Mezenchymalne komórki macierzyste

Wśród regionalnych komórek macierzystych, mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zajmują szczególne miejsce, którego pochodne stanowią matrycę zrębu wszystkich narządów i tkanek ludzkiego ciała. Priorytetem w badaniach MSC są przedstawiciele rosyjskiej nauki biologicznej.

W połowie ubiegłego stulecia jednorodną kulturę multipotencjalnych komórek macierzystych szpiku kostnego zrębu wyodrębniono najpierw w laboratorium A. Friedenshteina. Mezenchymalne komórki macierzyste, przymocowanego do podłoża przez długi czas zachowały wysokiej szybkości proliferacji i hodowli na małą gęstością szczepiącego po utrwaleniu na podłożu utworzonym z klonów komórkowych fibroblastów nie posiadających aktywność fagocytarną. Zatrzymanie proliferacji MSC spowodowało spontaniczne różnicowanie in vitro do kości, tkanki tłuszczowej, chrząstki, mięśni lub komórek tkanki łącznej. Dalsze badania umożliwiły określenie potencjału osteogennego komórek podobnych do fibroblastów zrębu szpiku różnych gatunków ssaków, a także ich aktywności tworzenia kolonii. W doświadczeniach in vivo wykazano, że zarówno hetero- i ortotopowy przeszczep komórek fibroblastów kolonii formowania jest opisane formowania kości, chrząstkę, tkanki tłuszczowej i włóknistej. Ponieważ komórki macierzyste szpiku kostnego mają dużą zdolność do samoodnowy i zróżnicowania w obrębie pojedynczej linii komórkowej, zostały nazwane multipotencjalnymi mezenchymalnymi komórkami progenitorowymi.

Należy zauważyć, że przez 45 lat podstawowych badań mezenchymalnych komórek macierzystych stworzono rzeczywiste warunki stosowania ich pochodnych w praktyce klinicznej.

Obecnie nie ma wątpliwości, że wszystkie tkanki ludzkiego ciała powstają z komórek macierzystych różnych linii komórkowych w wyniku procesów proliferacji, migracji, różnicowania i dojrzewania. Jednak ostatnio uważano, że komórki macierzyste w ciele dorosłym są specyficzne tkankowo, to znaczy zdolne do wytwarzania wyspecjalizowanych linii komórkowych tylko w tkankach, w których się znajdują. Ta sytuacja konceptualna została obalona przez fakty transformacji hematopoetycznych komórek macierzystych nie tylko w komórkowe elementy krwi obwodowej, ale także w owalne komórki wątroby. Ponadto neuronalne komórki macierzyste były w stanie wytworzyć zarówno neurony, jak i elementy glejowe, jak również wczesne linie komórek krwiotwórczych progenitorów. Z kolei mezenchymalne komórki macierzyste, zwykle wytwarzające elementy komórkowe kości, chrząstki i tkanki tłuszczowej, mogą przekształcać się w nerwowe komórki macierzyste. Zakłada się, że w procesie wzrostu, regeneracji tkanek fizjologicznych i reparacyjnych, niezaprogramowane komórki progenitorowe są generowane z rezerwy łodygi właściwej tkankowo. Na przykład naprawa tkanki mięśniowej może być realizowana za pomocą mezenchymalnych komórek macierzystych, które migrują ze szpiku kostnego do mięśni szkieletowych.

Chociaż takie przekroju zamienności komórki macierzyste rozpoznać nie wszystkie badaczy możliwość klinicznego zastosowania mezenchymalnych komórek macierzystych, jak źródła przeszczepu komórek i wektora komórki informacji genetycznej nie zaprzecza komórki macierzyste multipotentne zrębu szpiku kostnego, które mogą być stosunkowo łatwo wyizolować i propagujących w kulturze in vitro. Jednocześnie w literaturze naukowej nadal pojawiają się doniesienia o potencjale pluripotencjalnych komórek macierzystych zrębu szpiku kostnego. Jako dowód przedstawiony protokołów badawczych, które pod wpływem specyficznych induktorów transdyferencjacji w MSC są zamieniane na komórki nerwowe, sercowego i hepatocytów. Jednak u niektórych naukowców możliwość ponownej aktywacji i ekspresji genów we wczesnej fazie embriogenezy jest wysoce wątpliwa. W tym samym czasie, każdy rozumie, że jeśli znajdują się warunki, aby rozwinąć multipotencjalnych mezenchymalnych komórek macierzystych do pluripotencji RSG w medycynie regeneracyjnej i plastiku automatycznie rozwiązać wiele problemów natury etycznej, moralnej, religijnej i prawnej. Ponadto, ponieważ w tym przypadku źródłem macierzystych regeneracyjne pacjenta są to autologiczne komórki zrębu jest rozwiązany, a problem odpornościowego odrzucenia przeszczepu komórek. Jak prawdziwe są te perspektywy, najbliższa przyszłość się pokaże.

[1], [2]

Wykorzystanie mezenchymalnych komórek macierzystych w medycynie

Zastosowanie kliniki pochodnych mezenchymalnych komórek macierzystych jest przede wszystkim związane ze zmniejszeniem wad tkanek spowodowane szerokich i głębokich zmian termicznych skóry. Przedkliniczne ocenę doświadczalną odpowiedniości allogenicznych fibroblastycznych mezenchymalnych komórek macierzystych do leczenia głębokich oparzeń przeprowadzono. Wykazano, że szpik kostny mezenchymalnych komórek macierzystych podobne do fibroblastów tworzą pojedynczą warstwę w kulturze, która umożliwia przeszczepić je zoptymalizować regenerację ran oparzeniowych głębokich. Autorzy zauważają, że podobne właściwości mają embrionalne fibroblasty, ale zastosowanie kliniczne tych ostatnich jest ograniczona do istniejących problemów etycznych i prawnych. Głębokie oparzenie termiczne z uszkodzeniem wszystkich warstw skóry było wzorowane na szczurach Wistar. Powierzchnia oparzenia wynosiła 18-20% całkowitej powierzchni skóry. W pierwszej grupie eksperymentalnej polegała szczurów z głębokim uszkodzeniem termicznym i przeszczepów allogenicznych komórek mezenchymalnych komórek macierzystych fibroblastów. Drugą grupę zwierząt z głębokich oparzeń termicznych i trans-plantacji allogenicznych embrionalnych fibroblastów. W trzeciej grupie szczurów kontrolnych wyposażony głębokie uszkodzenie termiczne, które nie przeprowadzenia terapii komórkowej. Zawiesinę komórek macierzystych pochodzących z mezenchymalnych oraz fibroblastach embrionalnych fibroblastach nałożono na powierzchnię rany oparzeniowe pipetą w ilości 2 x 10 ⁴ komórek na 2 dnia po wycięciu modelowania spalania i martwicze strupa osad. Po przeszczepie komórek spalić powierzchni pokryte gazą nasączoną w izotonicznym roztworze chlorku sodu z gentamycyną. Ogrodzenie komórki szpiku kostnego w celu uzyskania MSC z dalszym indukowaniu linii fibroblastów w mezenchymalnych komórkach macierzystych, wytwarzanych u dorosłych szczurów Wistar z kości udowych. Embrionalne fibroblasty otrzymano z płuc 14-17 dniowych zarodków. Embrionalne fibroblasty i komórki szpiku kostnego w celu uzyskania wstępnie MSC hodowano na płytkach Petriego w temperaturze 37 ° C w iikubatore C02, w atmosferze 5% CO2 przy wilgotności 95%. Embrionalne fibroblasty hodowano przez 4-6 dni, przy czym w celu utworzenia jednowarstwowej MSC wymagane od 14 do 17 dni. MSC Kolejno prowadzi kriokonserwacji jako materiał wyjściowy do mezenchymalnych komórek macierzystych fibroblastów, które zostały przygotowane przez rozmrożenie i prowadzenie hodowli MSC w ciągu 4 dni. Ilość mezenchymalnych komórek macierzystych fibroblastów generowane jest ponad 3 razy liczba embrionalnych fibroblastach powstałych podczas tego samego okresu hodowli. W celu identyfikacji komórek w transtslantirovannyh ran oparzeniowych w etapie hodowania ich genomu znakowane wirusowego wektora transportującego na bazie rekombinowanego adenowirusa kodującego gen V Rodzaj nośnika 1 aS-2, beta-galaktozydazy E. Coli. Żywe komórki w różnych okresach czasu po transplantacji immunohistochemicznie wykrywano w zamrożonych skrawkach z dodanego substratu X-gal, dając charakterystyczny kolor niebiesko-zielony. W wyniku dynamicznego wizualnej, konturowego i histologicznej oceny stanu ran oparzeniowych dnia, okazało się, że nawet na 3 dzień po transplantacji komórek w izolowanych grupach pojawiają się istotne różnice w trakcie procesu gojenia. Szczególnie wyraźna, różnica ta stała się siódmego dnia po transplantacji komórek. Zwierzęta z pierwszej grupy, którym przeszczepiono mezenchymalne komórki macierzyste fibroblastów nawinięte równomiernie nabyte intensywny kolor różowy, ziarnina rosły na całej powierzchni na poziomie naskórka, i spalić powierzchni jest znacznie zmniejszone. Folia kolagenowa uformowana na powierzchni rany była nieco cieńsza, ale nadal pokrywała całą powierzchnię oparzenia. Zwierzęta z grupy drugiej, którym przeszczepiono embrionalne fibroblasty ziarnina jest podnoszony do poziomu naskórka brzegów rany, ale tylko w niektórych miejscach w tym samym plazmoreya czasu od rany była bardziej intensywna niż w grupie 1 i początkowo tworzy folia kolagenowa praktycznie zniknął. W przypadku zwierząt, które nie otrzymały leczenie komórek macierzystych, na 7 dni ran oparzeniowych był blady, bruzdy, martwiczych tkanek pokrytych fibryną. Plasmorrhea odnotowano na całej powierzchni oparzenia. Pod względem histologicznym, zwierzęta z grupy 1 i 2 wykazały spadek nacieku komórkowego i rozwoju naczyniowego, te znaki początkowej procesu regeneratora były cięższe u szczurów w grupie 1. W grupie kontrolnej wykazały oznaki komórek rany infiltracji histologicznej wzór nowo tworzących się naczyniach krwionośnych nieobecny. 15-30 ym dniu obserwacji zwierzęta z grupy 1 powierzchni spalania był znacznie mniejszy niż w innych grupach szczurów i powierzchni granulowanie bardziej rozwinięte. U zwierząt z powierzchni spalania 2 grupa jest również zmniejszyła się w porównaniu z wielkością ran oparzeniowych w grupie kontrolnej szczurów, która ze względu na krańcowej epitelizacją. W grupa kontrolna oparzeń powierzchniowych centrów pozostała blado granulacji z rzadkim, dającym się na nich popękane, wysepki włókniste płytki nadal umiarkowany plazmoreya całej powierzchni spalania, które to zjawisko jest trudne zdejmowany parch zostało. Ogólnie, zwierzęta z trzeciej grupy również zmniejszyły rozmiar rany, ale brzegi rany pozostały podcięte.

Tak więc, w trakcie badania porównawcze ran stóp leczniczych wykorzystujących mezenchymalnych komórek macierzystych fibroblastów i fibroblastów płodowych, bez stosowania terapii komórkowej oznaczony przyspieszenia gojenia powierzchni spalania, w wyniku przeszczepienia komórek macierzystych mezenchymalnych fibroblastów i fibroblastach zarodkowych. Jednakże, w przypadku zastosowania allogenicznych komórek mezenchymalnych komórek macierzystych fibroblastów gojenia rany był wyższy niż w transplantacji embrionalnych fibroblastów. Przejawia się przyspieszając zmianę fazy regeneracji procesu - zmniejszenie okresów infiltracji komórkowej zwiększa szybkość namnażania sieci naczyń krwionośnych, jak również powstawanie ziarniny.

Wyniki dynamicznej planimetrii wskazują, że tempo spontanicznego gojenia się ran oparzeniowych (bez zastosowania terapii komórkowej) było najniższe. W dniu 15 i 30 dniu po transplantacji allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych z fibroblastów szybkości gojenia ran była wyższa niż w transplantacji embrionalnych fibroblastów. Sposób histochemiczne do wykrywania beta-galaktozydazy wykazały, że po transplantacji komórek mezenchymalnych komórek macierzystych, jak i fibroblasty embrionalne fibroblastów w całym okresie obserwacji na powierzchni i głębokości regeneracji rany przeszczepione komórki pozostają żywe. Autorzy sugerują, że wyższe tempo regeneracji ran oparzeniowych użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych z fibroblastów uwarunkowanej wydaniu przez te komórki podczas dojrzewania rostostimuliruyushih czynników bioaktywnych.

Przeszczepienie autologicznych lub allogenicznych keratynocytów i fibroblastów allogenicznych w leczeniu ran oparzeniowych i na stosowane w klinice. Należy zauważyć, że leczenie chirurgiczne dzieci z rozległymi oparzeniami głębokich jest skomplikowanym zadaniem ze względu na dużą różnorodnością interwencji urazowych i chirurgicznych, znaczną utratę krwi, na różnych reakcjach stosowanych nośników wlew. Główne trudności w realizacji skóry i chirurgii plastycznej z rozległych oparzeń głębokich, powierzchnia przekraczająca 40% powierzchni ciała, z powodu nasilenia jej stanu i braku środków dawcy skóry. Zastosowanie przeszczepów siatkowych z dużym stosunkiem perforacji nie rozwiązuje problemu, ponieważ obraz po perforacji komórek epiteliziruyutsya jest bardzo powolny, a często przeszczepy skóry są lizie lub suche. Takie powłoki ran oparzeniowych jak ksenokozha ze zwłok, alloprzeszczepy syntetyczne powłoki folii nie zawsze są wystarczająco skuteczne, więc opracowanie nowych sposobów zamykania warstwy powierzchniowe oparzenia hodowli keratynocytów i fibroblastów. W szczególności, sposób zamykania powierzchni oparzenia pomocą hodowano allofibroblastov dostarczając podczas przeszczepu wyraźny wpływ stymulujący na epidermotsitov proliferacji zachowaną na granicy rany przy oparzeniach, i keratynocytów przeszczepy oczek wstęgi. W pracy L. Budkevicha i współautorów (2000) przedstawiono wyniki zastosowania tej metody w leczeniu oparzeń u dzieci. Przebadano 31 dzieci z urazem termicznym w wieku od 1 do 14 lat. Na troje dzieci łącznej powierzchni ran oparzeniowych IIIA-B - stopień IV wynosiła 40%, 25 - 50-70%, nawet po trzech - 71-85% powierzchni ciała. Wczesna chirurgiczna nekrosektomia została połączona z przeszczepem hodowli wszystkich fibroblastów i autopermaską. W leczeniu pierwszego etapu przeprowadzono martwiczych wycięcie tkanki, drugi - na przeszczepie hodowanych folii nośnej allofibroblastov trzeci (48 dni po przeszczepie hodowanych allofibroblastov) - usunięciu podłoża i skóry płatów z autodermoplastyczna współczynnika perforacji 1: 4. Trzech pacjentów przyjętych do kliniki z ciężką chorobą oparzeń, hodowanych allofibroblastów przeszczepiono do ran ziarninujących. Transplantację hodowanych allo-fibroblastów przeprowadzono raz na 18 dzieci, dwa razy na 11, a trzy razy na dwóch pacjentów. Obszar powierzchni rany pokryty kulturą komórkową wynosił od 30 do 3500 cm2. Skuteczność oceniano przez hodowanych allofibroblastov całkowity procent wszczepienia płatów skóry, czas leczenia oparzeń i liczby zgonów ciężkie uszkodzenie termiczne. Wszczepienie przeszczepów zakończyło się u 86% pacjentów. Częściowy brak pojawiania się płatów skóry stwierdzono w 14% przypadków. Mimo trwającego leczenia zmarło sześć (19,3%) dzieci. Całkowita powierzchnia zmian skórnych w nich wynosiła od 40 do 70% powierzchni ciała. Transplantacja hodowanych allo-fibroblastów nie była związana ze skutkiem śmiertelnym urazu oparzeniowego u żadnego pacjenta.

Analizując wyniki leczenia, autorzy zauważają, że poprzednie oparzenia niezgodne z życia, w leczeniu głębokie uszkodzenia termiczne obszaru skóry 35-40% powierzchni ciała (dla małych dzieci - do 3 lat - są krytyczne głębokie oparzenia o powierzchni 30%, dla starszych dzieci wiek - ponad 40% powierzchni ciała). Po transplantacji chirurgiczne hodowanych autodermaplasty necrectomy allofibroblastov a następnie przeszczepy skóry z dużymi oparzenia, czynnik perforacja IIIB - IV stopnia pozostaje krytyczna, ale w tej chwili nie są perspektywy w wielu przypadkach, aby uratować życie nawet takich ofiar. Necrectomy chirurgiczne w połączeniu z przeszczepieniem hodowanych allofibroblastov i autodermaplasty u dzieci z głębokimi oparzeniami okazała się szczególnie skuteczna u chorych z zaawansowanymi zmianami skóry z deficytem miejsc dawcy. Aktywny Taktyka chirurgiczna i przeszczepianie hodowanych allofibroblastov promowania szybkiej stabilizacji stanu ogólnego takich pacjentów, zmniejszenie liczby powikłań infekcyjnych chorób spalania, tworząc sprzyjające warunki do zasiedlania, skrócenie czasu przywrócenia utraconej skórę i czas trwania leczenia szpitalnego, zmniejszenie częstości zgonów u pacjentów z rozległymi oparzeniami. Tak więc, przeszczepianie hodowanych allofibroblastov następnie autodermaplasty płaty skóry osiągają odzysk u dzieci z ciężkimi oparzeniami, które zostały wcześniej uznane za zgubiony.

Powszechnie uznaje się, że głównym celem leczenia choroby oparzeń jest maksymalizacja pełnego i szybkiego odzyskiwania uszkodzonej skóry, aby zapobiec skutkom toksyczności, powikłaniom infekcyjnym i odwodnieniu organizmu. Wyniki zastosowania hodowanych komórek w dużej mierze zależą od przygotowania do przeszczepienia samej rany oparzeniowej. W przypadku przeszczepiania hodowlanych keratynocytów na powierzchnię rany po necrectomy chirurgicznego prizhivlyaetsya średnio o 55% (powierzchnia) przeszczepionych komórek, przy granulacji ran wszczepieniu szybkość zmniejsza się do 15%. Dlatego skuteczne leczenie głębokich głębokich oparzeń skóry wymaga przede wszystkim aktywnej taktyki chirurgicznej. W obecności ran palących IIIB-IV, powierzchnia oparzenia jest natychmiast uwalniana z nekrotycznych tkanek w celu zmniejszenia skutków odurzenia i zmniejszenia liczby powikłań choroby oparzeń. Zastosowanie taktyki jest kluczem do skrócenia czasu od momentu oparzenia do zamknięcia ran i długości pobytu pacjentów z rozległymi oparzeniami w szpitalu, a także znacznego zmniejszenia liczby zgonów.

Pierwsze doniesienia o pomyślnym zastosowaniu hodowanych keratynocytów do pokrycia powierzchni oparzeń pojawiły się na początku lat osiemdziesiątych ubiegłego wieku. Następnie manipulację przeprowadzono za pomocą warstw hodowanych keratynocytów, uzyskanych najczęściej z autostruktur, znacznie rzadziej z allokeratynocytów. Jednak technologia plastyka autokeraty- nowychocytów nie pozwala na utworzenie banku komórek, podczas gdy czas wymagany do wytworzenia dostatecznego przeszczepu z keratynocytów jest duży i wynosi 3-4 tygodnie. W tym okresie ryzyko rozwoju zakaźnych i innych powikłań choroby oparzeniowej wzrasta gwałtownie, co znacznie przedłuża całkowitą długość pobytu pacjentów w szpitalu. Ponadto, autokeratynocyty praktycznie nie przeżywają podczas przesadzania do granulacji ran oparzeniowych, a wysokie koszty specjalnych pożywek wzrostowych i aktywnych biologicznie stymulatorów wzrostu keratynocytów znacznie ograniczają ich zastosowanie kliniczne. Inne metody biotechnologiczne, takie jak kolagenoplastyka, przeszczep kriokonserwowanych ksenoidów i stosowanie różnych powłok biopolimerowych, zwiększają skuteczność leczenia rozległych, ale nie głębokich oparzeń. Sposób powlekania powierzchni rany za pomocą hodowanych fibroblastów zasadniczo różni się tym, że głównym składnikiem hodowanej puli komórek nie są keratynocyty, lecz fibroblasty.

Warunkiem koniecznym dla rozwoju metody służył jako dowód, że perycytach które otaczają małe naczynia są pro- komórki genitornymi mezenchymalnych zdolnych do przekształcenia fibroblastów, które wytwarzają wiele czynników wzrostu i zapewniają gojenie ran ze względu na silny efekt stymulujący na proliferację i przyczepności keratynocytów. Korzystanie hodowane fibroblasty dla zamknięcia powierzchni rany natychmiast zidentyfikowano szereg znaczących zalet tego sposobu na wykorzystaniu hodowli keratynocytów. W szczególności, preparat fibroblastów w hodowli nie wymaga stosowania specjalnych nośników kultury i stymulatory wzrostu, co zmniejsza koszt przeszczepu więcej niż 10 razy koszt uzyskania keratynocytów. Fibroblasty łatwo poddany pasażowania, w którym częściowo tracą swoje antygeny układu zgodności tkankowej powierzchni, co z kolei sprawia, że możliwe jest wykorzystanie do wytwarzania przeszczepów allogenicznych komórek i tworzenie banki. Skraca otrzymujących przeszczepy, gotowe do użycia w klinice, od 3 tygodni (keratynocyty) 1-2 dni (dla fibroblastów). Pierwotne hodowle fibroblastów można otrzymać przez hodowlę komórek z fragmentów skóry pobranych w autodermoplastyczna wysiewu komórek i gęstości na subkultury Otrzymanie ludzkich fibroblastów tylko 20 x 10 ³ na 1 cm ².

W celu zbadania wpływu fibroblastów i ich białka regulatorowe w proliferacji i różnicowania keratynocytów, analizę porównawczą właściwości i morfologię proliferacji keratynocytów na podłożach z kolagenu typu I i III i fibronektyny w współhodowlę z ludzkich fibroblastów. Ludzkie keratynocyty, izolowane z fragmentów skóry u pacjentów z oparzeniami, pobranych podczas autodermoplastyczna pracy. Gęstość keratynocytów wynosiła 50 x 103 komórek na cm2. Kliniczną skuteczność przeszczepu hodowanych fibroblastów oceniono u 517 pacjentów. Wszyscy pacjenci zostali podzieleni na dwie grupy: pierwsza - dorośli dotknięci oparzeniami IIA, B - stopień IV; 2 - dzieci z głębokimi poparzeniami IIIB - IV stopień. Ocena dynamiki organizacji strukturalnej i funkcjonalnej hodowli jednowarstwowej fibroblastów w odniesieniu do roli w procesie regeneracji glikozaminoglikanów, fibronektyny, kolagenu i pozwolił autorom określić trzeci dzień jak najbardziej korzystnych warunków korzystania z hodowli fibroblastów do produkcji przeszczepów. Badanie wpływu na proliferację fibroblastów i różnicowania keratynocytów wykazały, że na podstawie fibroblastach in vitro mają wyraźne działanie pobudzające głównie na keratynocytów procesach adhezji, zwiększenie liczby komórek, które przylgnęły i szybkość ustalania się więcej niż 2 razy. Procesach adhezji stymulacja towarzyszy zwiększenie intensywności syntezy DNA i poziomem proliferacji keratynocytów. Ponadto stwierdzono, że obecność fibroblastów i pozakomórkowej matrycy utworzonej przez nie jest warunkiem koniecznym do utworzenia tonofibrillyarnogo Urządzenie keratynocytów połączeń międzykomórkowych, a ostatecznie do różnicowania keratynocytów i tworzenia błony podstawnej. Do leczenia dzieci z głębokich oparzeń ustalono skuteczność kliniczną kultury przeszczep allofibroblastov, zwłaszcza u pacjentów z rozległymi uszkodzeń miejsc donorowych skóry deficytem. Kompleks morfofunktcionalnoe badania wykazały, że szczepione znamienny fibroblasty aktywnej syntezy DNA, jak kolagen, fibronektyna i glikozaminoglikanów, które są generowane w komórkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Autorzy sugerują wysoki procent wszczepienia przeszczepionych fibroblastów (do 96%), znaczną redukcję w zakresie ich wytwarzania (w ciągu 2-3 godzin, zamiast 24-48 tygodni w przypadku keratynocytów), znaczne przyspieszenie epitelizacją powierzchni nagrywania i znaczne zmniejszenie ceny (10 razy) technologii hodowli przeszczepu z fibroblastów w porównaniu z przeszczepem keratynocytów. Stosowanie transplantacji hodowanych allofibroblastov umożliwia ratowanie życia dzieci z oparzeniami - krytycznych obrażeń cieplnej powyżej 50% powierzchni ciała, które dotychczas sądzono niezgodne z życia. Warto zauważyć, że allogeniczny przeszczep embrionalnych fibroblastach również przekonująco udowodnił nie tylko szybszą regenerację ran i rekonwalescencji pacjentów z różnego stopnia oparzenia i przestrzeni, ale również znaczną redukcję śmiertelności.

Autologiczne fibroblasty są wykorzystywane w taki skomplikowany i chirurgii plastycznej jako zamiennik korekcji uszkodzenia strun głosowych. Zwykle w tym celu stosuje się kolagen bydlęcy, którego czas trwania jest ograniczony przez jego immunogenność. Będąc obcego białka, kolagenu bydlęcego, kolagenazy wrażliwy do odbiorcy i może powodować reakcje immunologiczne, aby zmniejszyć ryzyko którym technologia preparatów kolagenowych zostały opracowane, usieciowany z aldehydu glutarowego. Ich zaletą jest większa stabilność i dolna immunogenność, który znalazł praktycznego zastosowania przy usuwaniu wad i zanik przewodu wokalnego. Iniekcje kolagenu autologicznego po raz pierwszy zastosowano w 1995 roku. Metody warunkiem zachowania podstawowej struktury autologicznych włókien kolagenowych oraz enzymatycznie katalizowanej wewnątrzcząsteczkowych wiązań sieciujących. Fakt, że naturalne włókna kolagenowe są bardziej odporne na degradację przez proteazy niż odtworzonych telopeptydy kolagenowych w którym cięcie. Integralność telopeptydy istotne dla struktury czwartorzędowej włókien kolagenowych i sieciowania kolagenu pomiędzy sąsiednimi cząsteczkami. W przeciwieństwie do preparatów kolagenu bydlęcego autologiczny kolagen nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej u pacjenta, ale nie są wystarczająco skuteczne, jak wypełnia agenta. Korekta trwałe mogą być osiągnięte dzięki lokalnej produkcji autologicznym przeszczepem kolagenu przez fibroblasty. Jednak badania skuteczności autologicznego transplantacji fibroblastów w klinice ujawniły pewne trudności. W początkowym okresie po wszczepieniu fibroblastów efektu klinicznego był słabszy w porównaniu do tego, po podawaniu bydlęcego kolagenu. Podczas hodowli autologiczne fibroblasty nie można wykluczyć możliwości przekształcenia normalnych fibroblastach nieprawidłową, tak zwane miofibroblasty odpowiedzialne za rozwój zwłóknienia i blizny, o czym świadczy zmniejszenie żelu kolagenowego, w wyniku specyficznego oddziaływania z fibroblastów i włókienek kolagenowych. Ponadto, po pasażowaniu seryjny fibroblastach in vitro tracą zdolność do syntezy pozakomórkowych białek matrycowych.

Niemniej jednak, w chwili obecnej eksperymentalnie wyeliminowano technikę hodowli autologicznych ludzkich fibroblastów, eliminując powyższe wady i nie prowadząc do onkogennej transformacji normalnych fibroblastów. Autologiczne fibroblasty uzyskane tą metodą są stosowane do wypełniania defektów tkanek miękkich twarzy. W badaniu H. Kellera i współautorów (2000) leczonych było 20 pacjentów w wieku od 37 do 61 lat ze zmarszczkami i zanikami zanikowymi. Biopsje skórne (4 mm), rejon BTE się do laboratorium w jałowych probówek zawierających 10 ml pożywki hodowlanej (Dulbecco antybiotyku mikoseptikom, pirogronianu i płodowej surowicy bydlęcej). Materiał umieszczono wewnątrz 3-5 szalek hodowlanych o średnicy 60 mm i inkubowano w termostacie z atmosferą zawierającą 5% CO2. Po 1 tygodniu komórki usunięto z płytek przez trypsynizację i umieszczono w fiolkach 25 cm2. Komórki są podawane pacjentom w ilości 4 x 107. Znaczący i długotrwały efekt kliniczny u pacjentów z korekcją fałdów nosowo-wargowych oraz u pacjentów z bliznami po 7 i 12 miesięcy po transplantacji autologicznej trzeciego fibroblastów. Zgodnie z cytometrią przepływową, hodowane fibroblasty wytworzyły dużą ilość kolagenu typu I. W badaniach in vitro wykazano prawidłową kurczliwość fibroblastów do wstrzykiwań. Dwa miesiące po podskórnym podaniu hodowanych fibroblastów w dawce 4 x 107 komórek nie wykryto myszy nagich. Wstrzykiwane fibroblasty nie powodowały powstawania blizn i nie powodowały zwłóknienia u pacjentów. Zdaniem autora, wszczepione autologiczne fibroblasty są w stanie stale wytwarzać kolagen, który da efekt kosmetycznego odmłodzenia. W tym przypadku, ponieważ długość życia zróżnicowanych komórek jest ograniczona, fibroblasty pobrane od młodego pacjenta są bardziej skuteczne niż te uzyskane u osób w podeszłym wieku. W przyszłości zakłada się, że możliwość kriokonserwacji kultury fibroblastów pobranej od młodego dawcy przeszczepi później starszemu pacjentowi swoje własne młode komórki. Podsumowując, nie do końca słuszne jest stwierdzenie, że autologiczne fibroblasty pod warunkiem zachowania funkcjonalności są idealnym środkiem do korekcji wad tkanek miękkich twarzy. Jednocześnie sam autor zauważa, że w procesie badawczym pojawiły się również sytuacje problematyczne związane z zastosowaniem autologicznego układu fibroblast-kolagen. Efekt kliniczny był często słabszy niż przy stosowaniu kolagenu bydlęcego, co powodowało rozczarowanie pacjentów.

Ogólnie, dane literaturowe dotyczące perspektyw klinicznego zastosowania mezenchymalnych komórek macierzystych wyglądają dość optymistycznie. Podejmowane są próby wykorzystania autologicznych mezenchymalnych komórek progenitorowych szpiku kostnego do leczenia zwyrodnieniowych zmian stawów. Prowadzone są pierwsze próby kliniczne hodowanych mezenchymalnych komórek progenitorowych w leczeniu złożonych złamań kości. Autologiczne i allogeniczne mezenchymalne komórki zrębu szpiku kostnego wykorzystywane do generowania chrząstki tkanki do przeszczepienia w korekcji defektów chrząstki stawowej w wyniku urazu lub autoimmunologicznych, uszkodzeń. Praktykowane sposoby klinicznego zastosowania multipotencjalnych komórek mezenchymalnych komórek progenitorowych do skorygowania defektów kości u dzieci z ciężkimi postępu osteogenezy spowodowane mutacjami w genie kolagenu typu I. Po mieloabelyatsii dzieci-biorców przeszczepianych szpiku kostnego z HLA zgodnym z niefrakcjonowanej zdrowych dawców szpiku kostnego może zawierać dostatecznej ilości mezenchymalnych komórek macierzystych w celu uzupełnienia poważne wady kości. Po przeszczepie allogenicznym przeszczepem szpiku dzieci te oznaczone pozytywnych zmian histologicznych w gąbczastej kości, zwiększenie szybkości wzrostu i zmniejszenia częstości złamań kości. W niektórych przypadkach pozytywny wynik kliniczny uzyskuje się poprzez przeszczepienie blisko spokrewnionego alogenicznego szpiku kostnego i osteoblastów. Do leczenia wrodzonej kruchości kości z powodu nierównowagi osteoblastów i osteoklastów w tkance kostnej stosuje się również transplantację MSK. Przywrócenie tworzenia kości w tym przypadku osiąga się dzięki chimeryzacji puli komórek macierzystych i progenitorowych w tkance kostnej pacjentów.

Metody modyfikacji genetycznej mezenchymalnych komórek macierzystych dawcy są ulepszane w celu korygowania defektów genetycznych tkanek zrębowych. Przypuszcza się, że mezenchymalnych komórek progenitorowych wkrótce będą stosowane w neurologii dla komórek mózgowych kierunkowe chimeryzacja i utworzyć pulę komórek zdrowych, zdolnych do generowania niedoborem enzymu lub czynnikiem odpowiedzialnym za objawów klinicznych choroby. Transplantacja mezenchymalnych komórek macierzystych mogą być stosowane do przywrócenia zrębu szpiku kostnego u pacjentów z rakiem po radioterapii i chemioterapii, a w połączeniu z komórkami szpiku kostnego - dla przywrócenia hematopoezy. Rozwój terapii substytucyjnej, którego celem jest wyeliminowanie wad układu mięśniowo-szkieletowego, stosując MSC promować technicznymi w biomateriałów matrycy projektu lub biomimics tworzących szkielety zamieszkujących potomstwo mezenchymalnych komórek macierzystych.

Źródła mezenchymalnych komórek macierzystych

Głównym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych jest szpiku kostnego komórki krwiotwórcze macierzyste, które u ssaków jest stale różnicują się w komórki krwi i układu odpornościowego, natomiast mezenchymalnych komórek macierzystych prezentowane małe populacje komórek podścieliska szpiku kostnego podobnych do fibroblastów i pomagają utrzymać niezróżnicowanych stan krwiotwórczych komórek macierzystych. W pewnych warunkach, mezenchymalne komórki macierzyste różnicowania w komórki chrząstki i kości. Gdy wysiano na pożywce w komórkach zrębu szpiku kostnego jednojądrzastych sadzenia niskiej gęstości utworzenia kolonii komórek adherentnych, które w rzeczywistości są fibroblasty multipotentne mezenchymalnych komórek prekursorowych. Niektórzy badacze sugerowali, że szpik kostny osadza niewykorzystane mezenchymalne komórki macierzyste, które, dzięki zdolności do samoodnawiania oraz wysoki potencjał różnicowania dostarczać wszystkich tkanek ciała poprzedników mezenchymalne komórki zrębowe w ciągu całego życia organizmu ssaka.

W szpiku kostnym elementy komórek zrębowych tworzą sieć wypełniającą przestrzeń między sinusoidami a tkanką kostną. Zawartość uśpionego MSC w szpiku kostnym osoby dorosłej jest porównywalna do liczby hematopoetycznych komórek macierzystych i nie przekracza 0,01-0,001%. Mezenchymalne komórki macierzyste wyizolowane ze szpiku kostnego i niepoddane uprawie pozbawione są cząsteczek adhezyjnych. Takie MSC nie eksprymują kolagenu CD34, ICAM, VCAM, typu I i III, CD44 i CD29. Dlatego in vitro nie mezenchymalne komórki macierzyste są utrwalane na podłożu hodowlanym, ale bardziej zaawansowane pochodne progenitorowe mezenchymalnych komórek macierzystych, które już utworzyły składniki szkieletu komórkowego i aparatu receptorowego cząsteczek adhezji komórkowej. Komórki zrębu o fenotypie CD34 występują nawet we krwi obwodowej, chociaż są znacznie mniej w szpiku kostnym niż komórki jednojądrzaste CD34. Komórki CD34 wyizolowane z krwi i przeniesione do hodowli przyłączają się do substratu i tworzą kolonie komórek podobnych do fibroblastów.

Wiadomo, że w okresie embrionalnym podłoże wszystkich narządów i tkanek ssaków i ludzi powstaje ze wspólnej puli mezenchymalnych komórek macierzystych przed i na etapie organogenezy. Dlatego uważa się, że w dojrzałym ciele większość mezenchymalnych komórek macierzystych powinna znajdować się w tkance łącznej i kostnej. Ustalono, że większość elementów komórkowych zrębu luźnej tkanki łącznej i kostnej reprezentują zaangażowane komórki progenitorowe, które jednak zachowują zdolność do proliferacji i tworzenia klonów in vitro. Po wprowadzeniu takich komórek do całkowitego przepływu krwi, więcej niż 20% mezenchymalnych komórek progenitorowych jest wszczepianych pośród elementów podścieliska tkanki krwiotwórczej i narządów miąższowych.

Potencjalnym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych jest tkanka tłuszczowa, pośród komórek macierzystych, z których zidentyfikowano prekursory adipocytów w różnym stopniu. Elementów dojrzały najmniej progenitorowych z tkanki tłuszczowej - komórki zrębu-naczyniowego, który jest taki sam jak multipotentne komórki progenitorowe mezenchymalne szpiku kostnego może różnicowania na adipocyty, pod działaniem glukokortykosteroidów, insulinopodobny czynnik wzrostu, jak i insuliny. W hodowli komórek naczyniowych zrębu różnicowania w adipocyty i chondrocytów oraz tkanki tłuszczowej komórek szpiku kostnego pochodzące tworzą adipocytów i osteoblastów.

W mięśniach znaleziono również źdźbła zrębu. W pierwotnej hodowli komórek izolowanych z ludzkich mięśni szkieletowych wykrywa się komórki postaci gwiaździstej i wielojądrowe miotubule. W obecności komórek gwiaździstych surowicy końskiej proliferacji in vitro bez oznak cytodifferentiation i po dodaniu deksametazonu pożywkę różnicowania charakteryzuje się przez pojawienie się elementy komórkowe komórek o fenotypie szkieletowych i mięśniu gładkim, kości, chrząstki i tkanki tłuszczowej. W związku z tym zarówno zaangażowane, jak i niezaangażowane multipotencjalne mezenchymalne komórki progenitorowe są obecne w ludzkiej tkance mięśniowej. Wykazano, że populacja komórek progenitorowych obecnych w mięśniach szkieletowych pochodzi z niewykorzystanych wielokierunkowych szpiku kostnego mezenchymalnych komórek progenitorowych i różni się od miogenicznych komórek satelitarnych.

W mięśniu sercowym nowonarodzonych szczurów również, komórek gwiaździstych kleju, odpowiednich dla potencjał różnicowania multipotencjalnych komórek mezenchymalnych komórek progenitorowych, co pod wpływem deksametazonu ich różnicowania na adipocyty, osteoblasty, chondrocyty, komórki mięśni gładkich, miotubule mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego. Wykazano, że komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (perycyty) pochodzą multipotencjalnych niezróżnicowanych komórek mezenchymalnych prekursorów okołonaczyniowe. W kulturze okołonaczyniowych mezenchymalnych komórek macierzystych ekspresji-aktyna mięśni gładkich i płytkopochodny czynnik wzrostu receptora i są zdolne do różnicowania przynajmniej komórek mięśni gładkich.

Szczególnym miejscem, pod względem rezerwy macierzystej, jest chrząstka chrzęstna, której niezwykle niski potencjał reparacyjny uważa się za spowodowany niedoborem multipotencjalnych mezenchymalnych komórek progenitorowych lub czynników różnicujących i wzrostowych. Zakłada się, że multipotencjalne mezenchymalne komórki prekursorowe wstępnie oddane do chondro- i osteogenezy wchodzą do tkanki chrzęstnej z innych źródeł tkankowych.

Nie ustalono także pochodzenia i warunków wywoływania mezenchymalnych komórek progenitorowych w ścięgnach. Obserwacje Ekspermentalnye sugerują, że na początku po urodzeniu komórek ścięgna Achillesa królika w kulturach pierwotnych w pierwszym fragmencie i zachowują ekspresję kolagenu typu I i dekorinu, ale po dalszej hodowli tracą tenotsitov markerów różnicowania.

Należy zauważyć, że odpowiedź na pytanie, czy rzeczywiście zlokalizowane w różnych tkankach wielokierunkowych mezenchymalnych komórek progenitorowych są zawsze obecne w ich zrębie lub basen tkanka mezenchymalnych komórek macierzystych jest kompensowany przez migrację zrębu kostnego komórek macierzystych szpiku, to wciąż brakuje.

Oprócz szpiku kostnego i innych stref mezenchymalnych dorosłego organizmu innym źródłem MSC może być krew pępowinowa. Wykazano, że żyły pępowinowej przewód krwi zawiera komórki, które mają podobne właściwości morfologiczne i wielokierunkowych antygenowe z mezenchymalnych komórek progenitorowych są zdolne do adhezji, a nie niższy multipotentne komórki progenitorowe mezenchymalne pochodzenia szpiku kostnego przez potencjał różnicowania. W hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych z krwi pępowinowej wykrytych od 5 do 10% niewykorzystanych wielokierunkowych mezenchymalnych komórek progenitorowych. Okazało się, że ich liczba we krwi pępowinowej jest odwrotnie proporcjonalna do wieku ciążowego, który jest pośrednim dowodem na migrację wielokierunkowych mezenchymalnych komórek progenitorowych język różnych tkanek podczas rozwoju płodowego. Były pierwsze informacje na temat klinicznego zastosowania mezenchymalnych komórek macierzystych izolowanych z krwi pępowinowej, jak i zarodkowych biomateriału, który oparty jest na znanej zdolności płodowych komórek macierzystych integrować i funkcja prizhivlyatsya w narządach i układach tkanek odbiorców dorosłych.

Poszukiwanie nowych źródeł mezenchymalnych komórek macierzystych

Wykorzystanie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia embrionalnego, podobnie jak innych komórek płodowych, stwarza szereg problemów etycznych, prawnych, prawnych i prawnych. W związku z tym nadal trwa poszukiwanie materiału z zewnątrzmięśniowo komórkowego dawcy. Próba była nieudana kliniczne zastosowanie ludzkich fibroblastach skóry, oznaczono metodą nie tylko wysoką zdolnością finansową technologii, ale także szybkiego różnicowania fibrocyty do fibroblastów, mających znacznie mniejszy potencjał proliferację i produkujących ograniczoną liczbę czynników wzrostu. Dalszy postęp w badaniach biologii MSK i multipotencjalnych mezenchymalnych prekursorów szpiku kostnego pozwolił na opracowanie strategii klinicznego stosowania autologicznych mezenchymalnych komórek macierzystych. Technologia ich izolacji, hodowli, rozmnażania ex vivo i ukierunkowanego różnicowania wymagała przede wszystkim badania spektrum markerów molekularnych MSC. Ich analiza wykazała, że w pierwotnych kulturach ludzkiej tkanki kostnej istnieje kilka typów multipotencjalnych mezenchymalnych komórek progenitorowych. Fenotyp pro-osteoblastów stwierdzono w komórkach eksprymujących marker stromalnych komórek prekursorowych STRO-1, ale nie zawierających markera osteoblastów - alkalicznej fosfatazy. Takie komórki charakteryzują się niską zdolnością do tworzenia zmineralizowanej matrycy kostnej, jak również brakiem ekspresji osteopontyny i receptora parathormonu. Pochodne komórek STRO-1-dodatnich, które nie wyrażają fosfatazy alkalicznej są reprezentowane przez pośrednie i całkowicie zróżnicowane osteoblasty. Ustalono, że elementy komórkowe klonowanych linii komórek STRO-1-dodatnich ludzkich kości beleczkowych są w stanie różnicować się w dojrzałe osteocyty i adipocyty. Różnicowanie w kierunku tych komórek w zależności od ekspozycji nienasyconych kwasów tłuszczowych, - prozapalnych cytokin IL-1 i czynnik martwicy nowotworu a (TNF-a), jak również jako środki przeciwzapalne i immunosupresyjne TGF-b.

Później stwierdzono, że multipotentne mezenchymalne komórki prekursorowe brak specyficzne wyłącznie dla nich właściwy fenotyp, a wyrażenie złożone markery charakterystyczne dla mezenchymalnych, śródbłonka, komórkach nabłonkowych i mięśniowych przy braku ekspresji antygenów komórek krwiotwórczych immunofenotypowych - CD45, CD34 i CD14. Ponadto, mezenchymalne komórki macierzyste i konstytutywną indukowalnej wytwarzać krwiotwórczych i niekrwiotwórczych czynniki wzrostowe, interleukiny, chemokiny i i w wielokierunkowych mezenchymalnych komórek prekursorowych wyrażane receptory dla niektórych czynników wzrostowych i cytokin. Wśród komórek podścieliska podstawy ludzkiego ciała znaleziono dormantnye lub odpoczynku komórek immunofenotypem, niemal identyczny z profilem antygenowej surowych 5-fluorouracyl wielokierunkowych mezenchymalnych komórek progenitorowych - te i inne komórki ekspresji CD117, oznaczenie „tylko dla dorosłych” komórek macierzystych.

Zatem nie ustalono jeszcze markera komórek charakterystycznego dla mezenchymalnych komórek macierzystych. Przyjmuje się, że komórki spoczynkowe nie są zatwierdzone populacje wielokierunkowych mezenchymalnych komórek macierzystych krwi, gdyż nie wykazują ekspresji markerów komórkowych zaangażowany w choroby zwyrodnieniowej stawów (CBFA-1) lub adipogenezy (PPAR-y-2). Przedłużona ekspozycja wolno namnażających się komórek spoczynkowych na płodową surowicę cielęcą prowadzi do tworzenia końcowo zróżnicowanych prekursorów, charakteryzujących się szybkim wzrostem. Klonalny wzrost takich mezenchymalnych komórek macierzystych jest podtrzymywany przez FGF2. Wydaje się, że komórki macierzyste genomu zrębu pochodzący „zamknięta” na tyle mocno Donoszono o braku spontanicznego różnicowania MSC. - bez specjalnych warunków angażującym nawet nie są przetwarzane do komórek mezenchymalnych serii.

W celu zbadania struktury populacji pochodzącej mezenchymalne komórki macierzyste są przeszukiwane białka markerów różnicowania w liniach komórek zrębowych i kulturach pierwotnych. W klonalnych test kolonii komórek szpiku kostnego in vitro okazało się, że kiedy poddaje się hodowli pierwotnych EGF zwiększa średnią wielkość kolonii i zmniejsza klonalną ekspresję alkalicznej fosfatazy, a dodatek hydrokortyzonu aktywuje ekspresję alkalicznej fosfatazy, która jest markerem różnicowania osteogennego orientacji MSC. Przeciwciała monoklonalne przeciwko STRO-1 możliwe było oddzielenie i populacje studyjne STRO-1-pozytywnych komórek, które przylgnęły w heterogenicznym układzie kultur Dexter. Widmo cytokin nie tylko regulują proliferację i różnicowanie komórek krwiotwórczych i limfoidalne, ale także udział w tworzeniu, tworzenia i resorpcji tkanki szkieletowej przez para-, auto- i mechanizmów wydzielania wewnętrznego. Receptor pośredniczy uwalnianie komunikatorów wtórnego cAMP, takie jak diacyloglicerolu, trifosforan inozytolu, i Ca2 + są również używane do analizy markerów różnych rodzajów tkanki zrębu komórek wyrażających odpowiedne receptory. Stosowanie monoklonalnych przeciwciał jako markerów możliwość tworzenia zrębu narządy limfoidalne komórki należące siatkowej dla T i stref B zależnych.

Przez pewien czas trwały spory naukowe wokół kwestii możliwości powstania MSC z hematopoetycznej komórki macierzystej. Rzeczywiście, przy eksplantacji zawiesiny komórek szpiku kostnego w hodowlach jednowarstwowych, rosną w nich osobliwe kolonie fibroblastów. Jednakże, wykazano, że obecność prekursorów kolonie fibroblastów i różnych zarazków różnicowanie tkanki krwiotwórczej w części szpiku kostnego nie jest dowodem wspólnego pochodzenia krwiotwórczych komórek macierzystych. Za pomocą analizy dyskryminacyjnej komórek macierzystych szpiku kostnego stwierdzono, że mikrośrodowisko w heterotopowego przeszczepu, krwiotwórcze komórki szpiku kostnego jest przenoszone, co dowodzi istnienia w szpiku kostnym niezależnie od histogenetic MSC populacji komórek krwiotwórczych.

Ponadto, selektywne metodę klonowania ujawnione w hodowlach jednowarstwowych komórkach zrębu szpiku kostnego nowej kategorii komórek prekursorowych w celu określenia ich liczby, w celu zbadania ich właściwości, proliferacyjną i różnicowania potencjał. Stwierdzono, że komórki zrębowe fibroblastów in vitro proliferacji i tworzą kolonie diploidalnych, że podczas transplantacji odwrotnej do korpusu, zapewniając tworzenie nowych narządów krwiotwórczych. Wyniki badań poszczególnych klonów wskazują, że istnieje populacja komórek w ich proliferacyjnej i różnicowania możliwości ubiegać się o rolę komórek macierzystych z tkanki zrębowej, Gistogeneticheskaja niezależnie od hematopoetycznych komórek macierzystych w komórkach progenitorowych zrębu. Komórki tej populacji charakteryzują się samopodtrzymującym wzrostem i różnicują się w komórki progenitorowe tkanki kostnej, chrzęstnej i siatkowej szpiku kostnego.

Bardzo interesujące są wyniki badań Chailakhyan R. I współpracownicy, (1997-2001), które hodowano w szpiku kostnym komórek progenitorowych zrębu króliki, świnki morskie, myszy a-MEM podłożu uzupełnionym płodową surowicą cielęcą. Autorzy przeprowadzili eksplantację o początkowej gęstości 2-4 x 103 komórek szpiku kostnego na 1 cm2. Jako podajnik, homologiczne lub heterologiczne dezaktywowane promieniowaniem komórki szpiku kostnego zastosowano w dawce zachowującej działanie podajnika, ale całkowicie blokując ich proliferację. Dwutygodniowe pierwotne odrębne kolonie fibroblastów trypsynizowano w celu wytworzenia szczepów monoklonalnych. Dowody pochodzenia kolonie klonów otrzymano przy użyciu markerów chromosomalnych w mieszanych hodowlach szpiku kostnego u samców i samic świnek morskich, strzelanie upływ czasu żywe kultury, jak również w mieszanych hodowlach szpiku kostnego i syngenicznych myszy CBA SVAT6T6. Przeszczep zawiesinę świeżo wyizolowanych komórek szpiku kostnego fibroblastów hodowanych w warunkach in vitro lub zrębu pod torebkę nerki przeprowadzono w ivalonovyh porowate podłoża lub żelatyna, jak również inaktywowane królika macierzy kości gąbczastej. Klony przeszczepienia pokrywy kości ud świnki oczyszczone z tkanek miękkich i okostnej, cięte i dokładnie przemywając nasady szpik kostny. Kość pocięto na fragmenty (3-5 mm), wysuszono i napromieniowano w dawce 60 Gy. W osłonach kostnych poszczególne kolonie fibroblastów umieszczono i wszczepiono domięśniowo. W podaniu dootrzewnowym transplantacji fibroblastów zrębowych, hodowane in vitro, wykorzystano do komory dyfuzyjnej typu A (V = 0,015 cm3, h = 0, l mm) i D (v = 0,15 cm 3, H = 2 mm).

Przy badaniu dynamiki wzrostu klonów szczepów Chailakhyan R. Et al (2001) stwierdzili, że pojedyncze komórki, tworzące kolonie fibroblastów, a także ich potomstwo mają ogromny potencjał proliferacyjny. W dziesiątym pasażu liczba fibroblastów w niektórych szczepach wynosiła 1,2-7,2 x 10 ⁹ komórek. W procesie ich rozwoju wykonali do 31-34 duplikacji komórkowych. Zatem heterotopowe transplantacji szpiku kostnego pochodzące od szczepów utworzonych przez zrębu prekursorów kilkadziesiąt klonów doprowadziło do przeniesienia mikrośrodowisku szpiku kostnego i edukacji w nowej strefy krwiotwórczego przeszczepiania narządów. Autorzy poruszył kwestię, czy poszczególne klony tolerują mikrośrodowiska szpiku kostnego komórek zrębu, czy to wymaga współpracy kilku różnych klonogennego zrębowej progenitorowych? A jeśli poszczególne klony będą mogli przenieść mikrośrodowiska, czy to jest pełna wszystkich trzech kiełków krew lub inne klony zapewnić powstawanie krwiotwórczego mikrośrodowiska dla różnych zarazków? Aby rozwiązać te problemy opracowano technologię komórek progenitorowych zrębu uprawa w żelu kolagenowego, który pozwala na fotografowanie z powierzchni fibroblastów hodowanych kolonie dla późniejszego przeszczepienia heterotopowej. Poszczególne klony fibroblasty, komórki zrębu szpiku hodowano od myszy CBA i świnek morskich, ucina się razem z fragmentem żelkotu i przeszczepionej heterotopowe - pod torebkę nerki myszy syngenicznych lub autologicznych mięśni brzucha świnek morskich. Po transplantacji do mięśnia, kolonie na żelu umieszczono w kościstych pokryciach.

Stwierdziliśmy, że przez 50-90 dni po przeszczepie szpiku kostnego fibroblastów kolonii w 20% przypadków, w obszarze rozwoju przeszczep kości lub kości i tkanki krwiotwórczej zaobserwowano. U 5% zwierząt biorców ogniska tkanki kostnej zawierały jamę wypełnioną szpikiem kostnym. Wewnątrz cylindrów kości takie ogniska mają zaokrąglony kształt i kapsułkę wykonaną z tkanki kostnej, z osteocyty oraz rozwiniętą warstwę osteoblastów. Jamy szpikowej kości zawiera siatkową tkaninę z komórek erytroidalnych i szpikowych, w proporcjach, które nie różnią się od tej w normalnym szpiku kostnego. Przeszczepu nerek był typowy korpus rdzeniowy składa się z naturalnych przeszczepu szpiku kostnego, w której kapsułka obejmuje tylko jamę szpikową z kapsułki nerek. Tkanka z kapturem obejmowała elementy mieloidalne, erytroidalne i megakariocytowe. Zręby jamy szpikowej miały dobrze rozwinięty układ sinusoidalny i zawierały typowe komórki tłuszczowe. Jednocześnie w dziedzinie transplantacji jakiejś kolonii kości bez oznak hematopoezy stwierdzono pod torebką nerki. Badanie proliferacyjnej i różnicowania siły działania poszczególnych klonów kontynuowano monoklonalne królika szczepów szpiku kostnego, komórki zawieszano ponownie w pożywce hodowlanej i w oddzielnym gąbki ivalonovoy wadze 1-2 mg schowany pod torebkę nerki dawcy szpiku kostnego królika. Taki autoprzeszczep został poddany komórkom 21 szczepów monoklonalnych. Wyniki zostały uwzględnione w ciągu 2-3 miesięcy. Autorzy stwierdzili, że 14% z przeszczepem szpiku kostnego szczepów monoklonalnych kształtki składają się kości i szpiku kostnego jamy wypełnione komórek krwiotwórczych. W 33% przypadków przeszczepione szczepy tworzy zwartej kości z wnękami wielkości ostootsitami murowanych w osteoblastów oraz rozwiniętą warstwę. W niektórych przypadkach, gąbki przeszczepione klony opracowany endoplazmatyczne bez kości lub komórek krwiotwórczych. Czasami siatkowy zrąb formacja wystąpiła z dobrze rozwiniętą siecią sinusoid, ale nie zaludnionych komórek krwiotwórczych. Tak więc wyniki uzyskane były podobne do tych uzyskanych za pomocą przeszczepu klonów na żelu kolagenowego. Jeśli jednak transplantacja klony hoduje się w podłożu powoduje wytwarzanie tkanki szpiku 5% kości - 15%, a tkanina siatkowa - w 80% przypadków, monoklonalne przeszczep szczepów tworzenie komórek szpiku kostnego stwierdzono w 14% przypadków kości - w 53% i siatkowaty - w 53% przypadków. Według autorów, oznacza to, że warunki realizacji proliferacyjnych i różnicowania potencjałów fibroblastów zrębowych, gdy przeszczepiono na porowate rusztowania bardziej korzystna niż ich przeszczepów kości i obejmuje podłoża kolagenu. Nie jest wykluczone, że korzystanie z bardziej zaawansowanych metod uprawy i przeszczepiania klonów sprzężenia zwrotnego może poprawić warunki dla realizacji swoich klonów potencjałów różnicowania i zmiany tych relacji. Tak czy inaczej, ale główną wartością badań polega na tym, że niektóre z klonów zrębu komórki zdolne do tworzenia tkanki kostnej, przy jednoczesnym zapewnieniu podścieliska krwiotwórczego mikrośrodowiska natychmiast do trzech kapusty krwi szpiku kostnego: erytroidalnych, białaczkę szpikową i megakariocytów, tworząc dość duże przyczółki krwiotwórczych tkanki i trochę masy kostnej.

Ponadto autorzy rozwiązali problem zdolności do różnicowania tych typów komórek poszczególnych klonalnych komórek progenitorowych zrębu w warunkach zamkniętego układu komór dyfuzyjnych. Ponadto, konieczne było, aby określić, czy poszczególne klony pluripotencjalnych wykazują lub wyświetlaczu potencjał różnicowania wymaga współpracy interakcji kilku klonów o stałym znaku cytodifferentiation, inny stosunek, który określa preferencyjnego tworzenia kości, chrząstki lub siateczkowego. Łącząc dwa podejścia metodologicznych - monoklonalne izoluje kostne komórki progenitorowe zrębu szpiku kostnego i przenieść je do komór dyfuzyjnych Chailakhyan R. Et al (2001) Otrzymane wyniki, które dopuszczany do zrozumienia organizacji strukturalnej zrębu szpiku kostnego. Przeszczepiania monoklonalne szczepy zrębowych komórek progenitorowych do komórek typu O w wyniku formowania zarówno w tkance kostnej i tkanki chrzęstnej, wykazując zdolność potomstwo jednej komórki zrębu tworzących kolonie jednocześnie tworzących kości i chrząstki. Założenie, że tkanki kostne i chrząstkowe pochodzą ze wspólnej komórki progenitorowej zrębu, było wielokrotnie wyrażane wielokrotnie. Jednak ta hipoteza nie miała prawidłowego potwierdzenia eksperymentalnego. Tworzenie się kości i chrząstki w komorach dyfuzyjnych było niezbędnym dowodem na istnienie wśród komórek macierzystych zrębu szpiku wspólnej komórki prekursorowej dla tych dwóch rodzajów tkanki.

Następnie 29 klonalnych szczepów drugiego i trzeciego pasażu uzyskanych z pierwotnych hodowli szpiku królika umieszczono w komorach dyfuzyjnych i wszczepiono dootrzewnowo homologiczne zwierzęta. Badania wykazały, że 45% szczepów monoklonalnych szpiku kostnego ma osteogeniczną moc. Wyjątkowo tkanka siatkowa zawierała 9 komór, ale razem z tkanką kostną i chrzęstną była obecna w 13 dalszych komorach, co stanowiło 76% wszystkich szczepów. W komorach typu O, gdzie możliwe było różnicowanie zarówno tkanki kostnej, jak i chrząstki, badano 16 szczepów. W czterech komorach (25%) utworzono zarówno tkankę kostną, jak i chrzęstną. Należy ponownie zauważyć, że badania Chailakhyan R. I inni (2001) Poszczególne komórki progenitorowe poddano szczep komórkowy składający się z od 31 do 34 podwojeń i ich potomstwo było 0.9-2.0 x 10 ⁹ komórek. Liczba mitoz, którym eksponowano komórki prekursorowe szczepów poliklonalnych była praktycznie taka sama jak liczba komórek szczepów monoklonalnych. Jednocześnie tempo rozwoju szczepów poliklonalnych, zwłaszcza w pierwszej fazie ich powstawania, zależało w znacznym stopniu od liczby kolonii użytych do zainicjowania szczepów. Diploidalne szczepy ludzkich zarodkowych fibroblastów (WI-38) po ponownym utworzeniu na 12-15 poziomach duplikacji również utworzyły kolonie, które różnią się średnicą i zawartością komórek w nich. Duże kolonie zawierające więcej niż 103 komórki wynosiły tylko 5-10%. Wraz ze wzrostem liczby podziałów zmniejszył się odsetek dużych kolonii. Mono- i poliklonalnych zrębu szpiku kostnego fibroblastów szczepy zachowały diploidalny chromosom wprowadzona po co najmniej 20 podwojeń i skłonność rozwój był porównywalny z dynamiką diploidalnych szczepów embrionalne fibroblastów. Analiza potencjału różnicowania poszczególnych komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego, przeprowadzona przez przeszczepienie szczepów monoklonalnych do komór dyfuzyjnych, wykazała, że połowa z nich jest osteogenna. Duże kolonie stanowiły 10% ich ogólnej liczby. W konsekwencji, liczba osteogennych komórek tworzących kolonie odpowiadała około 5% ich całkowitej populacji. W całkowitej masie osteogennych komórek progenitorowych zidentyfikowanych przez autorów, istniały komórki zdolne do jednoczesnego tworzenia tkanki kostnej i chrzęstnej. Po raz pierwszy stwierdzono, że w przypadku tych dwóch typów tkanek w organizmie dorosłego jest wspólnym komórki prekursorowe: 25% testowanych klonów utworzony przez podobne komórki oraz ich liczby w populacji komórek progenitorowych, nie mniej niż 2,5%.

W związku z tym transplantacja heterotopowa poszczególnych klonów fibroblastów szpiku kostnego otworzyła nowe aspekty organizacji strukturalnej populacji mezenchymalnych komórek progenitorowych. Znaleziono komórki zdolne do natychmiastowego przeniesienia konkretnego mikrośrodowiska dla wszystkich hemopoetycznych trzpienia a jednym z analizowanych klonów większych na różnych modelach wynosi od 5 do 15% (0,5-1,5% całkowitej liczby komórek progenitorowych zrębu wykrytego) komórek. Wraz z klonami, które niosą pełne mikrośrodowisko szpiku kostnego, istnieją komórki progenitorowe, które są określone tylko do osteogenezy, tworząc tkankę kostną w systemie otwartym, która nie wspiera rozwoju hemopozy. Ich liczba z całkowitej liczby komórek progenitorowych wynosi 1,5-3%. Niektóre z tych komórek mogą tworzyć tkanki kostne z ograniczonym okresem samodzielnej konserwacji. W konsekwencji populacja komórek progenitorowych zrębu jest heterogenna w swoim potencjale różnicowania. Wśród nich jest kategoria komórek, podnosząc rolę macierzystych komórek zrębowych, zdolnych do różnicowania się we wszystkich trzech wymiarach właściwych dla tkanki zrębu szpiku kostnego, tworząc kości, chrząstki i tkanki siatkowego. Dane te pozwalają nam mieć nadzieję, że z pomocą różnych markerów komórkowych będzie możliwa do określenia wkładu każdego typu komórek zrębu w mikrośrodowiska konkretnej organizacji i wspierania tworzenia się krwinek w kulturach Dexter.

Cechy mezenchymalnych komórek macierzystych

W ostatnich latach stwierdzono, że w stacjonarnych hodowlach szpiku kostnego mezenchymalne multipotentne komórki progenitorowe przedstawiono ograniczoną populację małych agranular komórek (komórki RS-1), charakteryzujących się niską zdolność kolonizacji i nieobecności Ki-67 ekspresji antygenu specyficznego dla dzielących się komórek. Parametry antygenowe dormantnyh RS-1, komórki są różne od widma zaangażowanych antygenów szybko dzielących się komórek progenitorowych zrębu. Stwierdzono, że wysoki odsetek proliferacji zaangażowanych komórek progenitorowych zaobserwowano jedynie w obecności komórek RS-1. Z kolei, RS-1 komórek zwiększa się szybkość wzrostu pod wpływem czynników wydzielanych przez najbardziej dojrzałych komórek progenitorowych pochodzących z mezenchymalnych multipotentne. Wydaje się, że komórki RS-1 są podklasą niezatwierdzonych MSC, które są zdolne do recyklingu. Odpornego do 5-fluorouracylu komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego charakteryzującą się małą zawartością RNA i wysokie poziomy ekspresji genu dekarboksylazy ornityny vitro - znacznik nie dzielących się komórek.

Intensywna reprodukcja komórek progenitorowych zrębu rozpoczyna się po utrwaleniu na podłożu. Gdy jest to wyrażone profil markerem słabo zróżnicowane komórki: SH2 (TGF-a z receptorem (3), SH3 (białko sygnalizacyjne domena), kolagen typu I i III fibronektyny receptora adhezji VCAM-1 (CD106) i ICAM (CD54), kadheryny-11 , CD44, CD71 (receptor transferyny), CD90, CD120a i CD124, ale bez ekspresję charakterystycznych markerów hematopoetycznych komórek macierzystych (CD34, CD14, CD45). Klonów wzrostu pozwala wielokrotnie pasażowano mezenchymalnych komórek macierzystych w celu wytworzenia kultura wielu genetycznie jednorodnej zrębu progenitorowych pluripotencjalne komórki. 2-3 przejście od ich liczby sięga 50-300 milionów. W kulturze wystarczającej gęstości po zatrzymaniu proliferację komórek zrębu progenitorowych, w przeciwieństwie do układu krwiotwórczego fibroblasty tkanki różnicowania na adipocyty, miocyty, komórki chrząstki i tkanki kostnej. Kombinacja tych trzech różnicowania sygnałów regulacyjnych obejmujący 1-metylo-izobutilksantin (indukujących powstawanie wewnątrzkomórkowego cAMP), deksametazon (inhibitor fosfolipazy a i C), indometacyna (inhibitor cyklooksygenazy, tromboksanu obniżenie aktywności i) obraca się adipocyty do 95% komórek mezenchymalnych progenitorów. Tworzenie adipocytów z niedojrzałych komórek zrębu potwierdziła ekspresję genu lipazy lipoproteinowej, histochemiczne identyfikacji apolipoprotein i receptorów peroksysomów. Komórki z tego samego klonu wpływ TGF-b w pożywce wolnej od surowicy tworzy jednorodną populację chondrocytów. Hodowlę komórek wielowarstwowej macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki charakteryzuje opracowano składający proteoglikanów i kolagenu typu II. Pożywka z kompleksem 10% sygnałów efektu różnicowania płodowej surowicy obejmującej B-glicerofosforan (donator nieorganicznego fosforanu), kwas askorbinowy i deksametazonu w tej samej kultury komórek progenitorowych zrębu progenitorowych prowadzi do tworzenia agregatów komórkowych. W tych komórkach, jest stopniowy wzrost aktywności i aktywności fosfatazy zasadowej osteopontyną, wskazując tworzenie mineralizacji kości, które komórki potwierdził stopniowy wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia.

Według niektórych, zdolność mezenchymalnych komórek macierzystych do dzielenia przez czas nieokreślony i odwzorowanie różnych rodzajów mezenchymalnych komórkach rodu w połączeniu z wysokim stopniem plastyczności. Przy podawaniu do komór lub białej mezenchymalnych komórek macierzystych migrować do przestrzeni śródmiąższowej tkanki nerwowej i różnicują się w linii komórek neuronalnych i glejowych pochodzących. Ponadto, nie ma informacji o MSC transdyferencjacji w hematopoetycznych komórek macierzystych zarówno w warunkach in vitro i in vivo. Bardziej szczegółowa analiza w niektórych badaniach określane wyjątkowo wysoką ciągliwość MSC, co przejawia się w ich zdolności do różnicowania w astrocyty, neurony, oligodendrocyty sercowego, mięśni gładkich i komórek mięśni szkieletowych. W wielu badaniach transdifferentsirovochnogo potencjał MSC, in vitro i in vivo wykazały, że multipotentne komórki prekursorowe mezenchymalnych pochodzenia szpiku kostnego terminalnie różnicowania się linie komórkowe, które tworzą kości, chrząstkę, mięsień, nerw i tkankę tłuszczową oraz ścięgien i zrębu, który wspiera się krwinek .

Jednakże, w innych badaniach, bez oznak restrykcyjnym pluripotencja genomu mezenchymalnych komórek macierzystych i nie mogą być wykryte populacje komórek progenitorowych zrębu, ale do sprawdzenia ewentualnych pluripotencjalnych komórek zrębowych zbadano ponad 200 klonów MSC wyizolowany z hodowli pierwotnej. Zdecydowana większość klonów vitro zachował zdolność do różnicowania się kościotwórcze, chondrogenną i adypogennych kierunkach. Bez uwzględnienia prawdopodobieństwa migracji komórek biorcy przeszczepu mezenchymalnych komórek macierzystych pod torebkę nerki lub w komorach dyfuzyjnych Okazało się, że komórki zrębowe progenitorowych in situ zachowują heterogenicznego fenotypu, co wskazuje bądź braku strefy przeszczepów czynników ograniczających lub nieobecność sam pluripotencjalnych MSC. Jednocześnie pozostawiono istnienie rzadką somatycznych pluripotencjalne komórki macierzyste, które są wspólne prekursory dorosłych komórek macierzystych.

Na wielo-, a nie prawdziwe pluripotentne mezenchymalne komórki macierzyste tworzą bardzo małą część komórek szpiku kostnego i są zdolne w pewnych okolicznościach, gdy jest hodowany in vitro proliferacji, bez wchodzenia do różnicowania, o czym świadczą ich indukowanego zaangażowania linie komórek w kościach, chrząstce, tkance tłuszczowej, tkance mięśniowej , jak również w tenocytach i zrębach wspomagających hematopoezę. Typowo, ciągłe wystawienie na pożywce hodowlanej z płodową surowicą cielęcą wywołuje MSC wyjściowe w zrębu zaangażowanych komórek progenitorowych, potomstwo, które ulega spontanicznej końcowe różnicowanie. W warunkach in vitro można osiągnąć kierunkową tworzenie osteoblastów dodając do kwaśnym klimatyzacji deksametazon, p-glicerofosforan i askorbinowego, a kombinacja sygnałów różnicowania deksametazon i insuliny wywołuje tworzenie się komórek tłuszczowych.

Ustalono, że przed wejściem do etapu końcowego różnicowania szpiku kostnego MSC stworzyć określone warunki hodowli początkowo różnicowania się komórek mezenchymalnych komórek macierzystych, jak fibroblasty. Pochodne tych komórek in vivo, które uczestniczą w tworzeniu kości, ścięgna, chrząstkę, tkanki tłuszczowej i tkanki mięśniowej, a także jako nośnik zrębu hematopoezy. Wielu autorów rozumieć termin „multipotencjalnych mezenchymalnych komórek progenitorowych” za faktycznie MSC, a zaangażowanych komórek progenitorowych zrębu szpiku kostnego i tkanek mezenchymalnych. Analiza klonalna wielokierunkowych mezenchymalnych komórek progenitorowych szpiku kostnego pochodzenia wykazały, że nieco więcej niż jedna trzecia klonów zróżnicowanej osteoporoza, hondro- i tłuszczowe, podczas gdy inne klony komórki kościotwórcze potencjał i formą tylko hondro- i osteocyty. Klon ten multipotencjalnych mezenchymalnych komórek prekursorowych jako wkładki 9, w odpowiednich warunkach w mikrośrodowisku różnicowane do komórek o fenotypie i funkcjonalne nie tylko w osteoblasty, chondrocyty i Adic potsitov ale komórki zrębowe, które wspierają się krwinek. Izolowane z płodowej komórek szpiku kostnego szczura klonowania RCJ3.1 zróżnicowane komórki mezenchymalne różnych fenotypów. Dzięki połączonemu działaniu kwasu askorbinowego, B-glicerofosforan i deksametazonu z elementów komórkowych z tego klonu najpierw wytwarza wielojądrowe miocytów i następnie kolejno, komórki tłuszczowe, komórki chrzęstne i wysepek kość zmineralizowana. Populacja komórkach ziarnistych z okostną płodów szczurzych odpowiada niezaangażowane wielokierunkowych mezenchymalnych komórek progenitorowych, co charakteryzuje się niską szybkość proliferacji nie wykazują ekspresji markerów różnicowania i zróżnicowany w warunkach hodowli w celu wytworzenia hondro-, osteoporoza i adipocyty i komórek mięśni gładkich.

Tak więc, należy rozumieć, że kwestia plyuri- lub multipotency genomu mezenchymalnych komórek macierzystych jest nadal otwarty, co w konsekwencji wpływa na prezentację potencjał różnicowania komórek progenitorowych zrębu, który również nie jest całkowicie zainstalowany.

Eksperymentalnie sprawdzoną i ważną cechą mezenchymalnych komórek macierzystych jest ich zdolność do opuszczania niszy tkanki i krąży w ogólnym strumieniu krwi. Aby aktywować program genetyczny różnicowania, takie krążące komórki macierzyste powinny należeć do odpowiedniego mikrośrodowiska. Wykazano, że gdy podaje się układowo do krwiobiegu zwierząt otrzymujących MSCs niedojrzałe komórki wszczepione w różnych narządach i tkankach, a zróżnicowane na komórki krwi, miocyty, komórki tłuszczowe, chondrocyty i fibroblasty. W konsekwencji, w lokalnych obszarach tkanki występuje oddziaływanie sygnału regulacyjnego zaangażowanych i niezaangażowane komórek progenitorowych zrębu, jak również między nimi a otaczające dojrzałych komórek. Zakłada się, że indukcja różnicowania prowadzi parakrynne czynniki regulacyjne, mezenchymalnych i nemezenhimalnogo (czynniki wzrostu, eikozanoidów, pozakomórkowych cząsteczek matrycowych), które zapewniają przestrzenne i czasowe relacje w mikrośrodowisku wielopotencjalnych mezenchymalnych komórek progenitorowych. W związku z tym lokalne uszkodzenia tkanki mezenchymalnego powinna prowadzić do wytworzenia a strefy mikrośrodowiska multipotentne mezenchymalne komórki prekursorowe różnić jakościowo od zespolonych sygnałów regulacyjnych nienaruszonych tkankach, w których procesy fizjologiczne wystąpić zamiast reparacyjnej regeneracji. Ta różnica jest niezwykle ważna, jeśli chodzi o specjalizację fenotypu komórki w normalnym i wywołanym przez uszkodzenie mikrośrodowisku.

Zgodnie z ideami, właśnie tutaj położono mechanizmy fundamentalnej różnicy dwóch znanych procesów - regeneracji fizjologicznej i proliferacji zapalnej. Pierwszy z nich kończy się przywracaniem wyspecjalizowanej kompozycji komórkowej tkanki i jej funkcją, podczas gdy wynikiem procesu proliferacji jest tworzenie dojrzałych elementów tkanki łącznej i utrata funkcji uszkodzonej strefy tkankowej. Tak więc, w celu opracowania optymalnych programów do stosowania multipotencjalnych mezenchymalnych komórek progenitorowych w medycynie regeneratywno-plastycznej, konieczne jest dokładne zbadanie cech wpływu czynników mikrootoczenia na różnicowanie MSC.

Zależność struktury przedziału komórek macierzystych od komórkowych regulatorów para- i autokrynnych, których ekspresja jest modulowana sygnałami zewnętrznymi, nikt nie wątpi. Wśród funkcji czynników regulacyjnych najważniejsza jest kontrola asymetrycznego podziału MSC i ekspresji genów determinujących etapy prowokacji i liczby podziałów komórkowych. Sygnały zewnętrzne, od których zależy dalszy rozwój MSC, zapewniają ich mikrośrodowisko. W niedojrzałych MSC rozmnażać wystarczająco długi czas, przy zachowaniu zdolności do różnicowania w adipocyty linii miofibroblastów, krwiopochodnej tkanki zrębowej, komórki chrząstki i kości. Stwierdzono, że ograniczone populacji krążących SB34 ujemnych elementów komórek zrębowych z krążenia ogólnego zawraca się do tkanki zrębu szpiku kostnego, przekształca się w linii, gdzie krwiotwórczych komórek macierzystych, komórek CD34-dodatnich. Obserwacje te sugerują, że recyrkulacja progenitorowych komórek mezenchymalnych w krwioobiegu tkanki zapewnia wsparcie dla stanu komórek macierzystych zrębu w różnych narządach przez mobilizowanie wspólnej puli niedojrzałych komórek zrębu szpiku kostnego. MSC różnicowanie do komórek o wielu fenotypowych mezenchymalnych oraz ich udział w naprawie lub regeneracji chrząstki kości, ścięgna i tkanki tłuszczowej in vivo wykazano przez przybranych modelu transferu na zwierzętach doświadczalnych. Według innych autorów, odległe migracja MSC łożysku naczyniowym w połączeniu z lokalną przemieszczenia lub korotkodistantnym wielokierunkowych prekursorowych komórek mezenchymalnych w tkance chrząstki do naprawy, regeneracji mięśni, i inne reakcje redukcji.

Rezerwy lokalne fundacje macierzystych tkanki zrębowej odgrywać rolę źródła komórek w fizjologicznych procesach regeneracji tkanek i są uzupełniane przez odległe MSC transportowych jak wydatki zrębu zasobów macierzystych tkanki. Jednakże, konieczność awaryjnego mobilizacji komórek reparacyjnej pojemności, takich jak stwardnienie urazu w naprawczych procesach regeneracji uczestniczy MSCs całego pociągu, a brzegi w krwiobiegu rekrutacji komórek prekursorowych mezenchymalnych szpiku kostnego.

Transplantacja mezenchymalnych komórek macierzystych

Istnieją pewne podobieństwa między procesami fizjologicznej regeneracji tkanek i ich powstawaniem w okresie rozwoju wewnątrzmacicznego. Embriogeneza ludzi i ssaków, tworzenie różnych typów wyspecjalizowanych komórek pochodzących z ekto, mezo i endodermalnym kiełków warstw basenu, ale z obowiązkowym udziałem mezenchymy. Luźna sieć komórkowa embrionalnej tkanki mezenchymalnej spełnia liczne funkcje regulatorowe, metaboliczne, szkieletowe i morfogenetyczne. Zakładki prowizoryczne organów jest wykonywane tylko po mezenchymy skraplania kosztem wzrostu klonogenna komórek progenitorowych, które wytwarzają podstawową organogenezy sygnałów morfogenetyczne. Zrębowe pochodne zarodkowego mezenchymu tworzą komórkową strukturę prowizorycznych narządów i stanowią podstawę dla ich przyszłego zaopatrzenia w energię dzięki rosnącej pierwotnej krwi i naczyniom limfatycznym. Innymi słowy, elementy podścieliska mikrokrążenia narządów płodowych pojawiają się przed utworzeniem ich jednostek strukturalno-funkcjonalnych. Ponadto aktywna migracja komórek mezenchymalnych podczas organogenezy zapewnia przestrzenną orientację rozwijających się narządów ze względu na oznaczanie granic ich objętości przez ograniczenie homeotycznych Noch-Teps. Na szkielecie podścieliska znajduje się również zestaw strukturalnych i funkcjonalnych jednostek narządów miąższowych, które często zawierają morfogenetycznie i funkcjonalnie zupełnie różne komórki. W konsekwencji, w embriogenezie funkcje mezenchymalne są pierwotne i są realizowane poprzez generowanie sygnałów regulatorowych, które aktywują regionalną proliferację i różnicowanie komórek nabłonka progenidalnego. Embrionalne komórki mezenchymowe wytwarzają czynniki wzrostu, takie jak LEG, HGF-b, CSF, dla których komórki progenitorowe miąższu mają odpowiednie receptory. W dojrzałej dojrzałej tkance dorosłego organizmu sieć komórek zrębowych również generuje sygnały w celu utrzymania żywotności i proliferacji komórek progenitorowych pochodzenia nie-mezenchymalnego. Jednakże, widmo zrębu sygnały regulacyjne w poporodowym ontogenezy inne (SCF HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, FLT-3, LIF itp.) I ma na celu zapewnienie fizjologicznej regeneracji lub naprawy uszkodzonych obszarów tkanek. Co więcej, charakterystyka spektralna czynników regulatorowych zrębu w każdym rodzaju tkanki, a nawet w tym samym narządzie, jest różna. W szczególności, hematopoezy i limfopoezy do namnażania i różnicowania hematopoetycznych komórek immunokompetentnych i zachodzi tylko w pewnych narządów, w których działa zrębu mikrośrodowiska zapewniający warunki dojrzewania komórek krwiotwórczych i limfatycznej. Z czynników regulujących mikrośrodowisko wynika, że zdolność komórek krwiotwórczych i limfoidalnych do ponownego zaludnienia tego narządu, proliferacji i dojrzewania w niszach mikrostrukturalnych zależy.

Wśród składników macierzy zewnątrzkomórkowej, które wytwarzają multipotencjalnych komórek prekursorowych mezenchymalnych, należy zauważyć, fibronektyny, lamininy, kolagenu oraz proteoglikanów, jak i CD44 (hialuronian i receptora osteopontyna) odbieranie główną rolę w organizacji międzykomórkowej oddziaływania i tworzenia pozakomórkowej matrycy w szpiku kostnego i kości . Jest udowodnione, że mezenchymalnych szpiku kostnego, komórki multipotentne tworzyć redshestvenniki zrębu mikrośrodowiska, zapewniając indukcyjnych i regulacji sygnałów nie tylko MSC, ale również i nemezenhimalnye prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych szpiku kości. Wiadomym jest, że MSC włączone w hematopoezę mierzone poprzez ich zdolność do różnicowania się w komórki zrębowe, które wspierają się krwinek, w którym aktywny sygnał wytyczne MSK otrzymanych bezpośrednio z krwiotwórczych komórek macierzystych. Dlatego kultura sieciowych komórek progenitorowych zrębu jest podstawą do karmienia wszystkich klonów komórek krwiotwórczych.

W dojrzałym organizmie intensywności hemodializy limfopoezy i w stanie równowagi dynamicznej z „wydatków” dojrzałych komórek krwi i komórek układu odpornościowego w obwodzie. Ponieważ komórki podścieliska szpiku kostnego i narządów limfatycznych rzadko aktualizowane, znaczących struktur restrukturyzacja zrębowe nie występują w nich. Doprowadzić system dynamicznej równowagi jest możliwe przy pomocy mechanicznego uszkodzenia wszelkie narządy Hemo lub Limfopoeza, co prowadzi do tego samego rodzaju kolejnych zmianach, które mają wpływ nie tylko i nie tyle komórek krwiotwórczych lub limfatycznych, jak konstrukcje zrębowe uszkodzenia narządu. W procesie regeneracji reparacyjnej głównie utworzone ramy zrębu, który następnie ponownie zasiedlające krwiotwórczego lub komórek odpornościowych. Ten długi znany fakt sprawia pourazowej regeneracji dogodnym modelem do badania mikrośrodowiska zrębowej narządów krwiotwórczych. W szczególności, do badania reparacyjnej regeneracji szpiku kostnego stosuje się mechaniczne opróżniania jamę szpikową kości długich - łyżeczkowanie, co pozwala na szybkie i skuteczne dostosowanie tkanki krwiotwórcze od stanu równowagi dynamicznej. Przy badaniu procesu reparacyjnej regeneracji szpiku krwiotwórczego i kostnego zrębu kości składników po mechanicznym opróżniania rdzeniowej jamie kości piszczelowej świnki morskiej wykazały, że pomiędzy wskaźnikami regeneracji komórek krwiotwórczych i zrębu (liczba komórek krwiotwórczych, stężenie i ilość komórek zrębu progenitorowych) nie ma bezpośredniej korelacji. Ponadto, stwierdzono, że wzrost w populacji komórek progenitorowych zrębu pojawia się wcześniej po łyżeczkowanie i same zrębu fibroblasty fosfatazopolozhitelnymi, która jest charakterystyczna dla tkanki osteogennego. Ustalono również, że łyżeczkowanie 3-5 długie kości prowadzi do wzrostu populacji komórek w szpiku kostnym, a nie mechanicznie kości, nawet w śledzionie, co u świnek morskich jest tylko krwiotwórczego ciała.

Morfologiczne procesy obraz naprawcze w szpiku kostnym kyuretirovannyh piszczelowe świnki ogólnie odpowiadającym danymi literaturowymi uzyskanych w doświadczeniach na zwierzętach z innych gatunków, dynamika zmian zachodzących po pobraniu tkanki krwiotwórczej jest taka sama dla wszystkich gatunków, różnica dotyczy jedynie parametrów czasowych . Morfologicznie procedury faza przywracania krwinek w jamę szpikową są opróżniane w kolejnych procesach organizowania powstawanie skrzepów krwi kości zgrubne włókna, jego resorpcji sinusoid i siatkowego tworzenie zrębu, który dodatkowo zasiedlających elementów krwiotwórczych. Liczba krwiotwórczych komórek progenitorowych w szpiku kostnym proces regeneracji tkanki wzrasta w równoległy wzrost zawartości krwiotwórczych komórek macierzystych.

Gierasimow Yu i inni (2001) w stosunku do zmian w liczbie komórek hematopoetycznych i ilości prekursorów komórek zrębowych na poszczególnych etapach procesu regeneracji. Stwierdzono, że ilościowe zmiany w komórkach szpiku kostnego w kyuretirovannoy odpowiada dynamiką charakterystyką morfologiczną regeneracji. Redukcji w ciągu pierwszych trzech dni od zawartości komórki w regeneratu autorów przypisują utratę komórek krwiotwórczych z powodu niekorzystnych efektów mikrośrodowiska, które tworzy tkanki siatkowy rośnie w pozostałej szpiku kostnego u nasady oraz w drugi tworząc skupiska kostniak i uszkodzeń naczyniowych łyżeczkowanie. 7-12 dobie podnoszenia komórki yaderosoderzhaschih pokrywa się z wyglądu poszczególnych ognisk komórek mieloidalnych krwiotwórczych komórek zrębu stref proliferacji. 20. Dnia istnieją znaczne fragmenty zregenerowanego szpiku kostnego i dobrze rozwiniętych zatok, która towarzyszy znaczny wzrost całkowitej liczby komórek. Jednak liczba elementów hematopoetycznych w tym okresie wynosi 68% poziomu kontroli. Jest to zgodne z wcześniej opublikowanych danych wykazujących, że liczba komórek krwiotwórczych po łyżeczkowanie osiągnie standardy zaledwie 35-40 dni po operacji.

We wczesnym okresie pourazowym głównym komórkowym źródłem przywrócenia hemopozy są elementy komórkowe zachowane w łyżeczkach. Później głównym źródłem regeneracji tkanki krwiotwórczej szpiku kostnego są komórki macierzyste, które ponownie zaludniają wolne strefy zrębowe. W przypadku niektórych kategorii komórek zrębu (śródbłonka, siatkowatego i osteogennego), źródła zapewniające ich powstawanie podczas rekonstrukcji jamy szpikowej pozostają niewyjaśnione. Wyniki Yu.V. Gerasimov i współautorzy (2001) zaświadczają, że w szpiku kostnym zakonserwowanym po wyłyżnięciu stężenie komórek tworzących kolonie fibroblastów jest znacznie wyższe niż w prawidłowym szpiku kostnym. Autorzy uważają, że w łyżeczkowanie jest bardziej intensywne selektywne wymycie komórek krwiotwórczych, w porównaniu ze zrębu tworzących kolonie komórek, które są zaangażowane w tworzenie zrębu, a mocniej związane z substancji zasadowych niż komórek krwiotwórczych.

Dynamika zmian liczby komórek tworzących kolonie fibroblastów skorelowana z intensywnością procesów osteogenezy następnie beleczkowatej resorpcja kości i jej tworzenie siatkowy zrębu zamieszkujące komórek krwiotwórczych. Większość zrębowych komórek progenitorowych tworzy gruboziarnistą tkankę kostną i zrąb siatkowaty we wskazanych czasach regeneracji. Złamań kości udowej, w warunkach długotrwałego osteosyntezy na 5 dni w strefie regeneracji zwiększa gęstość komórek i liczbę tworzących kolonie fibroblastów i tworzenia kości intensywnej ich liczba zwiększa się o 6 razy. Wiadomo, że komórki szpiku kostnego tworzące kolonie fibroblastów mają właściwości osteogeniczne. Liczba komórek progenitorowych zrębu wzrasta przed kolonizacją obszaru kory brukowanej przez komórki krwiotwórcze. Jest to w zgodzie z dowodami na to, że komórki zrębowe zapewniają tworzenie mikrośrodowiska hematopoetycznego. Oczywiście, stworzenie układu krwiotwórczego mikrośrodowiska odpowiada pewnym poziomie regeneracji tkanki zrębowej i zwiększa liczbę komórek krwiotwórczych na skutek rozszerzalności cieplnej nadaje się do zrębu przyczółek hematopoezy.

Największym zainteresowaniem cieszą się dane autorów, że bezpośrednio po wyłyżnięciu wzrasta liczba komórek progenitorowych zrębu w odległych częściach szkieletu. Począwszy od godziny szóstej i dwudziestym dniu włącznie z przeciwnej piszczelowej obserwuje się w ponad dwukrotne zwiększenie stężeń i liczby komórek tworzących kolonie fibroblastów. Mechanizm tego zjawiska jest prawdopodobnie związane z faktem, że masowe uszkodzenie szpiku kostnego, co powoduje wytworzenie dużej liczby zakrzepów jednocześnie zniszczenia znacznej liczby płytek krwi i uwolnienie do krwi, płytkopochodnego czynnika wzrostu (RBSK), o którym wiadomo, powodują proliferację komórek tworzących kolonie fibroblasty znajdujące się w organizmie poza pulą proliferacyjną. W doświadczeniach na królikach lokalne podawanie MSC wspiera przywrócenie chirurgicznie uszkodzonej chrząstki stawowej kolana, które mogą być związane z wytworzeniem chondrocytów pochodzących z MSCs wprowadzonych. Jednakże reparacyjna regeneracja ubytków kostnych u szczurów laboratoryjnych jest znacznie wzmocniona przez zastosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych zamkniętych w szkielecie ceramicznym. W związku z tym, możemy założyć, że jeśli nie RBOK, wtedy każdy inny czynnik, pochodzące z uszkodzonych komórek podścieliska, ma odległy efekt stymulujący na proliferację komórek progenitorowych mezenchymalnych w nienaruszonych obszarów w szpiku kostnym i stymuluje ich migrację do obszaru tkanki szpiku kostnego wada. Z kolei, to w przeciwieństwie do danych literaturowych z poprzednich lat, co wskazuje, że komórki zrębowe są odpowiedzialne za mikrośrodowiska, w przeciwieństwie do komórek krwiotwórczych nie są w stanie migrować i pochodzą z lokalnych źródeł.

Niemniej jednak wyniki badania Gerasimov Yu et al (2001) sugerują, że stosowanie urazu mechanicznego powoduje nie tylko ostrą restrukturyzację tkanki zrębowej w kościach kyuretirovannoy, ale również istotnych zmian w zrębie odległych kości w stanie nienaruszonym, oznacza to, że jest to odpowiedź ogólnoustrojową tkanka podścieliska na miejscowy uraz. I kiedy są stosowane urazie - wiele łyżeczkowanie - reakcja ta jest wzmacniany i obserwuje się nie tylko w operowanej kości i oddalonych części szkieletu, a także w narządach limfoidalnych, w szczególności w śledzionie. Mechanizm takiej ogólnoustrojowej odpowiedzi tkanki zrębu szpiku kostnego i śledziony na miejscowy uraz i uraz wielonarządowy pozostaje nieznany. Zakłada się, że proces ten jest związany z działaniem czynnika humoralnego uwalnianego przez mezenchymalny zrąb jamy szpikowej szpiku kostnego. Możliwość wytworzenia komórek zrębu szpiku kostnego i śledziony, organonespetsificheskogo humoralną czynnik odpowiedzialny za proliferację komórek tworzących kolonie fibroblastów wskazują dane o aktywności stymulującej kolonię w jednowarstwowych hodowlach szpiku kostnego.

W związku z tym, warto zauważyć, że przy podawaniu systemowym multipotencjalnych komórek prekursorowych mezenchymalnych zasiedlających ich pochodne nie tylko szpiku kostnego, ale również w innych tkankach, które są stosowane zwłaszcza w terapii genowej. Wykazano, że po dożylnym podaniu dużych ilości MSC z genomem myszy typu dzikiego komórkami mutant genu kolagenu I dawców zastąpić do 30% komórek w tkance kostnej i chrzęstnej tkanek biorcy, oraz transfekcji mezenchymalnych komórek mysich macierzystych wydzielających IL-3 człowieka, przez 9 miesięcy skutecznie wspiera się krwinek w przypadku ich równoczesnego stosowania z ludzkich krwiotwórczych komórek macierzystych do myszy z niedoborem odporności.

[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]

Modyfikacje genetyczne mezenchymalnych komórek macierzystych

Dodatkowe doświadczalne sukces modyfikacji genetycznej należy zauważyć transfekcji MSCs czynnik IX genu w ludzkich MSCs następnie przez przeniesienie komórek transfektantów myszy z niedoborem odporności, co prowadzi do pojawienia się w krwi Antihemophilic czynnika B przez 8 tygodni po transplantacji. W tym doświadczeniu dokonano posttranslacyjnej modyfikacji czynnika IX za pomocą karboksylazy y-glutamylowej w transfekowanych komórkach. Transdukcja MSC retrowirusowym wektorem kodującym ludzki czynnik IX jest mniej skuteczne - późniejsze wprowadzanie tych komórek z hemofilią psa terapeutycznego poziomu czynnika IX, który wspomaga prawidłowe natężenie krzepnięcia hemostazy tylko przez 12 dni.

Przeszczepianie mezenchymalnych komórek macierzystych do miąższu mózgu zwierząt wykazało, że niedojrzałe komórki dawcy są transformowane zarówno w populacji neuronów, jak i glej. Wszczepienie neuronalnych pochodnych zdrowej tkanki mezenchymalnej dawcy teoretycznie umożliwia korygowanie genetycznych zaburzeń metabolizmu mózgu u pacjentów z chorobą Gauchers i innymi zaburzeniami metabolizmu lipidów, gangliozydów lub węglowodanów.

Kontynuując Warunki eksperymentalne wyszukiwania transdyferencjacji komórek macierzystych w szpiku kostnym komórki prekursorowe zrębu w tkance nerwowej i wątroby. Uwaga badaczy skupia się na kombinacjach induktorów różnicowania i specjalnych mediów kondycjonujących. W szczególności do izolacji hodowli pierwotnej z 10% płodowej surowicy cielęcej, komórki zrębu szpiku kostnego, przemywano i ponownie zawieszano w pożywce DMEM / F12 z hodowli (1/1) wysiano w gęstości 200,000 / cm2. Po 24 godzinach nie przylegające komórki są usuwane, a komórki podobne do fibroblastów przyczepione do tworzywa sztucznego są hodowane przez jeden tydzień. Do różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego do neuroblastów stosowanych kondycjonowaną pożywkę uzyskaną poprzez hodowanie trzydniowej kultury podstawowej mysich embrionalnych fibroblastów, a także między DMEM / F12 (1/1) z 2% płodowej surowicy bydlęcej i uzupełnionym 20 ng / ml lub od 10-6 M LiF kwas retinowy (neuroinduktory, które są stosowane do różnicowania neuronów mysich i ludzkich zarodkowych komórek macierzystych). Różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego do komórek potomnych do hepatocytów indukowana kondycjonowanego środowiska powstałą w wyniku trzy dni hodowli posiewowej embrionalnych komórek wątrobowych myszy w pożywce DMEM / F12 (1/1), uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej.

W tym miejscu należy ponownie zauważyć, że komórki tworzące kolonie ze szpiku kostnego są heteromorficzne i można je podzielić na dwa typy. Pierwszy typ obejmuje komórki podobne do fibroblastów, które tworzą komórki filopodia z dużymi jądrami i jednym lub dwoma jąderkami. Drugi typ jest reprezentowany przez małe komórki o kształcie wrzeciona. W obu rodzajach hodowli komórkowej w kondycjonowanej pożywce otrzymanej na warstwie odżywczej fibroblastów embrionów mysich podstawowej, i Z-4-tym dniu hodowli komórki przypominać neuroblastów. Na tym etapie często mają one kształt wrzeciona z jednym lub dwoma długimi procesami zakończonymi filopodią. Komórki piramidalne lub gwiaździste z krótkimi dendrytami są mniej powszechne. Dendryty niektórych neuroblastów mają charakterystyczne przedłużenia (pąki wzrostu) i rozgałęzienia w ich dalszej części, inne - odrębne szyszki wzrostu z filopodią, z którymi występuje wzrost dendrytów. Podobne cechy morfologiczne (stożki wzrostu i nerek Filopodia a) właściwej nerwiak, wyróżniają się w neurony, są opisane w dokumentach przez neurogenezy. Na tej podstawie niektórzy autorzy dochodzą do wniosku, że komórki, które wykrywają w hodowli, to neuroblasty. W szczególności Schegelskaya E. I inni (2002), po pierwotnej hodowli komórek zrębu hodowano przez dwa tygodnie na każdym wymiennym Z-i-4 dnia pożywki kondycjonowanej okazało się, że udział dzielących się komórek, przy zachowaniu stanu niezróżnicowany. Zewnętrznie, takie komórki wyglądały jak fibroblasty i zostały zidentyfikowane w kulturze wraz z różnicowaniem neuroblastów. Większość komórek (około 80%) znajdowała się na różnych etapach różnicowania się w komórki tkanki nerwowej, głównie w neurony. Dendrytyczne procesach tych komórek w bliskim kontakcie ze sobą tak, że stopniowo komórki utworzone w częściach podłoża sieci neuronowej, w postaci długich pasm wielokomórkowych. Dendrytyczne procesy neuroblastów rosły znacznie dłużej, niektóre z nich były 8-10 razy większe niż długość ciała samego neuronu. Stopniowo wzrósł udział komórek piramidalnych i gwiaździstych. Dendrytów komórek gwiaździstych rozgałęzionych. Według autorów późniejsze różnicowanie komórek piramidalnych i gwiaździstych w porównaniu do wrzecionowatych kształtuje się w sekwencji etapów prawidłowej neurogenezy u zwierząt. W rezultacie autorzy wyciągnęli wniosek, że komórki macierzyste zrębu szpiku kostnego ulegają indukowanej neurogenezie, podczas której in vitro z neuroblastów powstają wszystkie główne typy neuronów. Poprzednicy komórek nerwowych wykryto także podczas hodowli komórek zrębu szpiku kostnego przez 3-4 dni w pożywce z 2% surowicą płodową i 20 ng / ml LIF. Ale w tym przypadku komórki macierzyste dzieliły się bardzo powoli, różnicowanie neuroblastów wystąpiło tylko w 30% przypadków i nie tworzyło sieci neuronowych. Stosując jako komórki nerwowej induktorami różnicowania kwasem retinowym, autorzy uzyskanych w hodowli na 25-30% komórek nerwowych z przewagą komórek glejowych - astrocytów i oligodendrocytów. Neurony stanowiły tylko jedną trzecią wszystkich komórek nerwowych, chociaż były reprezentowane przez wszystkie trzy typy: komórki wrzecionowate, piramidalne i gwiaździste. W 6 dniu komórek zrębu hodowli w pożywce dla komórek nerwowych kwasu retinowego się bardziej zróżnicowana, podczas gdy poszczególne aksonów w neuronach piramidowych znaleziono, że w normalnej neuroontogenesis się później tworzenie dendrytycznych procesów. Według autorów, pomimo niskiego uzysku komórek nerwowych, sposób indukowania kwasu retinowego zalety: astrocytów i oligodendrocytów i myelinating obsługiwać funkcje podające podczas wzrostu aksonów i dendrytów i są niezbędne do normalnego tworzenia tkanki nerwowej. Dlatego, aby naprawić uszkodzone miejsca in vivo, lepiej jest zastosować zawiesinę neuronów wzbogaconą o komórki glejowe.

W drugiej serii eksperymentów autorzy próbowali indukować różnicowanie komórek zrębowych szpiku kostnego do komórek wątroby. Po trzech dniach hodowli komórek zrębu szpiku kostnego macierzystych w kondycjonowanej pożywce otrzymanej przez inkubację hepatocyty mysie zarodkowe duże, kuliste w kształcie komórki stwierdzono, często dwa jądrowe, cytoplazmatyczne wtrącenia o różnych rozmiarach. Komórki te były na różnych etapach różnicowania i różniły się wielkością, liczbą jąder i inkluzjami w cytoplazmie. W większości tych komórek wykryto glikogen, na podstawie którego autorzy zidentyfikowali je jako komórki progenitorowe hepatocytów. Od kultury bez komórek wykrywano podobne do neuroblastów, a następnie wniosku, że w kondycjonowanej pożywce otrzymanej przez hodowanie zarodkowych hepatocytów, brak czynników różnicowania komórek nerwowych, i odwrotnie, są czynnikami, które wywołują różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego w komórkach progenitorowych hepatocytów . Autorzy sugerują obecność komórek pluripotencjalnych od zrębu szpiku kostnego, ponieważ różnicowanie się in vitro do komórek tkanek wątroby lub nerwowych, w zależności od konkretnych kondycjonowanej pożywki i cewki.

W niektórych pracach właściwie pokazano różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego w kardiomiocyty, komórki chrząstki, kości i tkanki nerwowej. Istnieje informacja, że wśród komórek szpiku kostnego znajdują się populacje komórek macierzystych, które mogą różnicować się w hepatocyty. W świetle tych danych, wyniki powyższych doświadczeń na myszach można jeszcze uznać za kolejne potwierdzenie obecności w szpiku kostnym pluripotencjalnych mezenchymalnych komórek macierzystych, które mają zdolność różnicowania się w komórki różnych tkanek organizmu dorosłego.

Transplantacja mezenchymalnych komórek macierzystych

Klinicznej transplantacji komórek macierzystych ludzkiego mezenchymalnych można stosować do ekspansji krwiotwórczych komórek macierzystych i ich potomstwo prekommitirovannyh początku. W szczególności wprowadzenie autologicznych komórek macierzystych układu krwiotwórczego u pacjentów z rakiem i MSC po chemioterapii o wysokiej prędkości do zdrowia w neutrofilach i płytek krwi obwodowej. Autologiczne allogenicznej transplantacji mezenchymalnych komórek macierzystych, stosowanych w leczeniu szpiczaka mnogiego, niedokrwistość aplastyczna, trombocytopenia spontaniczne - choroby związane z defektami pierwotnej tkanki zrębu układu krwiotwórczego. Skuteczność terapii komórkowej w patologiach układu krwiotwórczego w wielu przypadkach powyżej, podczas gdy wprowadzenie zrębowe i krwiotwórczych komórek macierzystych, co przejawia się redukcji pooperacyjnych okresie odzysku, krwi, zmniejszenie liczby zgonów z powodu braku selektywnego niszczenia regionalnych i krążących komórek nowotworowych, w którym matryca i własną progenitorowych komórek hematopoetycznych pacjenta. MSC obiecujące aplikacji i inne mezenchymalne multipotencjalnych komórek prekursorowych w praktyce klinicznej z uwagi na ich względną łatwość uzyskania aspiraty szpiku kostnego w hodowli, rozprężania i transfekcji genu terapeutycznego. Tak więc w celu skompensowania ubytków tkanki lokalne może korzystać z lokalnego implantacji wielokierunkowych mezenchymalnych komórek macierzystych krwi i w układowej zaburzenia tkanek pochodzenia mezenchymalnego, nie jest wykluczone, ich wprowadzania do krążenia ogólnego.

Bardziej ostrożny w swoich argumentów autorów prac, w których perspektywy MSC lokalnych, układowej transplantacji i terapii genowej są analizowane z punktu widzenia biologii komórek podścieliska. Postnatalny szpik kostny jest tradycyjnie uważany za organ składający się z dwóch głównych układów wyraźnie wyrażanych linii komórkowych - rzeczywistej tkanki krwiotwórczej i związanego z nią podścieliska podtrzymującego. Dlatego mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego początkowo traktowano wyłącznie jako źródło podścieliska do produkcji czynników regulatorowych w mikrośrodowisku krwiotwórczym. Następnie uwaga badaczy przestawiła się na badanie roli MSC jako źródła trzonu tkanek szkieletowych. Najnowsze dane wskazują na nieoczekiwany potencjał różnicowania komórek zrębowych szpiku kostnego z tworzeniem tkanki nerwowej lub mięśniowej. Innymi słowy, mezenchymalne komórki macierzyste wykazują plastyczność transgermalną - zdolność różnicowania się w typy komórkowe, które są fenotypowo niezwiązane z komórkami pierwotnej tkanki. Jednak niektóre aspekty biologii komórki zrębowe szpiku kostnego pozostają niejasne nierozwiązany w planie ogólnym biologicznej i bardziej szczegółowo, w tym określenie, charakteru powstania i rozwoju i funkcji do kości in vivo komórek zrębu szpiku, jak również dopuszczalnej potencjalnego różnicowanie ex vivo i możliwością zastosowanie terapeutyczne in vivo. Uzyskane dane na temat potencjalnych możliwości MSC, a także wyniki badań nad potencjałem regeneracyjnym innych komórek macierzystych są w ostrej sprzeczności z dogmatami ustanowionymi w biologii.

Hodowane w warunkach niskiej gęstości komórki zrębowe szpiku kostnego tworzą odrębne kolonie, z których każda jest pochodną pojedynczej komórki prekursorowej. Procent prekursorów komórek zrębowych szpiku kostnego komórek jądrzastych zdefiniowano na podstawie ich zdolności do tworzenia kolonii w znacznym stopniu zależy od warunków hodowli i wykorzystywanych gatunków należących do MSC. Na przykład u gryzoni, aby uzyskać maksymalną ilość komórek progenitorowych zrębu jest absolutnie konieczne, w obecności napromieniowanych podajnika hodowli komórek szpiku kostnego i surowicy, podczas gdy kolonie tworzące wydajność ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych jest niezależny od podajnika, albo z pożywki hodowlanej. Liczba znanych mitogennych czynników stymulujących proliferację zarodkowych komórek progenitorowych jest ograniczona. Należą do nich PDGF, EGF, FGF, TGF-b, a także IGF1. W optymalnych warunkach hodowli MSCs poliklonalne linie utrzymywane in vitro na więcej niż 50 podziałów komórkowych, co sprawia, że możliwy jest odbiór miliardy komórek zrębu szpiku kostnego 1 ml aspiratu go.

Jednakże, populacja komórek zrębu szpiku kostnego jest niejednorodny, które przejawia się jako zmienności wielkości kolonii, różnym czasie ich formowania i różnych morfologii komórek, który obejmuje szereg wrzeciona fibroblastów do dużych płaskich komórek. Wraz z rozwojem takich upraw po 20 dniach obserwuje się również heterogeniczność fenotypową. Część kolonię charakteryzuje się wysoką ekspresję alkalicznej fosfatazy, a inne nie wyrażają, i kolonie typu trzecie są fosfatazopozitivnymi w obszarze centralnym i fosfatazonegativnymi na obwodzie. Oddzielne kolonie tworzą guzki tkanki kostnej (początek mineralizacji matrycy zaznacza się po wybarwieniu czerwienią alizarynową lub wapniem przez Van-Kossa). W innych koloniach zachodzi nagromadzenie tłuszczu, zidentyfikowane przez wybarwienie G czerwienią oliwną. Rzadziej kolonie mezenchymalnych komórek macierzystych tworzą chrząstki zabarwione błękitem alcyanowym).

Po ektopowej transplantacji u zwierząt doświadczalnych poliklonalne linie MGK tworząc zrąb ektopowej kości z setchatoobraznoy związanego z komórek szpikowych i komórkach tłuszczowych, a także, ale rzadko z tkanki chrzęstnej. W monoklonalne linie transplantacji komórek zrębu szpiku kostnego, w niektórych przypadkach, gdzie chimeryzm de novo utworzona tkanka kostna składa się z komórek kości adipocyty zawiera źródło zrębu i dawcy, podczas gdy linie komórek krwiotwórczych i układu naczyniowego pochodzą od pacjenta.

Wyniki tych badań potwierdzają charakter macierzystej prekursora szpiku kostnego, z którego uzyskano linię klonalną. Jednocześnie pokazują one, że nie wszystkie klonowanie w komórkach hodowlanych są rzeczywiście multipotencjalnymi komórkami macierzystymi. Niektórzy badacze uważają, a my podzielić się swoją opinią, że najbardziej dokładne informacje o rzeczywistym potencjale różnicowania poszczególnych klonów można uzyskać tylko w warunkach in vivo po transplantacji, raczej niż przez określenie fenotypu ich pochodnych in vitro. Ekspresja w hodowli osteoporoza markerów fenotypowych hondro- lub adipogenezy (określone przez mRNA lub za pomocą technik histochemicznych), a nawet produkcję zmineralizowanej macierzy nie odzwierciedla stopień pluripotencja pojedynczego klonu w warunkach in vivo. W związku z tym identyfikacja komórek macierzystych w grupie komórek zrębowych jest możliwa tylko w późniejszym okresie, w odpowiednich warunkach testu przeszczepu biologicznego. W szczególności, tworzenie chrząstki rzadko obserwowane w przeszczepie systemy otwarte, podczas gdy tworzenie się chrząstki nie jest niczym niezwykłym, w systemach zamkniętych, na przykład komór dyfuzyjnych lub w mikromassnyh hodowli komórek zrębu in vitro, w którym osiąga się lokalnie niskie napięcie tlenu, przyczyniają się do powstawania chrząstki. Dlatego nawet technika przeszczepiania, jak również niespecyficzne warunki hodowli in vitro, znacząco wpływają na zakres różnicowania MSC.

Eksperymentalna transplantacja z zachowaniem danych warunków eksperymentalnych jest złotym standardem w określaniu potencjału różnicowania komórek zrębowych szpiku kostnego i kluczowym elementem ich właściwej identyfikacji. Historycznie, przeszczep szpiku kostnego z przeszczepem szpiku kostnego jest związany z powszechnym problemem przeszczepu szpiku kostnego. Ustalono, że mikrośrodowisko krwiotwórcze powstaje w wyniku transplantacji komórek zrębowych szpiku kostnego i zapewnia ektopowy rozwój tkanki hemopoetycznej w strefie przeszczepu. Pochodzenie mikrośrodowiska od dawcy i tkanki krwiotwórczej - od gospodarza pozwala nam leczyć ektopową kość jako prawdziwy "odwrócony" przeszczep szpiku kostnego. Miejscowa transplantacja komórek zrębowych szpiku kostnego promuje skuteczną korektę ubytków kości, bardziej wyraźną niż w spontanicznej regeneracji regeneracyjnej. W kilku badaniach przedklinicznych na modelach eksperymentalnych przekonująco wykazano możliwość zastosowania przeszczepów szpiku kostnego ze szpiku kostnego w ortopedii, chociaż do ich optymalizacji niezbędna jest najdokładniejsza praca i analiza, nawet w najprostszych przypadkach. W szczególności, nie ustalono jeszcze optymalnych warunków dla ekspansji osteogennych komórek zrębowych ex vivo, struktura i skład idealnego nośnika pozostają niewykorzystane, jak również liczba komórek niezbędnych do masowej regeneracji kości.

Oprócz zastosowania rozmnażane ex vivo, komórki zrębowe szpiku kostnym na regenerację tkanki pochodzenia mezenchymalnego niekonwencjonalne ciągliwości MSC otwiera potencjalne zastosowanie do regeneracji komórek nerwowych lub dostarczania produktów genowych w OUN. W zasadzie upraszcza to terapię komórkową w pokonaniu układu nerwowego, ponieważ nie ma potrzeby uzyskiwania autologicznych neuronalnych komórek macierzystych człowieka. Donosi się o możliwościach wykorzystania komórek szpiku kostnego do wytwarzania kardiomiocytów i komórek prekursorowych miogenicznych jako prawdziwie zrębu i zewnętrznego pochodzenia.

Obecnie trwają eksperymenty dotyczące systemowego przeszczepiania komórek zrębowych szpiku kostnego w leczeniu powszechnych chorób szkieletowych. Nie ulega wątpliwości, że komórki zrębowe szpiku kostnego reprezentują populację odpowiedzialną za zaburzenia genetyczne w chorobach szkieletu, co dobrze ilustruje transfer tych informacji genetycznych przez te komórki, co prowadzi do tworzenia patologicznej tkanki kostnej u zwierząt doświadczalnych. Jednak nie udowodniono jeszcze zdolności komórek zrębowych do implantacji, wzrostu, namnażania i różnicowania w kościach szkieletu po wprowadzeniu do ogólnego przepływu krwi.

Jest to częściowo spowodowane tym, że standardowy tryb zrębu szpiku kostnego nie przeszczepiono tkanki krwiotwórczej, więc surowe kryteria oceny pomyślnego wszczepienia systemowym podawaniu komórki zrębowe zostały jeszcze rozwinięte. Należy pamiętać, że obecność genów markerowych w ekstraktach tkankowych lub izolacja w hodowli komórek pochodzenia dawcy nie wskazuje na przeszczepienie komórek, a jedynie na ich przeżycie. Nawet wewnątrz tętnicze wstrzyknięcie komórek zrębu szpiku kostnego do kończyny myszy może prowadzić do praktycznie zerowego wyniku wszczepienia, pomimo faktu, że komórki pochodzenia dawcy znajdują się w dużej liczbie w obrębie sieci naczyń mikrokrążenia szpiku kostnego. Niestety, takie komórki zazwyczaj opisuje się jako "wszczepione" tylko na podstawie wyników oznaczenia genów donorowych markera w warunkach hodowli ex vivo. Ponadto konieczne jest dostarczenie przekonujących dowodów na długoterminową integrację w tkankach zróżnicowanych i funkcjonalnie aktywnych komórek pochodzenia dawcy. W wielu opublikowanych pracach, w których donosi się o wszczepieniu komórek zrębowych szpiku kostnego do szkieletu, brak wyraźnych danych tego rodzaju jest uderzający. Niemniej jednak należy zauważyć, że w niektórych prawidłowych doświadczeniach na zwierzętach ustalono ograniczone, ale rzeczywiste wszczepienie zarodkowych komórek progenitorowych po ich podaniu ogólnoustrojowym.

Dane te są zgodne z wynikami badania możliwości dostarczania miogennych komórek prekursorowych szpiku kostnego do mięśni przez układ naczyniowy. Jednak nie należy zapominać, że zarówno tkanki szkieletowe, jak i mięśniowe powstają podczas rozwoju i wzrostu na podstawie ruchów komórek pozanaczyniowych, które wykorzystują procesy migracyjne, które nie wymagają krążenia we krwi. Jeśli rzeczywiście istnieje niezależna ścieżka krążenia do dostarczania komórek prekursorowych do tkanek w fazie stałej, czy możliwe jest zezwolenie na istnienie fizjologicznie krążących mezenchymalnych komórek progenitorowych? Jakie jest pochodzenie tych komórek zarówno w organizmie rozwijającym się, jak i po urodzeniu oraz w jaki sposób przenikają one do ściany naczynia? Rozwiązanie tych problemów jest absolutnie konieczne i wymaga najdokładniejszej analizy przedklinicznej. Nawet po znalezieniu odpowiedzi na te pytania, problematyczne aspekty kinetyczne związane ze wzrostem szkieletu i przebudową tkanki łącznej pozostają nierozwiązane. Jednocześnie leczenie zaburzeń osteogenezy poprzez zastąpienie całej populacji zmutowanych szkieletowych komórek progenitorowych zdrowymi komórkami zrębu wydaje się być kliniczną perspektywą. W tym przypadku lokalne strefy złamania lub deformacji spowodowane patologiczną osteogenezą, a także destrukcyjne zmiany w tkance kostnej, mogą być skorygowane przez hodowane zarodkowe komórki macierzyste in vitro. Dlatego kierunek przyszłych badań powinien skupiać się na problemach transformacji lub genetycznej korekcji autologicznych zmutowanych osteogennych komórek progenitorowych ex vivo.

Inżynieria genetyczna komórek, krótkoterminowa lub stała, stała się podstawą biologii komórkowej i molekularnej, źródłem wielu odkryć naukowych dotyczących roli poszczególnych białek w metabolizmie komórkowym in vitro i in vivo. Zastosowanie technik molekularnych poprawić chorób dziedzicznych i chorób u ludzi jest bardzo obiecujące dla medycyny praktycznej, ponieważ właściwości zrębowych komórek macierzystych szpiku kostnego mogą rozwijać unikalny obwodów transplantacji korekcji chorób genetycznych szkieletu. Jednocześnie mezenchymalne komórki progenitorowe można łatwo uzyskać od przyszłego biorcy, są one podatne na manipulację genetyczną i są w stanie rozmnażać się w dużej liczbie w krótkim okresie czasu. Zastosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych pozwala uniknąć ograniczeń i zagrożeń związanych z dostarczaniem informacji genetycznych bezpośrednio pacjentowi poprzez struktury wektora vrru. Taką strategię stosuje się w przypadku zarodkowych komórek macierzystych, jednak bardziej korzystne są autologiczne populacyjne komórki zrębu szpiku kostnego, ponieważ ich podawanie wyklucza możliwe immunologiczne powikłania po transplantacji. W celu osiągnięcia efektu w krótkim okresie, na przykład w celu przyspieszenia regeneracji kości, optymalny sposób jest modyfikacja genetyczna mezenchymalnych komórek macierzystych, z zastosowaniem syntezy chemicznej elektroporatsrsh, lipofekcja, plazmidy i konstruktów adenowirusowych. W szczególności wirusowa transfekcja do komórek BMP-2 zrębowych szpiku kostnego była skuteczna w przyspieszaniu regeneracji kości w doświadczalnej urazie wielonarządowej. Tworzenie struktur adenowirusowych jest korzystne ze względu na brak toksyczności. Jednakże modyfikacja genetyczna komórek zrębowych szpiku kostnego w tym przypadku charakteryzuje się wyjątkowo niską stabilnością. Ponadto, normalne transformowane komórki zrębowe szpiku kostnego wymagają stosowania nosicieli wektorowych informacji genetycznej 10 razy bardziej zakaźnych niż inne typy komórek, co znacznie zwiększa odsetek śmierci transfekowanych komórek.

W leczeniu chorób powodowanych przez recesywne niskiej lub zerowej aktywności biologicznej pewnych genów konieczności długotrwałego lub trwałą modyfikację mezenchymalnych komórek macierzystych, co wymaga zastosowania wirusów związanych z gruczołami, retrowirusy, lentiwirusy i adenowirusem retrowirusowy chimery. Miejsca transportowania tych wirusów są zdolne do przenoszenia dużych transfektów DNA (do 8 kb). W literaturze naukowej pojawiły się już o aktywności biologicznej egzogennej szpiku kostnego komórek zrębu transfekowanych retrowirusowe konstruktów kodujących syntezę cząsteczki regulatorowe i markerów - IL-3, CD2, czynnik VIII i enzymy zaangażowane w syntezie L-DOPA. Ale w tych pracach autorzy zwracają uwagę na szereg ograniczeń, które trzeba pokonać, zanim zacznie się praktyczne zastosowanie tej technologii. Pierwszym problemem jest optymalizacja procesu modyfikacji ex vivo MCK. Wiadomo, że przedłużona (3-4 tygodnie) proliferacja komórek zrębowych szpiku kostnego in vitro zmniejsza ich transfekcję. W tym samym czasie kilka cykli transfuzji jest wymaganych do osiągnięcia wysokiego poziomu modyfikacji genetycznej MSC. Drugi problem związany jest z czasem trwania ekspresji genu terapeutycznego, który nie przekracza jeszcze czterech miesięcy. Naturalny spadek skutecznej ekspresji genu wynika z inaktywacji promotorów i śmierci zmodyfikowanych komórek. Na ogół perspektywy przenoszenia informacji genetycznej przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych Wyniki wstępnych badań wskazują na konieczność dalszej optymalizacji metody transfekcji ex vivo, wybranie odpowiedniego promotora regulacji aktywności biologicznej w odpowiednim kierunku i zwiększenia zdolności zmodyfikowanej kości komórek zrębu szpiku samoodnawiania in vivo po transplantacji. Należy zauważyć, że stosowanie projektów retrowirusowych do modyfikacji komórek zrębowych szpiku we właściwym kierunku nie zawsze wymaga ich obowiązkowego wszczepienia. Transfekowane mezenchymalne komórki macierzyste mogą pełnić funkcję naprawczą na tle stabilnego miejsca zamieszkania i bez obowiązkowej aktywnej fizycznej inkorporacji i funkcjonowania w tkance łącznej. W takim przypadku należy je traktować jako biologiczną mini-pompę, wytwarzającą czynnik in vivo, którego deficyt determinuje przejaw genetycznej patologii.

Zastosowanie transformowanych kostne komórki zrębu szpiku w leczeniu dominującej choroby genetycznej, która charakteryzuje się przez ekspresję genu lub nieprawidłowej patologicznej aktywności biologicznej, jest znacznie bardziej problematyczne, ponieważ w tym przypadku jest konieczne, aby blokować przeniesienia lub sprzedaż informacji genetycznej zniekształcony. Jedną z metod inżynierii genetycznej jest rekombinacja homologiczna embrionalnych komórek macierzystych w celu stworzenia zwierząt transgenicznych. Jednak bardzo niska homologicznej rekombinanta, w połączeniu z problemami identyfikacji, separacji i rozwoju tych rekombinantów jest mało prawdopodobne, aby promować powszechne stosowanie tej metody w najbliższej przyszłości, nawet w przypadku rozwoju nowych metod technologicznych. Drugie podejście do terapii genowej opiera się o dominującą patologii automatycznej korekcji uszkodzonego DNA, jak Mutacje genetyczne mogą być poprawione przez wprowadzenie egzogennego DNA z pożądaną sekwencją (krótkie oligonukleotydy DNA lub chimerycznych oligonukleotydów RNA / DNA), które wiążą się z homologów w uszkodzonym genomu. Trzeci przykład wykonania zapewnia patologicznego blokady transmisji informacji, które uzyskuje się poprzez zastosowanie specjalnie zaprojektowanych oligonukleotydów, które wiążą się z konkretnym genem, tworząc potrójny strukturę śrubową, która wyklucza możliwość transkrypcji.

Chociaż korekcję chorób genetycznych na poziomie genomu jest optymalna i korzystna metoda terapeutyczna mRNA jest również wektor obiecujące (być może nawet bardziej dostępne) do blokowania dominującego negatywnego genu. W celu hamowania translacji i / lub zwiększenia degradacji mRNA, są stosowane od dawna z cząsteczkami białek o sekwencjach antysensowych oligonukleotydów lub pełnego wiązania mRNA biosyntezy urządzenia komórki blokowania. Ponadto dwuniciowy RNA indukuje szybką degradację mRNA, którego mechanizm pozostaje niejasny. Jednakże jest prawdopodobne, że samo usuwanie mRNA transkrybowanego z zmutowanego allelu z mutacją lub krótkich pojedynczych będzie promować ekspresję mRNA normalnego allelu. Alternatywą jest wykorzystanie ribozinov młotka i spinki do włosów, mają zdolność do wiązania się z wysoce specyficznych miejscach mRNA z dalszym indukowaniu ich przecinania i dezaktywacji podczas translacji. Obecnie badana jest możliwość zastosowania tej metody w leczeniu patologicznej osteogenezy. Niezależnie od tego, co dokładnie jest cel - elementy genomowe lub cytoplazmatyczne sukces nowej technologii terapii genowej zostanie określona przez efektywność włączenia reagentów w kości komórek podścieliska szpiku ex vivo, optymalny dobór konkretnego wektora i stabilną zdolność mezenchymalnych komórek macierzystych z ekspresją pożądanych czynników in vivo.

W ten sposób odkrycie mezenchymalnych komórek macierzystych z ich nieoczekiwanymi właściwościami tworzy nowy schemat pojęciowy dla rozwoju linii komórkowych. Ale żeby zrozumieć biologiczną rolę komórek podścieliska macierzystych z powodu ich charakteru, umiejętność transróżnicowanie lub dedifferentiation ich fizjologiczne znaczenie w procesie rozwoju embrionalnego, poporodowym wzrostu, dojrzewania i starzenia się, a także w chorobach ludzkich wymaga dalszych badań interdyscyplinarnych.