne.

Skuteczność terapeutyczna przeszczepu zarodkowych komórek macierzystych

Przed analizą skuteczności terapeutycznej przeszczepienia ESC i ich pochodnych, podsumowujemy powyższy materiał. Cechy ESC w warunkach pełnego wprowadzenia embriogenezy in vitro są niewystarczające z powodu wad, w tym przypadku, ze względu na brak mezenchymalnych komórek macierzystych, które nie występują w korpusie samodzielnie i niezależnie od hESC. Genetyczna moc ESC jest mniejsza niż potencjał genetyczny zygoty, dlatego nie jest bezpośrednio używana do klonowania zarodków. Unikalny potencjał biologiczny ESC jako jedynych komórek, w których programy rozwojowe są wdrażane w pełnej sekwencyjnej realizacji, znajduje zastosowanie w badaniach nad funkcją genów. Za pomocą ESC rozszyfrowano pierwsze kombinacje sygnałów aktywujących ekspresję wczesnych i późnych genów kodujących rozwój trzech warstw embrionalnych. Zachowania genomu pluripotencja ERS in vitro czyni je wyjątkowym narzędziem do naprawy regeneracji, który może automatycznie zrekompensowania strat komórek uszkodzonych narządów i tkanek. W idealnym hipotetycznym przykładzie wykonania można zakładać, że „... W transplantacji PGC dawcy w organizmie biorcy są przenoszone kompaktowo spakowane programy, które w sprzyjających warunkach są realizowane w budowie nowego tkani'7 zdolnego” ... Skutecznie zintegrowany organizm biorcy jako morfologiczne, zarówno funkcjonalne, jak i funkcjonalne. "

Naturalnie, po opracowaniu metod monodróżnicowania ESC, rozpoczęło się badanie in vivo aktywności funkcjonalnej komórek uzyskanych in vitro z pojedynczego wyspecjalizowanego klonu. Rozrastający się klon ESO generuje populacje migrujących komórek progenitorowych, które są naprawdę zdolne do aktywnej integracji w strefach uszkodzenia tkanki biorcy, która jest wykorzystywana w medycynie regeneratywno-plastycznej. Ustalono, że transplantacja Dopa-neuronów w istocie czarnej redukuje objawy kliniczne w doświadczalnym hemiparkinsonianism. Regionalne przeszczepy neuronalnych komórek macierzystych dawcy zmniejszają stopień zaburzeń motorycznych spowodowanych urazem lub stłuczeniem rdzenia kręgowego i mózgu. Otrzymano i pierwsze pozytywne wyniki przeszczepu komórek macierzystych w chorobach demielinizacyjnych. Wydawać by się mogło, że regeneracyjne plastyczne siły ESC otwierają nieograniczone możliwości zastosowania transplantacji komórkowej w praktycznej medycynie. Jednak podczas przesadzania do stref ektopowych, ESC nieuchronnie przekształcają się w nowotwory. Po podskórnym wstrzyknięciu ESC u myszy z niedoborem odporności powstają potworniaki. Gdy zawiesina ESK zostaje przeszczepiona pod kapsułą jądra u syngenicznych myszy, powstaje również potworniak, składający się z różnych tkanek, których komórki pochodzą od wszystkich trzech zarodkowych płatków. W takich potworach procesy zmniejszonej organogenezy są niezwykle rzadkie.

Wiele prac dostarcza informacji na temat pozytywnych wyników transplantacji wczesnych pochodnych ESCO zwierzętom z patologią ex-percepcyjną. Neurotransplantation komórek przy użyciu pochodnych PGC jest rozwinięty w doświadczeniu oraz pierwszych badań klinicznych korekcji zaburzeń funkcji mózgu i rdzenia kręgowego, leczenie jamistości i stwardnienie rozsiane (Repin, 2001). Wraz z nadejściem technologii RSG neyronogeneza in vitro, a nie za pomocą zarodków i tkanki mózgu technik przeszczepu opracowanych pochodnych neurosfery, otrzymane z hodowli zarodka tkanki nerwowej. Takie zawiesiny do transplantacji są znacznie bardziej jednorodne i zawierają zaangażowane prekursory neuronalne i neurogli- nowe.

Oprócz zwykłej pożywce hodowlanej kwas retinowy w dawce 10 ug / ml przez 6 tygodni w linii zarodkowych (potworniaki) NTERA-2 ludzkiej -kartsinomy tworzą ponad 80% post-mitotycznymi neuronów. Kompletny jednorodność populacji neuronów uzyskuje się poprzez przepływ sortowania oznakowanych immunofenotypowych markerów dojrzałych neuronów, które mogą pozbyć się resztek teratokartsinomnyh i komórek niedojrzałych. Po transplantacji do różnych obszarów mózgu zwierząt doświadczalnych takie neurony nie tylko przeżywają, ale także są wbudowane w regionalne sieci neuronowe. U zwierząt doświadczalnych modelach lokalnych uszkodzeń OUN neurotransplantation zmniejsza objawy kliniczne patologii człowieka, takich jak uraz czaszkowo efektów, udaru, chorób demielinizacyjnych, dziedziczny móżdżku wad rozwojowych, choroby odkładanie lipidów i polisacharydów.

Aby zoptymalizować procesy regeneracji w chorobach zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego, opracowywane są technologie przygotowania oligodendrocytów wytwarzających mielinę z ESK. Pierwszy etap tradycyjnie obejmuje proliferację ESC wraz z rozmnażaniem liczby komórek koniecznych do przeszczepienia. W drugim etapie przeprowadza się ukierunkowane różnicowanie komórek w populację prekursorów oligodendrocytu produkujących mielinę, która jest kontrolowana przez selektywne antygeny markerowe.

Niektóre perspektywy są otwarte na stosowanie pochodnych RSG opracowanie metod korygowania odporności spowodowanego przez defekty genetyczne w dojrzewania grasicy. W badaniach z nokautem (rag 1) u myszy z wywołaną defektem genu - naruszenie mechanizm rekombinację V (D) genu J loci TCR, co prowadzi do utraty funkcji limfocytów T, po przeszczepieniu początku pochodne PGC grasicy zwierzę odzyskuje dojrzewanie normalnej populacji klonów odpornościowe odpowiedzialne za odporność komórkowa. Badania kliniczne transplantacji formowane w hESC vitro w leczeniu anemii krytyczny dziedziczne u dzieci.

Zastrzeżenia do szybkiego wprowadzenia do kliniki przeszczepu komórek macierzystych są uzasadnione ograniczoną liczbą stabilnych linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych i potrzebą ich standaryzacji. Aby zwiększyć czystość wystandaryzowanych linii ESC, jak również dorosłych komórek macierzystych, proponuje się zastosowanie metody selekcji linii w oparciu o analizę genetyczną molekuł krótkich powtórzeń tandemowych DNA. Konieczne jest również przetestowanie linii ESC pod kątem obecności małych rearanżacji chromosomowych i mutacji genetycznych, a potencjalna możliwość ich wystąpienia w warunkach hodowli komórek jest wystarczająco wysoka. Teza rozciąga obowiązkowe testowanie właściwości wszystkich rodzajów PGC i regionalnych pluripotencjalne komórki macierzyste, ponieważ ich rozmnażanie in vitro może prowadzić do nowych cech nie związanych w embrionalnych komórkach macierzystych trwale lub tkanek. W szczególności, zakłada się, że długoterminowe uprawy w mediach cytokin Hess bliżej do komórek nowotworowych, ponieważ występują zmiany ścieżki podobne regulujące cykl komórkowy z nabycia zdolności do implementacji dowolnej liczby podziałów komórkowych. Niektórzy autorzy, na podstawie możliwości rozwoju nowotworów, uważają ludzką transplantację wczesnych pochodnych zarodkowych komórek macierzystych za lekkomyślność. Ich zdaniem znacznie bezpieczniejsze jest korzystanie z zaangażowanych potomków ESC, czyli linii przodków zróżnicowanych komórek. Jednak nie opracowano jeszcze niezawodnej techniki otrzymywania stabilnych ludzkich linii komórkowych, które różnicują we właściwym kierunku.

Tak więc w literaturze pojawia się coraz więcej danych na temat pozytywnego efektu terapeutycznego transplantacji ludzkich pochodnych zarodkowych komórek macierzystych. Jednak wiele z tych prac podlega rewizji i krytyce. Niektórzy badacze uważają, że wyniki wczesnych badań klinicznych mają charakter wstępny i sugerują jedynie, że komórki macierzyste mogą mieć korzystny wpływ na przebieg kliniczny choroby. Dlatego konieczne jest uzyskanie danych na temat długoterminowych wyników transplantacji komórek. Jako argument podano etapy rozwoju neurotransplantologii klinicznej. Rzeczywiście, w literaturze, początkowo zdominowany przez publikację wysokiej sprawności transplantacji mózgu fragmentów zarodków w chorobie Parkinsona, ale potem zaczęły się pojawiać raporty zaprzeczającemu skuteczność terapeutyczną zarodka lub płodu tkanki nerwowej przeszczepione do mózgów pacjentów.

Prowadzony Pierwsze próby kliniczne oceny bezpieczeństwa transplantacji Neuroblast - pochodnych PGC NTERA-2, potworniaka, niedojrzałe komórki, które proliferują w hodowli poddano przechowywania 100 masy komórek milionowa. Niektóre z otrzymanych w ten sposób komórek zastosowano do scharakteryzowania fenotypu i określenia zanieczyszczeń komórkowych, a także do zbadania możliwości zanieczyszczenia przez wirusy i bakterie. Z pożywki hodowlanej usuwa się LIF i warstwę odżywiającą komórek zrębowych i płodu utworzonych warunków skierowanej różnicowania hESC w neuroblastów z kombinacją cytokin i czynników wzrostu. Następnie neuroblasty oczyszczono z niedojrzałych komórek potworniaka na sorterze klatek przepływowych. Po drugim oczyszczaniu i scharakteryzowania fenotypu przeszczepionych komórek neuroblastów (10-12 milionów) zawieszenia za pomocą specjalnej strzykawki i microcannulas stereotaktycznie i pod kontrolą CT wtryskiwany do basalis jądro mózgu pacjentów (siódmym miesiącu po udarze krwotocznym). Po przeszczepie roczne badanie przesiewowe neuronalnych przeszczepów w strefie udaru nie wykazało skutków ubocznych i niepożądanych skutków. Połowa pacjentów odczuwała poprawę czynności motorycznych w okresie od 6 do 12 miesięcy po transplantacji. Korzystne zmiany kliniczne towarzyszy wzrost dopływu krwi strefie ruchu po przeszczepie komórek: średni wzrost absorpcji znakowanych fluorescencyjnie 2-deoksyglukoza, zgodnie pozytronowej tomografii emisyjnej wyniosła 18%, a u niektórych pacjentów - 35%.

Jednak amerykański Narodowy Instytut Zdrowia przeprowadził niezależne badanie klinicznej skuteczności neurotransplantacji u pacjentów z parkinsonizmem. Pacjenci z pierwszej grupy zostali przeszczepieni za pomocą zarodkowej tkanki nerwowej produkującej dopaminę, podczas gdy druga grupa pacjentów przechodziła fałszywą operację. Wyniki wskazują na zerową kliniczną skuteczność takiego neurotransplantacji, pomimo faktu, że neurony embrionalne wytwarzające dopaminę przetrwały w mózgu biorców. Ponadto, po 2 lata po transplantacji płodowej tkanki nerwowej u 15% pacjentów rozwinęła trwałe dyskinezy, który jest nieobecny u pacjentów w grupie placebo (komórki macierzyste: postęp naukowy i przyszłych kierunków badań, z Nat Inst Zdrowia USA ...). Kontynuowane są obserwacje dalszego rozwoju choroby u tych pacjentów.

Niektórzy autorzy przypisują sprzeczne literatury na temat oceny danych klinicznych skuteczność Neurotransplantation z innego podejścia do wyboru pacjentów grup nieodpowiedniego doboru obiektywnymi metodami oceny ich stanu i, co ważniejsze, różne warunki rozwoju płodowej tkanki nerwowej i w różnych częściach mózgu, z których materiał został wytwarzane w różnych rozmiarach przeszczep i metodyczne cechy chirurgii.

Należy zwrócić uwagę, że próby kierowania transplantacji pluripotencjalnych komórek macierzystych w regionie prążkowia mózgu szczura z eksperymentalnym gemiparkinsonizmom ciała towarzyszyła proliferacji ESC i ich różnicowanie neuronów dopaminergicznych. Należy przypuszczać, że nowo powstałe neurony skutecznie wbudowane w sieci neuronowej jako ERS po przeszczepie zaobserwowano korektę anomalii zachowań i asymetrii silnika w teście apomorfiny. W tym samym czasie niektóre zwierzęta zmarły z powodu transformacji przeszczepionego ESK w guzie mózgu.

Eksperci amerykańskiej Narodowej Akademii Medycznej, specjaliści z National Institutes of Health uwierzyć, że potencjał kliniczny hESC zasługuje na szczególną uwagę, jednak kładą nacisk na konieczność szczegółowej analizy ich właściwości, prawdopodobieństwo wystąpienia powikłań i efektów długoterminowych w eksperymentach z odpowiednich modeli biologicznych chorób człowieka (komórki macierzyste i przyszła medycyna regeneracyjna National Academy Press, komórki macierzyste i przyszłe kierunki badań., Nat. Inst, of Health USA).

Z tego punktu widzenia jest ważne, że porównawcza analiza histologiczna potworniaka uzyskanych w wyniku przeszczepienia w jądrowych PGC w zawiesinie z potworniakami, które rozwinęły się w wyniku przeszczepu wczesnego zarodka, które znajdują się również obecne ESC ESK wykazały, że bez względu na ich pochodzenie lub interakcji z przez te lub inne otaczające komórki w ten sam sposób, realizując ich potencjały rakotwórcze. Okazało się, że takie potworniaki mają pochodzenia klonalnego, jak z RSG guza może wystąpić, składający się z pochodnych wszystkich trzech listków zarodkowych (.Rega, 2001). Warto zauważyć, że gdy przeszczepione myszom z niedoborem odporności klonowanych PGC z normalnym kariotyp utworzonych potworniakami składający się z różnych rodzajów zróżnicowanych komórek somatycznych. Te dane eksperymentalne są doskonałym dowodem na klonalne pochodzenie teratii. Z punktu widzenia biologii rozwojowej, sugerują, że nie jest wielokrotnością liczby zaangażowanych komórek progenitorowych i pluripotencjalne tożsamości komórek macierzystych jest źródłem zróżnicowanych pochodnych wszystkich trzech listków zarodkowych, komponentów potworniak. Jednak w praktycznym Wyniki przeszczepiania komórek tych badań są, jeśli nie wygórowane, a następnie znak ostrzegawczy o potencjalnym niebezpieczeństwie, ponieważ zaszczepiania ESC lub pierwotnych komórek rozrodczych w różnych tkankach dorosłych myszy z niedoborem odporności nieuchronnie powoduje rozwój nowotworów z przeszczepionych komórek macierzystych. Nowotworowa zwyrodnienie ektopicznie przeszczepione ESC wraz z pojawieniem się populacji zróżnicowanych komórek satelitarnych - przez częściowo odróżnić pewnością ERS i klony progenitorowych dedykowane linie. Co ciekawe, podczas przeszczepiania ESC do mięśni szkieletowych obok komórek potworniaka najczęściej powstają neurony. Jednak wprowadzeniu ESC do zmiażdżonej komórki jajowej lub blastocysty towarzyszy całkowita integracja komórek w zarodku bez tworzenia się elementów nowotworowych. W tym przypadku ESC są wbudowane w prawie wszystkie narządy i tkanki zarodka, w tym w rudymenty seksualne. Takie zwierzęta allogeniczne uzyskano najpierw przez wprowadzenie komórek gruczolakoraka złośliwego 129 do wczesnych zarodków w etapach 8-100 komórek. W allofennyh geterogenomnyh populacji myszy pochodzący z komórek PGC dawcy są wprowadzane do szpiku kostnego, skóry, jelit, wątroby i narządów płciowych, które pozwala na tworzenie w tym doświadczeniu nawet chimer międzygatunkowych komórek. Im mniejszy jest czas wczesnego zarodka, tym wyższy procent chimeryzacja komórek, chimeryzacja najwyższym stopniu obserwowany na układ krwiotwórczy, skóry, układu nerwowego, wątroby i jelita cienkiego allofennogo zarodka. W organizmie dorosłego chronić tkanki podatne chimeryzacja z ekspozycją na układ odpornościowy biorcy gistogematicalkie barier: transplantacji Pierwotne komórki rozrodcze w miąższu jądra wraz wkładania dawców komórek macierzystych w warstwie przyjmujący tkanki germenativny. Jednakże ESC transplantacji formowania blastocyst chimerycznych zawiązków genitaliów donora pokolenie komórek pierwotnych zarodków nie występuje. ESC pluripotencja podczas tworzenia szczególnych warunków może być stosowany do klonowania: myszy z przeszczepami ESC 8-16 komórek mysiego zarodka mitozy komórek którym tsitokalazinom zablokowanym, przyczynia się do prawidłowej embriogenezy z rozwoju zarodka PGC dawcy.

W związku z tym, jako alternatywa jest przeszczepienie allogenicznych ESC terapeutycznego klonowania w oparciu o komórki somatyczne przeszczepu jądrowego w wyłuszczonego komórki jajowej w celu utworzenia komórkowej masy blastocysty wewnętrzny, z którego następnie rozdzielana linii genetycznie identycznych PGC dawcy jądra somatycznej. Technicznie rzecz biorąc, ten pomysł jest wykonalne, ponieważ możliwość tworzenia linii hESC z blastocysty uzyskane po transplantacji jąder somatycznych język wyłuszczono komórki jajowej wielokrotnie udowodnił w eksperymentach na zwierzętach laboratoryjnych (Nagy, 1990; Munsie, 2000). W szczególności u myszy homozygotycznych pod względem mutacji rag2 fibroblastów uzyskano przez hodowlę komórek tkanki podnaskórkowych użyto jako zarodki dawcy przeszczepia się do pozbawionych jąder oocytów. Po aktywacji oocytów „zygoty” hoduje się aż do utworzenia się blastocysty, od wewnętrznej masy komórkowej jest izolowany PGC i przekazywanie ich do linii komórek zmutowanego genu nullizigotnyh (rag2 ~ / ~). W wyniku rekombinacji homologicznej w takich ESC mutacja jednego genu allelowego została skorygowana. W pierwszej serii eksperymentów z hESC rekombinowany gen odzyskać ciała embrionalne wytworzono transfekowane komórki korpusu z rekombinowanego retrowirusa (HoxB4i / GFP) i po propagacji myszy, którym wstrzyknięto żyły rag2 ~ / ~. W drugiej serii tetraploidalne blastomery agregowano z genetycznie modyfikowanymi ESC i przeszczepiano ich biorcom. Urodzone immunokompetentne myszy służyły jako dawcy szpiku kostnego do transplantacji mutantom myszy rag2 ~ / ~. W obu seriach, wynik był dodatni: 3-4 tygodni u wszystkich myszy prawidłowych dojrzałych komórek mieloidalnych i limfoidalnych, stwierdzono zdolne do wytwarzania immunoglobulin. W ten sposób przeszczep do jądra komórki jajowej komórki somatyczne mogą być wykorzystywane nie tylko w celu wytworzenia linii hESC, ale także tsitogenoterapii - korekcja dziedzicznych zaburzeń wykorzystaniem ESC jako wektor do przenoszenia korekcji informacji genetycznej. Ale w tym kierunku transplantacji komórek, oprócz problemów bioetycznych, istnieją ograniczenia. Nie jest jasne, w jaki sposób bezpieczny przeszczep będzie terapeutycznie sklonowane komórki z genotypem identycznym genotypie danego pacjenta, ponieważ takie komórki można wprowadzać mutacje, które tworzą predyspozycje do pewnych chorób. Zwykłe jajka człowieka pozostają niedostępne obiektu, natomiast nawet po transplantacji jąder somatycznych język wyłuszczono komórki jajowej zwierząt tylko 15-25% inżynierii „zygota” rozwoju do stadium blastocysty. Nie określa się, ile blastocysty jest wymagane do uzyskania pojedynczej linii pluripotencjalnych sklonowanych ESC. Należy zauważyć i wysoki poziom kosztów finansowych związanych ze złożonością metodologii klonowania terapeutycznego.

Podsumowując, w pluripotencja genomu ESC hipometylowane DNA w połączeniu z wysoką aktywnością telomerazy i krótkiej fazie cyklu komórkowego C ^, która zapewnia intensywny i potencjalnie nieskończonej mnożenia, w którym PGC zatrzymywania diploidalnych chromosomów i „młodzieńczą” zestaw cech fenotypowych. Klonów wzrost PGC w kulturze nie wyklucza je różnicować się w każdej wyspecjalizowanej komórki organizmu na proliferację linii zatrzymania i dodanie odpowiednich sygnałów regulacyjnych. Zróżnicowanie ograniczenie hESC w linii w komórce somatycznej in vitro odbywa się bez udziału mezenchymy pominięciem Nohteyaov jest organogenezy i bez tworzenia się zarodków. Ektopowe podawanie ESC in vivo nieuchronnie prowadzi do tworzenia się potworniaków. ESC przeszczep do blastocysty lub wczesnym embrionie towarzyszy ich integrację z tkankami zarodka i jego organów chimeryzacja stabilnych.

Technologie regeneracyjne i tworzyw sztucznych w oparciu o przeszczepie komórek jest punktem przecięcia interesów członków biologii komórki, genetyki, biologii rozwojowej eksperymentalnych, immunologii, neurologii, kardiologii, hematologii i wielu innych dziedzinach medycyny eksperymentalnej i praktycznej. Najważniejsze wyniki doświadczalne potwierdzają możliwość przeprogramowania komórek macierzystych z kierunkiem zmiany ich właściwości, co stwarza perspektywy dla kontroli procesów cytodifferentiation czynniki wzrostu - zawału regeneracji, przywrócenia uszkodzeń CNS i normalizacja funkcji urządzenia wysepek trzustki. Jednakże, powszechne POCHODNE Transplantation wprowadzenie ESC w medycynie jest konieczne w celu zbadania właściwości ludzkich komórek macierzystych bardziej szczegółowo dalsze doświadczenia z PGC w doświadczalnych modelach chorób.

Bioetyczne problemy i problem odrzucenie allogenicznego przeszczepu komórek może rozwiązać obserwowany plastyczność genomu regionalnych dorosłych komórek macierzystych. Jednak początkowa informacja jest taka, że po transplantacji wątroby wyizolowane i scharakteryzowane dokładnie autologicznych komórek krwiotwórczych, które pojawiają się nowe hepatocyty, uwzględniającej w zrazików wątrobowych, są obecnie poddawane przeglądowi i krytykowana. Jednakże, opublikowane dane, że przeszczep komórek nerwowych macierzystych w grasicy jest tworzenie nowych pędów T dawcy i B-limfocyty i przeszczepianie komórek nerwowych macierzystych do mózgu w szpiku kostnego prowadzi do tworzenia się krwiotwórczych zarodkowej przedłużonym dawcy komórek mieloidalnych i erytropoezy . W konsekwencji, w narządach dorosłych mogą być zachowane pluripotencjalne komórki macierzyste zdolne do genomu przeprogramowanie ESC do pojemności.

Ludzki zarodek pozostaje źródłem otrzymania ESC do celów medycznych, co predestynuje nieuchronność nowego przecięcia problemów moralnych, etycznych, moralnych, prawnych i religijnych w momencie narodzin ludzkiego życia. Odkrycie ESC dało potężny impuls do wznowienia ostrych dyskusji o tym, gdzie leży granica między żywymi komórkami a materią, substancją i osobowością. Jednocześnie nie ma uniwersalnych norm, zasad i praw dotyczących stosowania ESC w medycynie, pomimo wielokrotnych prób ich tworzenia i akceptowania. Każde państwo w ramach swojego ustawodawstwa samodzielnie rozwiązuje ten problem. Ze swojej strony lekarze z całego świata nadal próbują rozwijać regeneracyjną medycynę plastyczną poza takimi dyskusjami, głównie poprzez wykorzystanie nie zarodkowych komórek macierzystych i rezerwy komórek macierzystych dorosłego organizmu.

Niektóre z historii izolacji embrionalnych komórek macierzystych

Terato- (zarodkowe) były izolowane z -kartsinomnye spontanicznie występujących jąder szczep potworniaki MOUSE 129 / tert-SV, spontaniczne jajnika linii potworniaki myszy Lt / SV oraz potworniakami, ektopichno źródło przeszczepiono komórki lub tkankę zarodkową. Wśród otrzymanych w ten sposób terato- stabilnych linii myszy (zarodków) -kartsinomnyh niektóre komórki są pluripotencjalne, a inne poddano różnicowaniu jedynie w komórkach jednego rodzaju, a niektóre z nich zostały zasadniczo niezdolna cytodifferentiation.

W tym czasie, nacisk badania wykazały, że ewentualne terato- zwrotny (zarodków) -kartsinomnyh komórek do normalnego fenotypu po ich wprowadzeniu w tkankach rozwijających się zarodków, jak i pracy, aby utworzyć in vitro genetycznie zmodyfikowanej terato- (zarodków) -kartsinomnyh komórki, za pomocą których uzyskano zmutowane myszy do biologicznego modelowania ludzkiej patologii dziedzicznej.

Wyizolować terato- linii (zarodków) został użyty w klimatyzacji zawieszenia -kartsinomnyh hodowli komórkowej. W terato- hodowli (zarodków) -kartsinomnye komórki podobnie jak ESC wzrost z wytworzeniem ciał embrioidalnych i wymagają translacji na linii dysocjacji wiązania utrzymując pluripotencja na warstwie odżywczej fibroblastów embrionów lub zawieszenie hodowli kondycjonowanych mediach. Terato- komórek pluripotencjalnych (zarodkowe) - linii komórkowej raka duże, sferyczne, mają wysoką aktywność fosfatazy alkalicznej, agregaty formy i są zdolne do wielokierunkowego różnicowania się. Po wprowadzeniu do blastocysty są łączone z morulae, co prowadzi do tworzenia się zarodków chimerycznych, w różnych narządach i tkankach pochodne znajdują terato- (komórki -kartsinomnyh zarodków). Jednak zdecydowana większość takich chimerycznych zarodków umiera w okresie życia płodowego, a żyjący w narządach chimer nowonarodzonych komórek obcych i rzadko wykrywane o niskiej gęstości. Jednocześnie występowanie nowotworów (włókniakomięsaka, mięśniakomięsaka prążkowanego, i inne typy nowotworów złośliwych obrzęk i gruczolaka trzustki) gwałtownie rośnie, jak i nowotworowych degeneracji często występuje nawet w macicy chimerycznych zarodków.

Większość komórek teratogennego zarodka w mikrośrodowisku normalnych komórek embrionalnych prawie w sposób naturalny nabywa złośliwe cechy nowotworowe. Uważa się, że nieodwracalna złośliwość wynika z aktywacji protoonkogenów w procesie strukturalnych rearanżacji. Wyjątkiem są linie komórkowe embriokartsinomnoy SST3, potworniak pochodzący z mysiego jąder (linia 129 / Sv-ter), które wykazują wysoką zdolność do integrowania się do tkanek i narządów płodu bez późniejszego tworzenia nowotworów u chimerycznych myszy. Pochodne linii komórek teratyczno-zarodkowych u myszy chimerycznych praktycznie nie uczestniczą w tworzeniu pierwotnych gonocytów. Oczywiście, jest to związane z wysoką częstością występowania aberracji chromosomowych wspólnych dla większości terato- (zarodków) -kartsinomnyh linii komórek, w których obserwowano aneuploidii lub chromosomowego anomalii.

W laboratorium uzyskano kilka stabilnych linii ludzkich terato-zarodkowych nowotworów, charakteryzujących się pluripotencją, wysoką aktywnością proliferacyjną i zdolnością do różnicowania się ze wzrostem w hodowlach. W szczególności, linia ludzkich komórek terato-embriokarakteryjnych NTERA-2 została wykorzystana do zbadania mechanizmów cytodróżnicowania nerwowego. Po transplantacji komórek tej linii do obszaru przedczołowego przodomózgowia nowonarodzonych szczurów zaobserwowano ich migrację i neuronogenezę. Nie było nawet próbuje przeszczep neuronów terato- otrzymany przez hodowlę komórki (zarodków) -kartsinomnoy linii NTERA-2, pacjentów po udarze, które, według autorów, co prowadzi do poprawy klinicznej choroby. Jednocześnie nie obserwowano przypadków złośliwych przeszczepionych komórek linii teratogen-zarodek NTERA-2 u pacjentów z udarem.

Pierwsza linia niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy na początku lat 80-tych ubiegłego wieku dostał Evans i Martin, wybierając je z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty - embryoblast. Izolowane linie ESC przez długi czas zachowały pluripotencję i zdolność do różnicowania się na różne typy komórek pod wpływem czynników specjalnej pożywki hodowlanej.

Pojęcie „pluripotencjalne komórki embrionalne macierzystych” należy Leroy Stevens, że badanie oddziaływania na dym tytoniowy częstości rozwoju guzów zwrócił uwagę na wystąpienie spontanicznej jąder potworniaka liniowych (129 / v) myszy z grupy kontrolnej. Jądra komórki teratocarcinoma charakteryzowały się wysoką szybkością proliferacji, w obecności cieczy pozostała w jamie brzusznej z utworzeniem spontanicznego różnicowania neuronów, keratynocyty, chondrocyty, sercowego, jak również włosy i fragmentów kości, jednak bez wskazania uporządkowanego cytoarchitectonics odpowiednie tkanek. Sadzenia w hodowli komórek potworniaka hodowano przyłączone do podłoża pluripotencjalnych klonów uformowane kształtki embrionalne następnie zatrzymano i poddano spontanicznego rozszczepienia disorderly różnicowania się neuronów, gleju, mięśni i komórek mięśnia sercowego. Stevens stwierdzono, że potworniak mysz 129 / V zawiera mniej niż 1% komórek zdolnych do różnicowania się do wielu specjalistycznych linii somatycznej, a sam zróżnicowanie zależy od czynników, które wpływają na ich (płyn otrzewnowy skład, produkty dodane do hodowli dojrzałych komórek lub tkanek). Leroy Stevenson założenie o obecności wśród komórek potworniaka gamet seksualne zarodkowych progenitorowych potwierdzono: zawiesina embryoblast zarodków preimplantacyjnych komórek w tkankach dorosłych myszy utworzonej potworniaka i oddzielony od nich czystych liniach komórkowych po podaniu dootrzewnowym do zwierząt-biorców nie różnicują się neuronów, sercowego i inne kletki somatycznych pochodne wszystkich trzech listków zarodkowych. W doświadczeniach in vivo ESK w transplantacji (otrzymany z embryoblast ale trofoblastu) z embrionów myszy w różnych stadiach linii 8-32 blastomerowe zakończony narodzin zwierzęcia chimerycznego (brak tworzenia się guza) w narządach wykrywa tkanki kiełków dawcy. Nawet w linii komórek płciowych chimeryzm obserwowano.

Pierwotne komórki rozrodcze progenitorowych wyizolowane z zarodków zarodkowej myszy płci, morfologii i charakterystyki immunologicznej fenotyp funkcjonalnych zgodnych z hESC pochodzących z potworniakiem Stevenson i embryoblast. W chimerach urodzonych po podaniu hESC do blastocysty, allofenny morfogenezy narządów charakteryzujących mozaiki dawcy i biorcy zmienny strukturalne i funkcjonalne jednostki wątroby, płuc i nerek. W wielu przypadkach zaobserwowano powstawanie krypt jelitowych lub płatków wątroby, składających się jednocześnie z komórek biorcy i dawcy. Jednak zawsze realizacja morfogenezy następowała zgodnie z programem genetycznym gatunku, do którego należał biorca, a chimeryzm ograniczał się wyłącznie do poziomu komórkowego.

Następnie stwierdzono, że rozprzestrzenianie hESC bez cytodifferentiation podajnikiem komórek mezenchymalnych warstwami pochodne (fibroblastów płodowych) zachodzi w obecności LIF wiązania w selektywnych pożywkach, które selektywnie zapewniają tylko przeżycie komórek macierzystych i progenitorowych, a większość z wyspecjalizowanych elementów komórkowych umiera. Z pomocą tych technik w 1998 roku przez Jamesa Thomsona przeznaczono pięć unieśmiertelnionych linii zarodkowych komórek macierzystych z wewnętrznej masy komórkowej osoby blastocysty. W tym samym roku, John Gerhart opracowała metodę izolowania nieśmiertelne linie ESC z puff seksualnego cztery-pięć-tygodniowych zarodków ludzkich. Ze względu na swoje wyjątkowe właściwości, w ciągu zaledwie dwóch lat, embrionalne komórki macierzyste i komórki macierzyste tkanek ostatecznych zaczęły już być stosowane w praktyce medycyny regeneracyjnej i terapii genowej.