Mezenchymalne komórki macierzyste

Wśród regionalnych komórek macierzystych szczególne miejsce zajmują komórki macierzyste mezenchymalne (MSC), których pochodne stanowią macierz podścieliska wszystkich organów i tkanek ludzkiego ciała. Priorytet w badaniach MSC mają przedstawiciele rosyjskiej nauki biologicznej.

W połowie ubiegłego stulecia po raz pierwszy w laboratorium A. Friedensteina wyizolowano jednorodną kulturę wielopotencjalnych komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego. Przytwierdzone do podłoża komórki macierzyste mezenchymalne przez długi czas utrzymywały wysoką intensywność proliferacji, a w hodowlach o niskiej gęstości zaszczepienia po utrwaleniu na podłożu tworzyły klony komórek podobnych do fibroblastów, które nie wykazywały aktywności fagocytarnej. Zaprzestanie proliferacji MSC zakończyło się ich spontanicznym różnicowaniem in vitro w komórki kości, tłuszczu, chrząstki, mięśni lub tkanki łącznej. Dalsze badania pozwoliły ustalić potencjał osteogenny komórek podobnych do fibroblastów podścieliska szpiku kostnego różnych gatunków ssaków, a także ich aktywność kolonizacyjną. Eksperymenty in vivo wykazały, że zarówno hetero-, jak i ortotopowa transplantacja tworzących kolonie komórek podobnych do fibroblastów powoduje powstanie tkanki kostnej, chrzęstnej, włóknistej i tłuszczowej. Ponieważ komórki macierzyste podścieliska szpiku kostnego charakteryzują się dużą zdolnością do samoodnawiania i wielopłaszczyznowym różnicowaniem w obrębie jednej linii komórkowej, nazywa się je multipotencjalnymi komórkami progenitorowymi mezenchymalnymi.

Należy zauważyć, że w ciągu ponad 45 lat badań podstawowych nad komórkami macierzystymi mezenchymalnymi stworzono realne warunki do wykorzystania ich pochodnych w praktyce klinicznej.

Dziś nie ma wątpliwości, że wszystkie tkanki ludzkiego ciała powstają z komórek macierzystych różnych linii komórkowych w wyniku procesów proliferacji, migracji, różnicowania i dojrzewania. Jednak do niedawna uważano, że komórki macierzyste w organizmie dorosłym są tkankowo specyficzne, tj. zdolne do wytwarzania linii wyspecjalizowanych komórek tylko tych tkanek, w których się znajdują. To stanowisko koncepcyjne zostało obalone przez fakty przekształcania się komórek macierzystych hematopoetycznych nie tylko w elementy komórkowe krwi obwodowej, ale także w komórki owalne wątroby. Ponadto, komórki macierzyste nerwowe okazały się zdolne do dawania początku zarówno neuronom, jak i elementom glejowym, a także wczesnym zaangażowanym liniom komórek progenitorowych hematopoetycznych. Z kolei komórki macierzyste mezenchymalne, które zwykle wytwarzają elementy komórkowe kości, chrząstki i tkanki tłuszczowej, są zdolne do przekształcania się w komórki macierzyste nerwowe. Zakłada się, że w procesie wzrostu, fizjologicznej i naprawczej regeneracji tkanek, niezaangażowane komórki progenitorowe są generowane z niespecyficznych dla tkanki rezerw macierzystych. Na przykład, naprawa tkanki mięśniowej może być realizowana dzięki migrującym ze szpiku kostnego do mięśni szkieletowych komórkom macierzystym mezenchymalnym.

Chociaż taka krzyżowa zamienność komórek macierzystych nie jest uznawana przez wszystkich badaczy, możliwość klinicznego wykorzystania komórek macierzystych mezenchymalnych jako źródła do przeszczepu komórek i wektora komórkowego informacji genetycznej nie jest już kwestionowana przez nikogo, podobnie jak multipotencja komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego, które można stosunkowo łatwo wyizolować i rozszerzyć w hodowli in vitro. Jednocześnie w literaturze naukowej nadal pojawiają się doniesienia o potencjalnej pluripotencji komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego. Jako dowód przytaczane są protokoły badawcze, w których pod wpływem specyficznych induktorów transdyferencjacji MSC przekształcają się w komórki nerwowe, kardiomiocyty i hepatocyty. Jednak niektórzy naukowcy mają poważne wątpliwości co do możliwości powtórnej aktywacji i ekspresji genów z okresu wczesnej embriogenezy. Jednocześnie wszyscy rozumieją, że jeśli zostaną znalezione warunki do rozszerzenia multipotencji komórek macierzystych mezenchymalnych do pluripotencji ESC, wiele problemów etycznych, moralnych, religijnych i prawnych w regeneracyjnej medycynie plastycznej zostanie automatycznie rozwiązanych. Ponadto, ponieważ w tym przypadku źródłem regeneracyjnego potencjału macierzystego stają się autologiczne komórki podścieliska pacjenta, problem odrzucenia przeszczepu komórek przez układ odpornościowy również jest rozwiązany. Niedaleka przyszłość pokaże, jak realistyczne są te perspektywy.

[ 1 ], [ 2 ]

Zastosowanie komórek macierzystych mezenchymalnych w medycynie

W klinice stosowanie pochodnych komórek macierzystych mezenchymalnych jest związane przede wszystkim z odbudową ubytków tkanek, które występują przy rozległych i głębokich zmianach termicznych skóry. Na etapie przedklinicznym przeprowadzono eksperymentalną ocenę wykonalności wykorzystania allogenicznych fibroblastopodobnych komórek macierzystych mezenchymalnych do leczenia głębokich oparzeń. Wykazano, że fibroblastopodobne komórki macierzyste mezenchymalne szpiku kostnego tworzą monowarstwę w hodowli, co umożliwia ich przeszczepienie w celu optymalizacji procesów regeneracji głębokich ran oparzeniowych. Autorzy zauważają, że podobne właściwości mają fibroblasty zarodkowe, ale ich kliniczne zastosowanie jest ograniczone istniejącymi problemami etycznymi i prawnymi. Głębokie oparzenie termiczne z uszkodzeniem wszystkich warstw skóry zostało zamodelowane na szczurach Wistar. Obszar oparzenia stanowił 18-20% całkowitej powierzchni skóry. Pierwsza grupa eksperymentalna obejmowała szczury z głębokim oparzeniem termicznym i przeszczepem allogenicznych fibroblastopodobnych komórek macierzystych mezenchymalnych. Drugą grupę stanowiły zwierzęta z głębokim oparzeniem termicznym i przeszczepem allogenicznych fibroblastów embrionalnych. Trzecią grupę stanowiły szczury kontrolne z głębokim oparzeniem termicznym, które nie zostały poddane terapii komórkowej. Zawiesinę fibroblastycznych komórek macierzystych i fibroblastów embrionalnych nałożono na powierzchnię rany oparzeniowej za pomocą pipety w ilości 2 x 10 ⁴komórki 2. dnia po modelowaniu oparzenia i wycięciu powstałego martwiczego strupa. Po przeszczepie komórek powierzchnię oparzenia przykryto gazą zwilżoną izotonicznym roztworem chlorku sodu z gentamycyną. Komórki szpiku kostnego pobrano w celu uzyskania MSC, a następnie wprowadzono je do linii fibroblastycznych komórek macierzystych mezenchymalnych od dorosłych szczurów rasy Wistar z kości udowych. Fibroblasty zarodkowe pobrano z płuc 14-17-dniowych zarodków. Fibroblasty zarodkowe i komórki szpiku kostnego w celu uzyskania MSC wstępnie hodowano w szalkach Petriego w temperaturze 37°C w inkubatorze CO2, w atmosferze 5% CO2 przy wilgotności 95%. Fibroblasty zarodkowe hodowano przez 4-6 dni, podczas gdy utworzenie monowarstwy MSC wymagało od 14 do 17 dni. Następnie kriokonserwowano MSC jako materiał źródłowy dla fibroblastopodobnych komórek macierzystych mezenchymalnych, które uzyskano przez rozmrożenie i hodowlę MSC przez 4 dni. Liczba utworzonych fibroblastopodobnych komórek macierzystych mezenchymalnych była ponad 3 razy większa niż liczba fibroblastów embrionalnych utworzonych w tym samym okresie hodowli. Aby zidentyfikować przeszczepione komórki w ranach oparzeniowych na etapie hodowli, ich genom znakowano za pomocą wirusowego wektora wahadłowego opartego na rekombinowanym adenowirusie typu V niosącym gen 1ac-2 kodujący ß-galaktozydazę E. coli. Żywe komórki w różnym czasie po przeszczepie wykrywano immunohistochemicznie w krioskrawkach z dodatkiem substratu X-Gal, który daje charakterystyczne niebiesko-zielone zabarwienie. W wyniku dynamicznej wizualnej, planimetrycznej i histologicznej oceny stanu rany oparzeniowej ustalono, że już 3 dnia po przeszczepie komórek pojawiają się istotne różnice w przebiegu procesu rany w wybranych grupach. Ta różnica stała się szczególnie wyraźna 7. dnia po przeszczepie komórek. U zwierząt z pierwszej grupy, którym przeszczepiono fibroblastopodobne komórki macierzyste mezenchymalne, rana nabrała jednolicie intensywnego różowego koloru, tkanka ziarninowa rozrosła się na całej swojej powierzchni do poziomu naskórka, a powierzchnia oparzenia znacznie zmniejszyła się. Warstwa kolagenowa utworzona na powierzchni rany stała się nieco cieńsza, ale nadal pokrywała całą powierzchnię oparzenia. U zwierząt z drugiej grupy, którym przeszczepiono zarodkowe fibroblasty, tkanka ziarninowa podniosła się do poziomu naskórka brzegów rany, ale tylko miejscami, podczas gdy plazmorrhea z rany była bardziej intensywna niż w grupie 1, a początkowo utworzona warstwa kolagenowa praktycznie zanikła. U zwierząt, które nie otrzymały terapii komórkowej, 7. dnia rana oparzeniowa była bladą, dołkowatą, martwiczą tkanką pokrytą fibryną. Plasmorea była widoczna na całej powierzchni oparzenia. Badania histologiczne wykazały zmniejszenie nacieku komórkowego i rozwoju sieci naczyniowej u zwierząt z grupy 1 i 2,i te oznaki rozpoczynającego się procesu regeneracyjnego były bardziej widoczne u szczurów z grupy 1. W grupie kontrolnej obserwowano oznaki naciekania komórkowego rany, nie było histologicznego wzoru nowo powstałych naczyń. W dniach 15-30 obserwacji powierzchnia powierzchni oparzenia u zwierząt z grupy 1 była znacznie mniejsza niż u szczurów z pozostałych grup, a powierzchnia ziarninująca była bardziej rozwinięta. U zwierząt z grupy 2 powierzchnia powierzchni oparzenia również zmniejszyła się w porównaniu z rozmiarem ran oparzeniowych u szczurów z grupy kontrolnej, co nastąpiło z powodu brzeżnej epitelializacji. W grupie kontrolnej powierzchnia oparzenia pozostała blada w miejscach z rzadkimi ziarnistościami, pojawiły się na niej gwiazdki naczyniowe, były wysepki włóknikowej blaszki, umiarkowana plazmorrhea trwała na całej powierzchni oparzenia, a w niektórych miejscach pozostał trudny do oddzielenia strup. U zwierząt z grupy III wielkość rany również uległa zmniejszeniu, jednak jej brzegi pozostały podminowane.

Tak więc podczas badania porównawczego szybkości gojenia się ran przy użyciu fibroblastopodobnych komórek macierzystych mezenchymalnych i fibroblastów embrionalnych, jak również bez stosowania terapii komórkowej, zauważono przyspieszenie szybkości gojenia się powierzchni oparzenia w wyniku przeszczepu fibroblastopodobnych komórek macierzystych mezenchymalnych i fibroblastów embrionalnych. Natomiast w przypadku zastosowania allogenicznych fibroblastopodobnych komórek macierzystych mezenchymalnych szybkość gojenia się ran była wyższa niż przy przeszczepie fibroblastów embrionalnych. Wyrażało się to w przyspieszeniu zmiany faz procesu regeneracyjnego - terminy infiltracji komórkowej uległy zmniejszeniu, szybkość wzrostu sieci naczyniowej wzrosła, a także tworzenia tkanki ziarninowej.

Wyniki dynamicznej planimetrii wskazują, że szybkość samoistnego gojenia się rany oparzeniowej (bez stosowania terapii komórkowej) była najniższa. W 15. i 30. dniu po przeszczepie allogenicznych komórek macierzystych mezenchymalnych podobnych do fibroblastów szybkość gojenia się rany była wyższa niż po przeszczepie fibroblastów embrionalnych. Histochemiczna metoda wykrywania beta-galaktozydazy wykazała, że po przeszczepie komórek macierzystych mezenchymalnych podobnych do fibroblastów i fibroblastów embrionalnych przeszczepione komórki pozostają żywe na powierzchni i w głębi regenerujących się ran przez cały okres obserwacji. Autorzy uważają, że wyższa szybkość regeneracji rany oparzeniowej przy zastosowaniu komórek macierzystych mezenchymalnych podobnych do fibroblastów wynika z uwalniania przez te komórki biologicznie aktywnych czynników stymulujących wzrost w trakcie procesu dojrzewania.

Transplantacja auto- lub allogenicznych keratynocytów i allogenicznych fibroblastów w leczeniu ran oparzeniowych jest również stosowana w praktyce klinicznej. Należy zauważyć, że leczenie chirurgiczne dzieci z rozległymi głębokimi oparzeniami jest złożonym zadaniem ze względu na wysoki charakter urazowy i liczne interwencje chirurgiczne, znaczną utratę krwi i różne reakcje na stosowane media infuzyjne. Główne trudności w wykonywaniu operacji plastycznych skóry w przypadku rozległych głębokich oparzeń, o powierzchni przekraczającej 40% powierzchni ciała, wynikają z ciężkości stanu ofiar i braku zasobów skóry dawcy. Zastosowanie przeszczepów siatkowych o wysokim współczynniku perforacji nie rozwiązuje problemu, ponieważ komórki powstałe po perforacji nabłonkują się bardzo powoli, a same płaty skóry często ulegają lizie lub wysychają. Takie pokrycia ran oparzeniowych jak xenoskin, przeszczepy zwłok, syntetyczne pokrycia filmowe nie zawsze są wystarczająco skuteczne, dlatego opracowywane są nowe metody pokrywania powierzchni oparzeń warstwami hodowanych keratynocytów i fibroblastów. W szczególności zaproponowano metodę pokrywania powierzchni oparzeń za pomocą hodowanych allofibroblastów, które po przeszczepieniu mają wyraźny efekt stymulujący na proliferację epidermocytów zachowanych w ranie w oparzeniach granicznych, a także keratynocytów w przegrodach przeszczepów siatkowych. Praca L. Budkevicha i współautorów (2000) przedstawia wyniki stosowania tej metody w leczeniu oparzeń u dzieci. Badaniem objęto 31 dzieci z urazem termicznym w wieku od 1 roku do 14 lat. U trojga dzieci łączna powierzchnia ran oparzeniowych stopnia IIIA-B - IV wynosiła 40%, u 25 - 50-70%, u kolejnych trojga - 71-85% powierzchni ciała. Wczesna nekrektomia chirurgiczna została połączona z przeszczepem hodowanych allofibroblastów i autodermoplastyką. Pierwszy etap leczenia obejmował wycięcie tkanek martwiczych, drugi etap obejmował przeszczep hodowanych allofibroblastów na błonach nośnikowych, a trzeci etap (48 godzin po przeszczepie hodowanych allofibroblastów) obejmował usunięcie macierzy i autodermoplastykę z płatami skóry o stosunku perforacji 1:4. U trzech pacjentów przyjętych do kliniki z ciężką chorobą oparzeniową przeszczepiono hodowane allofibroblasty na rany ziarninujące. Przeszczep hodowanych allofibroblastów wykonano raz u 18 dzieci, dwa razy u 11 dzieci i trzy razy u dwóch pacjentów. Powierzchnia rany pokryta hodowlą komórkową wynosiła od 30 do 3500 cm2. Skuteczność hodowanych allofibroblastów oceniano na podstawie ogólnego odsetka wszczepienia przeszczepu skóry, czasu gojenia się oparzeń i liczby zgonów z powodu ciężkiego urazu termicznego. Wszczepienie przeszczepu było całkowite u 86% pacjentów. Częściowe niewszczepienie przeszczepu skóry odnotowano u 14% pacjentów. Pomimo leczenia, sześcioro (19,3%) dzieci zmarło. Całkowita powierzchnia uszkodzeń skóry u nich wynosiła od 40 do 70% powierzchni ciała.U żadnego pacjenta przeszczepienie hodowanych allofibroblastów nie wiązało się ze zgonem w wyniku oparzeń.

Analizując wyniki leczenia, autorzy zauważają, że dotychczas głębokie termiczne uszkodzenia skóry obejmujące 35-40% powierzchni ciała uznawano za nie dające się pogodzić z życiem (dla młodszych dzieci - do 3 roku życia - krytyczne są głębokie oparzenia obejmujące 30% powierzchni ciała, dla starszych dzieci - powyżej 40% powierzchni ciała). Podczas wykonywania chirurgicznej nekrektomii z przeszczepem hodowanych allofibroblastów i następową autodermoplastyką z płatami skórnymi o wysokim współczynniku perforacji, oparzenia IIIB - IV stopnia pozostają krytyczne, ale obecnie istnieją perspektywy na uratowanie życia nawet takich ofiar w wielu przypadkach. Chirurgiczna nekrektomia w połączeniu z przeszczepem hodowanych allofibroblastów i autodermoplastyką u dzieci z głębokimi oparzeniami okazała się szczególnie skuteczna u pacjentów z rozległymi zmianami skórnymi przy niedoborze miejsc dawczych. Aktywne taktyki chirurgiczne i przeszczepy hodowanych allofibroblastów przyczyniają się do szybkiej stabilizacji ogólnego stanu takich pacjentów, zmniejszenia liczby powikłań infekcyjnych choroby oparzeniowej, stworzenia korzystnych warunków do wszczepienia przeszczepów, skrócenia czasu przywracania utraconej skóry i czasu trwania leczenia szpitalnego, zmniejszenia częstości zgonów u ofiar z rozległymi oparzeniami. Tak więc przeszczep hodowanych allofibroblastów z następową autodermoplastyką z płatami skóry pozwala na powrót do zdrowia u dzieci z ciężkimi oparzeniami, które wcześniej uważano za skazane na zagładę.

Powszechnie przyjmuje się, że podstawowym celem leczenia choroby oparzeniowej jest jak najpełniejsza i najszybsza odbudowa uszkodzonej skóry, aby zapobiec skutkom toksycznym, powikłaniom zakaźnym i odwodnieniu. Wyniki stosowania hodowanych komórek w dużej mierze zależą od gotowości samej rany oparzeniowej do przeszczepu. W przypadkach przeszczepu hodowanych keratynocytów na powierzchnię rany po chirurgicznej nekrektomii, średnio 55% (według powierzchni) przeszczepionych komórek ulega wszczepieniu, podczas gdy w przypadku ran ziarninujących wskaźnik wszczepienia spada do 15%. Dlatego skuteczne leczenie rozległych głębokich oparzeń skóry wymaga przede wszystkim aktywnych taktyk chirurgicznych. W przypadku ran oparzeniowych stopnia IIIB-IV powierzchnia oparzenia jest natychmiast uwalniana z tkanki martwiczej w celu zmniejszenia zatrucia i zmniejszenia liczby powikłań choroby oparzeniowej. Stosowanie takich taktyk jest kluczem do skrócenia czasu od momentu otrzymania oparzenia do momentu zamknięcia ran i długości pobytu pacjentów z rozległymi oparzeniami w szpitalu, a także znacznie zmniejsza liczbę zgonów.

Pierwsze doniesienia o skutecznym wykorzystaniu hodowanych keratynocytów do pokrycia powierzchni oparzeń pojawiły się na początku lat 80. XX wieku. Następnie manipulację tę wykonywano przy użyciu warstw hodowanych keratynocytów, najczęściej uzyskiwanych z autokomórek, znacznie rzadziej z allokeratynocytów. Jednak technologia autokeratynocytoplastyki nie pozwala na stworzenie banku komórek, a czas potrzebny na wytworzenie przeszczepu keratynocytów o odpowiedniej powierzchni jest długi i wynosi 3-4 tygodnie. W tym okresie ryzyko rozwoju powikłań zakaźnych i innych chorób oparzeniowych gwałtownie wzrasta, co znacznie wydłuża całkowity czas pobytu pacjentów w szpitalu. Ponadto autokeratynocyty praktycznie nie zakorzeniają się po przeszczepieniu na ziarninujące rany oparzeniowe, a wysoki koszt specjalnych pożywek wzrostowych i biologicznie czynnych stymulatorów wzrostu keratynocytów znacznie ogranicza ich kliniczne zastosowanie. Inne metody biotechnologiczne, takie jak kolagenoplastyka, przeszczep kriokonserwowanej skóry ksenoskinowej i stosowanie różnych powłok biopolimerowych zwiększają skuteczność leczenia rozległych oparzeń powierzchniowych, ale nie głębokich. Metoda pokrywania powierzchni rany hodowanymi fibroblastami zasadniczo różni się tym, że fibroblasty, a nie keratynocyty, są używane jako główny składnik hodowanej warstwy komórek.

Warunkiem wstępnym opracowania metody były dane, że perycyty otaczające małe naczynia są progenitorowymi komórkami mezenchymalnymi zdolnymi do przekształcania się w fibroblasty, które produkują wiele czynników wzrostu i zapewniają gojenie się ran dzięki silnemu działaniu stymulującemu na proliferację i adhezję keratynocytów. Zastosowanie hodowanych fibroblastów do zamykania powierzchni ran natychmiast ujawniło szereg istotnych zalet tej metody w porównaniu z wykorzystaniem hodowanych keratynocytów. W szczególności uzyskanie fibroblastów w hodowli nie wymaga stosowania specjalnych pożywek i stymulatorów wzrostu, co obniża koszt przeszczepu ponad 10-krotnie w porównaniu z kosztem uzyskania keratynocytów. Fibroblasty łatwo ulegają pasywacji, podczas której częściowo tracą powierzchniowe antygeny zgodności tkankowej, co z kolei otwiera możliwość wykorzystania komórek allogenicznych do produkcji przeszczepów i tworzenia ich banków. Czas potrzebny do uzyskania przeszczepów gotowych do użycia w klinice ulega skróceniu z 3 tygodni (w przypadku keratynocytów) do 1-2 dni (w przypadku fibroblastów). Pierwotną hodowlę fibroblastów można uzyskać poprzez hodowlę komórek z fragmentów skóry pobranych podczas autodermoplastyki, a gęstość wysiewu komórek w celu uzyskania ludzkich subkultur fibroblastów wynosi zaledwie 20 x 10 ³ na 1 cm ².

W celu zbadania wpływu fibroblastów i ich białek regulacyjnych na proliferację i różnicowanie keratynocytów przeprowadzono analizę porównawczą morfologii i proliferacji keratynocytów na podłożach kolagenu typu I i III oraz fibronektyny w hodowli stawowej z fibroblastami ludzkimi. Ludzkie keratynocyty wyizolowano z fragmentów skóry pacjentów z oparzeniami, pobranych w trakcie autodermoplastyki. Gęstość wysiewu keratynocytów wynosiła 50 x 103 komórek na 1 cm2. Skuteczność kliniczną przeszczepu hodowanych fibroblastów oceniono u 517 pacjentów. Wszystkich pacjentów podzielono na dwie grupy: Grupa 1 - dorośli poszkodowani z oparzeniami IIA, B - IV stopnia; Grupa 2 - dzieci z głębokimi oparzeniami IIIB - IV stopnia. Ocena dynamiki organizacji strukturalnej i funkcjonalnej fibroblastów hodowli monowarstwowej z uwzględnieniem roli glikozaminoglikanów, fibronektyny i kolagenu w procesach regeneracji pozwoliła autorom określić 3. dzień jako najbardziej korzystny okres do wykorzystania hodowli fibroblastów do wykonywania przeszczepów. Badanie wpływu fibroblastów na proliferację i różnicowanie keratynocytów wykazało, że fibroblasty in vitro wywierają wyraźny efekt stymulujący, przede wszystkim na procesy adhezji keratynocytów, zwiększając liczbę przyłączonych komórek i szybkość ich fiksacji ponad 2-krotnie. Stymulacji procesów adhezji towarzyszy wzrost intensywności syntezy DNA i poziomu proliferacji keratynocytów. Ponadto okazało się, że obecność fibroblastów i utworzonej przez nie macierzy zewnątrzkomórkowej jest warunkiem koniecznym do formowania aparatu tonofibrylarnego keratynocytów, połączeń międzykomórkowych i ostatecznie do różnicowania keratynocytów i formowania błony podstawnej. W leczeniu dzieci z głębokimi oparzeniami stwierdzono wysoką skuteczność kliniczną przeszczepu hodowli allofibroblastów, szczególnie w grupie pacjentów z rozległymi zmianami skórnymi w warunkach niedoboru miejsca dawczego. Kompleksowe badanie morfofunkcjonalne wykazało, że przeszczepione fibroblasty charakteryzują się aktywną syntezą DNA, a także kolagenu, fibronektyny i glikozaminoglikanów, które są częścią macierzy zewnątrzkomórkowej tworzonej przez komórki. Autorzy wskazują na wysoki odsetek wszczepienia przeszczepionych fibroblastów (do 96%), drastyczne skrócenie czasu ich przyjęcia (w ciągu 24-48 godzin zamiast 2-3 tygodni w przypadku zastosowania keratynocytów), znaczne przyspieszenie nabłonkowania powierzchni oparzenia, a także znaczące obniżenie kosztów (10-krotnie) technologii hodowli przeszczepu z fibroblastów w porównaniu z przeszczepem keratynocytów. Zastosowanie przeszczepu hodowanych allofibroblastów pozwala ratować życie dzieci z krytycznymi oparzeniami - uszkodzeniem termicznym ponad 50% powierzchni ciała,co wcześniej było uważane za nie do pogodzenia z życiem. Należy zauważyć, że w przypadku przeszczepu allogenicznych fibroblastów zarodkowych, nie tylko szybsza regeneracja ran i rekonwalescencja pacjentów z różnym stopniem i obszarem oparzeń, ale także znaczne zmniejszenie ich śmiertelności zostało również przekonująco udowodnione.

Autologiczne fibroblasty są również wykorzystywane w tak złożonej dziedzinie chirurgii plastycznej, jak rekonstrukcyjna korekcja uszkodzeń strun głosowych. W tym celu stosuje się zazwyczaj kolagen wołowy, którego czas działania jest ograniczony jego immunogennością. Będąc białkiem obcym, kolagen wołowy jest wrażliwy na kolagenazę biorcy i może powodować reakcje immunologiczne, w celu zmniejszenia ryzyka, opracowano technologie uzyskiwania preparatów kolagenowych usieciowanych glutaraldehydem. Ich zaletą jest większa stabilność i mniejsza immunogenność, co znalazło praktyczne zastosowanie w eliminowaniu defektów i zaniku strun głosowych. Wstrzyknięcia autologicznego kolagenu zastosowano po raz pierwszy w 1995 roku. Technika ta zapewniała zachowanie pierwotnej struktury autologicznych włókien kolagenowych, w tym wewnątrzcząsteczkowych enzymatycznie katalizowanych wiązań poprzecznych. Faktem jest, że naturalne włókna kolagenowe są bardziej odporne na zniszczenie przez proteazy niż kolagen rekonstytuowany, w którym telopeptydy są cięte. Integralność telopeptydów jest ważna dla czwartorzędowej struktury włókien kolagenowych i tworzenia wiązań poprzecznych między sąsiadującymi cząsteczkami kolagenu. W przeciwieństwie do preparatów kolagenu wołowego, kolagen autologiczny nie wywołuje reakcji immunologicznych u biorcy, ale nie jest wystarczająco skuteczny jako środek uzupełniający. Stabilną korektę można osiągnąć poprzez lokalną produkcję kolagenu poprzez przeszczepienie autologicznych fibroblastów. Jednak podczas badania skuteczności przeszczepu autologicznych fibroblastów w klinice zidentyfikowano pewne trudności. We wczesnym okresie po przeszczepie fibroblastów efekt kliniczny był słabszy w porównaniu z tym po wprowadzeniu kolagenu wołowego. Podczas hodowli autologicznych fibroblastów nie można wykluczyć możliwości przekształcenia normalnych fibroblastów w patologiczne, tzw. miofibroblasty, odpowiedzialne za rozwój włóknienia i tworzenie blizn, o czym świadczy skurcz żelu kolagenowego spowodowany specyficzną interakcją fibroblastów i włókienek kolagenowych. Ponadto po serii pasaży in vitro fibroblasty tracą zdolność syntezy białek macierzy zewnątrzkomórkowej.

Jednakże opracowano obecnie eksperymentalnie metodę hodowli autologicznych ludzkich fibroblastów, która eliminuje wyżej wymienione niedociągnięcia i nie powoduje onkogennej transformacji normalnych fibroblastów. Autologiczne fibroblasty uzyskane tą metodą są wykorzystywane do przywracania defektów w miękkich tkankach twarzy. W badaniu G. Kellera i in. (2000) leczono 20 pacjentów w wieku od 37 do 61 lat ze zmarszczkami i bliznami zanikowymi. Biopsje skóry (4 mm) z okolicy zausznej przetransportowano do laboratorium w sterylnych probówkach zawierających 10 ml pożywki hodowlanej (pożywka Eagle'a z antybiotykiem, mykoseptykiem, pirogronianem i surowicą cielęcą płodową). Materiał umieszczono w 3-5 naczyniach hodowlanych o średnicy 60 mm i inkubowano w termostacie z atmosferą zawierającą 5% CO2. Po 1 tygodniu komórki usunięto z naczyń przez trypsynizację i umieszczono w fiolkach o pojemności 25 cm2. Komórki wstrzykiwano pacjentom w ilości 4 x 107. Znaczący i trwały efekt kliniczny obserwowano u pacjentów podczas korekcji bruzd nosowo-wargowych, a także u pacjentów z bliznami 7 i 12 miesięcy po trzecim przeszczepie autologicznych fibroblastów. Według cytometrii przepływowej hodowane fibroblasty produkowały dużą ilość kolagenu typu I. Badania in vitro wykazały prawidłową kurczliwość wstrzykniętych fibroblastów. Dwa miesiące po podskórnym podaniu hodowanych fibroblastów w dawce 4 x 107 komórek nie wykryto żadnych guzów u myszy nagich. Wstrzyknięte fibroblasty nie powodowały bliznowacenia ani rozlanego włóknienia u pacjentów. Według autora, wszczepione autologiczne fibroblasty są zdolne do ciągłej produkcji kolagenu, co zapewni efekt kosmetycznego odmłodzenia. Jednocześnie, ponieważ żywotność zróżnicowanych komórek jest ograniczona, fibroblasty pobrane od młodego pacjenta są skuteczniejsze niż te uzyskane od osób starszych. Zakłada się, że w przyszłości będzie można kriokonserwować hodowlę fibroblastów pobranych od młodego dawcy, aby później przeszczepić własne młode komórki starszemu pacjentowi. Podsumowując, nie do końca słuszne jest stwierdzenie, że autologiczne fibroblasty, pod warunkiem ich funkcjonalnego zachowania, są idealnym środkiem do korygowania defektów miękkich tkanek twarzy. Jednocześnie sam autor zauważa, że w trakcie badania pojawiły się pewne problematyczne sytuacje związane ze stosowaniem autologicznego układu fibroblast-kolagen. Efekt kliniczny był często słabszy niż przy stosowaniu kolagenu wołowego, co powodowało rozczarowanie u pacjentów.

Ogólnie rzecz biorąc, dane literaturowe dotyczące perspektyw klinicznego wykorzystania komórek macierzystych mezenchymalnych wyglądają dość optymistycznie. Podejmowane są próby wykorzystania autologicznych wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych szpiku kostnego w leczeniu zwyrodnieniowych zmian stawowych. Prowadzone są pierwsze badania kliniczne wykorzystania hodowanych komórek progenitorowych mezenchymalnych w leczeniu złożonych złamań kości. Auto- i allogeniczne komórki podścieliska mezenchymalnego szpiku kostnego są wykorzystywane do tworzenia tkanki chrzęstnej do przeszczepu w celu korekcji ubytków chrząstki stawowej spowodowanych urazem lub zmianami autoimmunologicznymi. Opracowywane są metody klinicznego wykorzystania wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych w celu wyeliminowania ubytków kości u dzieci z ciężką postacią niepełnej osteogenezy spowodowanej mutacjami w genie kolagenu typu I. Po mieloablacji dzieciom biorcom przeszczepia się szpik kostny od zdrowych dawców zgodnych pod względem HLA, ponieważ niefrakcjonowany szpik kostny może zawierać wystarczającą liczbę komórek macierzystych mezenchymalnych, aby zrekompensować poważny ubytek kości. Po przeszczepie allogenicznego szpiku kostnego u takich dzieci zaobserwowano pozytywne zmiany histologiczne w kościach beleczkowych, wzrost tempa wzrostu i zmniejszenie częstości występowania złamań kości. W niektórych przypadkach pozytywny wynik kliniczny uzyskuje się poprzez przeszczepienie blisko spokrewnionego allogenicznego szpiku kostnego i osteoblastów. Przeszczep MSC stosuje się również w leczeniu wrodzonej kruchości kości spowodowanej brakiem równowagi osteoblastów i osteoklastów w tkance kostnej. W tym przypadku przywrócenie formowania kości uzyskuje się poprzez chimeryzację puli komórek macierzystych i progenitorowych podścieliska w tkance kostnej pacjentów.

Kontynuowane jest doskonalenie metod modyfikacji genetycznej dawczych komórek macierzystych mezenchymalnych w celu korekcji defektów genetycznych tkanek podścieliska. Zakłada się, że w najbliższej przyszłości komórki progenitorowe mezenchymalne będą wykorzystywane w neurologii do celowanej chimeryzacji komórek mózgowych i tworzenia zdrowej puli komórek zdolnych do generowania niedoboru enzymu lub czynnika odpowiedzialnego za kliniczne objawy choroby. Transplantacja komórek macierzystych mezenchymalnych może być stosowana do odbudowy podścieliska szpiku kostnego u pacjentów onkologicznych po radio- i chemioterapii, a w połączeniu z komórkami szpiku kostnego - do odbudowy hematopoezy. Rozwój terapii zastępczej ukierunkowanej na eliminację defektów układu mięśniowo-szkieletowego za pomocą MSC jest promowany przez rozwój inżynierii w dziedzinie projektowania biomateriałów matrycowych lub biomimetyków tworzących szkielety zasiedlane przez potomstwo komórek macierzystych mezenchymalnych.

Źródła komórek macierzystych mezenchymalnych

Głównym źródłem komórek macierzystych mezenchymalnych jest szpik kostny, którego hematopoetyczne komórki macierzyste w organizmie ssaków stale różnicują się w komórki krwi i układu odpornościowego, podczas gdy komórki macierzyste mezenchymalne są reprezentowane przez niewielką populację komórek podobnych do fibroblastów podścieliska szpiku kostnego i przyczyniają się do zachowania niezróżnicowanego stanu komórek macierzystych hematopoetycznych. W pewnych warunkach komórki macierzyste mezenchymalne różnicują się w komórki tkanki chrzęstnej i kostnej. Po wysianiu na pożywce hodowlanej w warunkach sadzenia o niskiej gęstości, jednojądrowe komórki podścieliska szpiku kostnego tworzą kolonie komórek adhezyjnych, które są w rzeczywistości fibroblastopodobnymi wielopotencjalnymi komórkami progenitorowymi mezenchymalnymi. Niektórzy autorzy uważają, że niezwiązane komórki macierzyste mezenchymalne są deponowane w szpiku kostnym, które ze względu na swoją zdolność do samoodnawiania i wysoki potencjał różnicowania dostarczają wszystkim tkankom organizmu mezenchymalnych prekursorów elementów podścieliska przez całe życie organizmu ssaka.

W szpiku kostnym elementy komórkowe podścieliska tworzą sieć wypełniającą przestrzeń między zatokami a tkanką kostną. Zawartość uśpionych MSC w szpiku kostnym dorosłego człowieka jest porównywalna z ilością komórek macierzystych hematopoetycznych i nie przekracza 0,01-0,001%. Komórki macierzyste mezenchymalne izolowane ze szpiku kostnego i niepoddawane hodowli są pozbawione cząsteczek adhezyjnych. Takie MSC nie wyrażają CD34, ICAM, VCAM, kolagenów typu I i III, CD44 i CD29. W konsekwencji in vitro na podłożu hodowlanym utrwalane są nie komórki macierzyste mezenchymalne, ale bardziej zaawansowane pochodne progenitorowe komórek macierzystych mezenchymalnych, które utworzyły już składniki cytoszkieletu i aparat receptorowy cząsteczek adhezji komórkowej. Komórki podścieliska o fenotypie CD34 występują nawet we krwi obwodowej, chociaż w szpiku kostnym jest ich znacznie mniej niż komórek jednojądrowych CD34-dodatnich. Komórki CD34 wyizolowane z krwi i przeniesione do hodowli przyczepiają się do podłoża i tworzą kolonie komórek przypominających fibroblasty.

Wiadomo, że w okresie embrionalnym podłoże podścieliska wszystkich narządów i tkanek ssaków i człowieka powstaje ze wspólnej puli komórek macierzystych mezenchymalnych przed i na etapie organogenezy. Dlatego uważa się, że w dojrzałym organizmie większość komórek macierzystych mezenchymalnych powinna znajdować się w tkance łącznej i kostnej. Ustalono, że główną część elementów komórkowych podścieliska luźnej tkanki łącznej i kostnej stanowią zaangażowane komórki progenitorowe, które jednak zachowują zdolność do proliferacji i tworzenia klonów in vitro. Gdy takie komórki zostaną wprowadzone do ogólnego krwiobiegu, ponad 20% komórek progenitorowych mezenchymalnych zostaje wszczepionych pomiędzy elementy podścieliska tkanki hematopoetycznej i narządów miąższowych.

Potencjalnym źródłem komórek macierzystych mezenchymalnych jest tkanka tłuszczowa, wśród której komórek macierzystych zidentyfikowano prekursory adipocytów zaangażowane w różnym stopniu. Najmniej dojrzałymi elementami progenitorowymi tkanki tłuszczowej są komórki podścieliska-naczyniowe, które, podobnie jak wielopotencjalne komórki prekursorowe mezenchymalne szpiku kostnego, są zdolne do różnicowania się w adipocyty pod wpływem glikokortykoidów, insulinopodobnego czynnika wzrostu i insuliny. W hodowli komórki podścieliska-naczyniowego różnicują się w adipocyty i chondrocyty, a w tkance tłuszczowej pochodzącej ze szpiku kostnego znajdują się komórki, które tworzą adipocyty i osteoblasty.

Komórki macierzyste stromalne znaleziono również w mięśniach. W pierwotnej hodowli komórek wyizolowanych z ludzkich mięśni szkieletowych wykryto komórki gwiaździste i wielojądrowe mioblasty. W obecności surowicy końskiej komórki gwiaździste proliferują in vitro bez oznak cytodyferencjacji, a po dodaniu deksametazonu do pożywki ich różnicowanie charakteryzuje się pojawieniem się elementów komórkowych o fenotypie komórek mięśni szkieletowych i gładkich, kości, chrząstki i tkanki tłuszczowej. Dlatego w ludzkiej tkance mięśniowej obecne są zarówno zaangażowane, jak i niezaangażowane wielopotencjalne komórki progenitorowe mezenchymalne. Wykazano, że populacja komórek progenitorowych obecna w mięśniach szkieletowych pochodzi z niezaangażowanych wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych szpiku kostnego i różni się od miogennych komórek satelitarnych.

Adhezyjne komórki gwiaździste odpowiadające wielopotencjalnym komórkom progenitorowym mezenchymalnym w potencjale różnicowania znaleziono również w mięśniu sercowym nowonarodzonych szczurów, ponieważ pod wpływem deksametazonu różnicują się w adipocyty, osteoblasty, chondrocyty, komórki mięśni gładkich, mioblasty mięśni szkieletowych i kardiomiocyty. Wykazano, że komórki mięśni gładkich naczyń (perycyty) są pochodnymi niezróżnicowanych okołonaczyniowych wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych. W hodowli okołonaczyniowe komórki macierzyste mezenchymalne wyrażają receptor a-aktyny mięśni gładkich i czynnika wzrostu pochodzącego z płytek krwi i są zdolne do różnicowania się co najmniej w komórki mięśni gładkich.

Szczególne miejsce, z punktu widzenia rezerw macierzystych, zajmuje tkanka chrzęstna, której niezwykle niski potencjał naprawczy uważa się za spowodowany niedoborem wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych lub czynników różnicowania i wzrostu. Zakłada się, że wielopotencjalne komórki progenitorowe mezenchymalne wstępnie zaangażowane w chondro- i osteogenezę wnikają do tkanki chrzęstnej z innych źródeł tkankowych.

Pochodzenie tkankowe i warunki zaangażowania komórek progenitorowych mezenchymalnych w ścięgnach również nie zostały ustalone. Obserwacje eksperymentalne wskazują, że we wczesnym okresie postnatalnym komórki ścięgna Achillesa królika w hodowlach pierwotnych i podczas pierwszego pasażu zachowują ekspresję kolagenu typu I i dekoryny, ale wraz z dalszą hodowlą tracą markery różnicowania tenocytów.

Należy zauważyć, że odpowiedź na pytanie, czy multipotencjalne komórki progenitorowe mezenchymalne zlokalizowane w różnych tkankach są rzeczywiście stale obecne w swoim podścielisku, czy też tkankowa pula komórek macierzystych mezenchymalnych jest uzupełniana poprzez migrację komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego, nie została dotychczas uzyskana.

Oprócz szpiku kostnego i innych stref tkanki mezenchymalnej dorosłego organizmu, krew pępowinowa może być kolejnym źródłem MSC. Wykazano, że krew z żyły pępowinowej zawiera komórki, które mają podobne cechy morfologiczne i antygenowe do wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych, są zdolne do adhezji i nie są gorsze od wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych pochodzenia szpikowego pod względem potencjału różnicowania. W hodowlach komórek macierzystych mezenchymalnych krwi pępowinowej stwierdzono 5 do 10% niezwiązanych wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych. Okazało się, że ich liczba we krwi pępowinowej jest odwrotnie proporcjonalna do wieku ciążowego, co pośrednio wskazuje na migrację wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych do różnych tkanek w trakcie rozwoju płodowego. Pojawiły się pierwsze informacje na temat klinicznego zastosowania komórek macierzystych mezenchymalnych wyizolowanych z krwi pępowinowej, jak również tych uzyskanych z biomateriału embrionalnego. Wykorzystanie tych informacji opiera się na znanej zdolności komórek macierzystych płodu do integracji, wszczepiania i funkcjonowania w narządach i układach tkanek dorosłych biorców.

Poszukiwanie nowych źródeł komórek macierzystych mezenchymalnych

Wykorzystanie komórek macierzystych mezenchymalnych pochodzenia embrionalnego, jak również innych komórek płodowych, stwarza szereg problemów etycznych, prawnych, sądowych i legislacyjnych. Dlatego też trwają poszukiwania pozazarodkowego materiału komórkowego dawcy. Próba klinicznego wykorzystania ludzkich fibroblastów skóry zakończyła się niepowodzeniem, co było z góry uwarunkowane nie tylko wysokimi możliwościami finansowymi technologii, ale także szybkim różnicowaniem fibroblastów w fibrocyty, które mają znacznie niższy potencjał proliferacyjny i wytwarzają ograniczoną liczbę czynników wzrostu. Dalszy postęp w badaniu biologii MSC i multipotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych szpiku kostnego pozwolił nam opracować strategię klinicznego wykorzystania autologicznych komórek macierzystych mezenchymalnych. Technologia ich izolacji, hodowli, reprodukcji ex vivo i ukierunkowanego różnicowania wymagała przede wszystkim zbadania spektrum markerów molekularnych MSC. Ich analiza wykazała, że pierwotne kultury ludzkiej tkanki kostnej zawierają kilka typów multipotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych. Fenotyp proosteoblastów wykryto w komórkach wyrażających marker komórek progenitorowych podścieliska STRO-1, ale nie niosących markera osteoblastów - fosfatazy alkalicznej. Takie komórki charakteryzują się niską zdolnością do tworzenia zmineralizowanej macierzy kostnej, a także brakiem ekspresji osteopontyny i receptora parathormonu. Pochodne komórek STRO-1-dodatnich, które nie wyrażają fosfatazy alkalicznej, są reprezentowane przez osteoblasty pośrednio i całkowicie zróżnicowane. Stwierdzono, że elementy komórkowe sklonowanych linii STRO-1-dodatnich ludzkich komórek beleczkowych kości są zdolne do różnicowania się w dojrzałe osteocyty i adipocyty. Kierunek różnicowania tych komórek zależy od wpływu wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, prozapalnych cytokin - IL-1b i czynnika martwicy nowotworu a (TNF-a), a także przeciwzapalnego i immunosupresyjnego TGF-b.

Później odkryto, że wielopotencjalne komórki progenitorowe mezenchymalne nie mają specyficznego fenotypu, który jest im właściwy, ale wyrażają kompleks markerów charakterystycznych dla komórek mezenchymalnych, śródbłonkowych, nabłonkowych i mięśniowych przy braku ekspresji immunofenotypowych antygenów komórek hematopoetycznych - CD45, CD34 i CD14. Ponadto komórki macierzyste mezenchymalne konstytutywnie i indukują produkcję hematopoetycznych i niehematopoetycznych czynników wzrostu, interleukin i chemokin, a receptory niektórych cytokin i czynników wzrostu są wyrażane na wielopotencjalnych komórkach progenitorowych mezenchymalnych. Uśpione lub spoczynkowe komórki o immunofenotypie niemal identycznym z profilem antygenowym wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych nieleczonych 5-fluorouracylem zostały znalezione wśród komórek macierzy podścieliska ludzkiego ciała - obie komórki wyrażają CD117, który oznacza „dorosłe” komórki macierzyste.

Tak więc, marker komórkowy unikalny dla komórek macierzystych mezenchymalnych nie został jeszcze zidentyfikowany. Zakłada się, że komórki uśpione stanowią populację niezaangażowanych wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych, ponieważ nie wyrażają markerów komórek zaangażowanych w osteo- (Cbfa-1) lub adipogenezę (PPAR-y-2). Długotrwała ekspozycja wolno proliferujących komórek uśpionych na surowicę płodową bydlęcą prowadzi do powstania ostatecznie różnicujących się zaangażowanych progenitorów charakteryzujących się szybkim wzrostem. Klonalna ekspansja takich komórek macierzystych mezenchymalnych jest wspierana przez FGF2. Wydaje się, że genom komórek macierzystych podścieliska jest dość ściśle „zamknięty”. Istnieją doniesienia o braku spontanicznego różnicowania w MSC - bez specjalnych warunków zaangażowania nie przekształcają się one nawet w komórki linii mezenchymalnej.

Aby zbadać strukturę populacji pochodnych komórek macierzystych mezenchymalnych, przeprowadzono poszukiwania białek markerowych różnicowania na liniach komórek podścieliska i w hodowlach pierwotnych. Analiza klonalna in vitro komórek tworzących kolonie szpiku kostnego wykazała, że EGF zwiększa średnią wielkość kolonii i zmniejsza ekspresję klonalną fosfatazy alkalicznej po zastosowaniu w hodowlach pierwotnych, podczas gdy dodanie hydrokortyzonu aktywuje ekspresję fosfatazy alkalicznej, która jest markerem osteogenicznego kierunku różnicowania MSC. Przeciwciała monoklonalne przeciwko STRO-1 umożliwiły oddzielenie i zbadanie populacji komórek adhezyjnych STRO-1-pozytywnych w heterogenicznym układzie kultur Dextera. Określono spektrum cytokin, które regulują nie tylko proliferację i różnicowanie komórek hematopoetycznych i limfoidalnych, ale także uczestniczą w tworzeniu, formowaniu i resorpcji tkanek szkieletowych poprzez mechanizmy para-, auto- i endokrynologiczne. Uwalnianie za pośrednictwem receptorów takich wtórnych przekaźników, jak cAMP, diacyloglicerol, inozytolotrifosforan i Ca2+, jest również wykorzystywane do analizy markerów różnych kategorii komórek tkanki podścieliskowej wyrażających odpowiadające im receptory. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych jako markerów pozwoliło na ustalenie przynależności komórek siateczkowatych podścieliska narządów limfatycznych do stref T i B-zależnych.

Przez pewien czas trwały naukowe debaty wokół kwestii możliwości pochodzenia MSC z hematopoetycznych komórek macierzystych. Rzeczywiście, gdy zawiesiny komórek szpiku kostnego są eksplantowane do hodowli monowarstwowych, rosną w nich odrębne kolonie fibroblastów. Wykazano jednak, że obecność prekursorów kolonii fibroblastów i różnych pędów różnicowania tkanek hematopoetycznych w szpiku kostnym nie jest dowodem ich wspólnego pochodzenia z hematopoetycznych komórek macierzystych. Wykorzystując analizę dyskryminacyjną komórek macierzystych szpiku kostnego, ustalono, że mikrośrodowisko podczas heterotopowego przeszczepu szpiku kostnego nie jest przenoszone przez komórki hematopoetyczne, co dowodzi istnienia populacji MSC w szpiku kostnym, która jest histogenetycznie niezależna od komórek hematopoetycznych.

Ponadto metoda selektywnego klonowania pozwoliła na zidentyfikowanie nowej kategorii komórek progenitorowych podścieliska w monowarstwowych hodowlach komórek szpiku kostnego, określenie ich liczebności oraz zbadanie ich właściwości, potencjału proliferacyjnego i różnicowania. Okazało się, że komórki podobne do fibroblastów podścieliska proliferują in vitro i tworzą kolonie diploidalne, które po przeszczepieniu z powrotem do organizmu zapewniają powstawanie nowych narządów krwiotwórczych. Wyniki badań poszczególnych klonów wskazują, że wśród komórek progenitorowych podścieliska występuje populacja komórek, które dzięki swojemu potencjałowi proliferacyjnemu i różnicującemu mogą rościć sobie prawo do roli komórek macierzystych tkanki podścieliska, histogenetycznie niezależnych od komórek macierzystych krwiotwórczych. Komórki tej populacji charakteryzują się samowystarczalnym wzrostem i różnicują się w elementy komórek progenitorowych tkanki kostnej, chrzęstnej i siateczkowatej szpiku kostnego.

Bardzo interesujące są wyniki badań R. Chailakhyana i współpracowników (1997-2001), którzy hodowali komórki progenitorowe podścieliska szpiku kostnego pochodzące od królików, świnek morskich i myszy na podłożu odżywczym a-MEM z dodatkiem surowicy cielęcej. Autorzy przeprowadzili eksplantację przy początkowej gęstości 2-4 x 103 komórek szpiku kostnego na 1 cm2. Homologiczne lub heterologiczne komórki szpiku kostnego inaktywowane przez promieniowanie były używane jako podajnik w dawce, która zachowywała efekt podajnika, ale całkowicie blokowała ich proliferację. Dwutygodniowe pierwotne oddzielne kolonie fibroblastów trypsynizowano w celu uzyskania szczepów monoklonalnych. Dowody na klonalne pochodzenie kolonii uzyskano przy użyciu markera chromosomowego w mieszanych kulturach szpiku kostnego samców i samic świnek morskich, fotografii poklatkowej żywych kultur oraz w mieszanych kulturach syngenicznego szpiku kostnego myszy CBA i CBAT6T6. Przeszczepienie zawiesiny świeżo wyizolowanych komórek szpiku kostnego lub fibroblastów podścieliskowych hodowanych in vitro pod torebką nerkową przeprowadzono w rusztowaniach porowatych ivalon lub żelatyna, a także inaktywowanej gąbczastej macierzy kostnej królika. W celu przeszczepienia klonów w pochewce kostnej, kości udowe świnek morskich oczyszczono z tkanki miękkiej i okostnej, przycięto nasadę kości, a szpik kostny dokładnie wypłukano. Kość pocięto na fragmenty (3-5 mm), wysuszono i napromieniowano dawką 60 Gy. Pojedyncze kolonie fibroblastów umieszczono w pochewkach kostnych i wszczepiono domięśniowo. Do wewnątrzotrzewnowego przeszczepu fibroblastów podścieliska hodowanych in vitro zastosowano komory dyfuzyjne typu A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) i O (V=0,15 cm3, h=2 mm).

Badając dynamikę wzrostu szczepów klonalnych, R. Chailakhyan i in. (2001) odkryli, że pojedyncze komórki tworzące kolonie fibroblastów, jak również ich potomkowie, mają ogromny potencjał proliferacyjny. Do 10. pasażu liczba fibroblastów w niektórych szczepach wynosiła 1,2-7,2 x 10 ⁹ komórek. Podczas swojego rozwoju wykonały one do 31-34 podwojeń komórek. W tym przypadku heterotopowa transplantacja szczepów pochodzących ze szpiku kostnego utworzonych przez prekursory podścieliska kilkudziesięciu klonów skutkowała przeniesieniem mikrośrodowiska szpiku kostnego i utworzeniem nowego narządu krwiotwórczego w strefie transplantacji. Autorzy postawili pytanie, czy pojedyncze klony są zdolne do przeniesienia mikrośrodowiska szpiku kostnego komórek podścieliska, czy też wymagana jest do tego współpraca kilku różnych klonogenicznych prekursorów podścieliska? A jeśli poszczególne klony są zdolne do przenoszenia mikrośrodowiska, czy będzie ono kompletne dla wszystkich trzech pędów hematopoetycznych, czy też różne klony zapewniają tworzenie mikrośrodowiska dla różnych pędów hematopoetycznych? Aby rozwiązać te problemy, opracowano technologię hodowli komórek progenitorowych podścieliska na żelu kolagenowym, umożliwiającą usunięcie wyhodowanych kolonii fibroblastów z powierzchni w celu późniejszego przeszczepu heterotopowego. Poszczególne klony fibroblastów podścieliska wyhodowane z komórek szpiku kostnego myszy CBA i świnek morskich wycięto razem z fragmentem powłoki żelowej i przeszczepiono heterotopowo - pod torebkę nerkową myszy syngenicznych lub do mięśnia brzusznego autologicznych świnek morskich. Po przeszczepieniu do mięśnia kolonie na żelu umieszczono w osłonkach kostnych.

Autorzy stwierdzili, że 50-90 dni po przeszczepieniu kolonii fibroblastów szpiku kostnego, w 20% przypadków obserwowano rozwój kości lub tkanki kostnej i krwiotwórczej w strefie przeszczepu. U 5% zwierząt biorców, uformowane ogniska tkanki kostnej zawierały jamę wypełnioną szpikiem kostnym. Wewnątrz cylindrów kostnych, takie ogniska miały zaokrąglony kształt i otoczkę zbudowaną z tkanki kostnej z osteocytami i dobrze rozwiniętą warstwą osteoblastyczną. Jama szpiku kostnego zawierała tkankę siateczkowatą z komórkami mieloidalnymi i erytrocytowymi, których proporcjonalny stosunek nie różnił się od tego w normalnym szpiku kostnym. W nerce przeszczep był typowym narządem szpiku kostnego utworzonym podczas przeszczepu natywnego szpiku kostnego, przy czym otoczka kostna pokrywała jamę szpiku kostnego tylko od strony torebki nerkowej. Tkanka krwiotwórcza obejmowała elementy mieloidalne, erytrocytowe i megakariocytarne. Podścielisko jamy szpikowej miało dobrze rozwinięty układ zatokowy i zawierało typowe komórki tłuszczowe. Jednocześnie w strefie transplantacji niektórych kolonii pod torebką nerkową stwierdzono tkankę kostną bez oznak hematopoezy. Badanie potencjałów proliferacyjnych i różnicujących poszczególnych klonów kontynuowano na monoklonalnych szczepach szpiku kostnego królików, których komórki zawieszono w pożywce i w oddzielnej gąbce ivalon o masie 1-2 mg przeszczepiono pod torebkę nerkową dawcy szpiku kostnego królika. Takiej autotransplantacji poddano komórki 21 szczepów monoklonalnych. Wyniki uwzględniono po 2-3 miesiącach. Autorzy stwierdzili, że w 14% przypadków przeszczepione szczepy monoklonalne utworzyły narząd szpiku kostnego składający się z tkanki kostnej i jamy szpikowej wypełnionej komórkami hematopoetycznymi. W 33% przypadków przeszczepione szczepy utworzyły zwartą kość o różnej wielkości z osteocytami zamurowanymi w jamach i rozwiniętą warstwą osteoblastyczną. W niektórych przypadkach w gąbkach z przeszczepionymi klonami rozwinęła się tkanka siateczkowa bez kości lub elementów hematopoetycznych. Czasami utworzył się podścielisko siateczkowe z dobrze rozwiniętą siecią zatok, ale niezasiedlone komórkami hematopoetycznymi. Tak więc uzyskane wyniki były podobne do danych uzyskanych podczas przeszczepu klonów na żelu kolagenowym. Jednakże, jeśli przeszczep klonów wyhodowanych na podłożu skutkował wytworzeniem tkanki szpiku kostnego w 5% przypadków, tkanki kostnej w 15% i tkanki siateczkowej w 80% przypadków, to przy przeszczepie szczepów monoklonalnych, obserwowano powstawanie elementów szpiku kostnego w 14% przypadków, tkanki kostnej w 53% i tkanki siateczkowej w 53% przypadków. Zdaniem autorów wskazuje to na to, że warunki do realizacji potencjału proliferacyjnego i różnicującego fibroblastów podścieliska podczas przeszczepu na rusztowaniach porowatych były bardziej optymalne niż podczas ich przeszczepu w pochewkach kostnych i na podłożu kolagenowym.Możliwe, że zastosowanie bardziej zaawansowanych metod hodowli i odwrotnej transplantacji klonów może poprawić warunki realizacji ich potencjału różnicowania przez klony i zmienić te stosunki. Tak czy inaczej, ale główne znaczenie przeprowadzonych badań polega na tym, że niektóre klony komórek podścieliska są zdolne do tworzenia tkanki kostnej i jednocześnie zapewniania podścieliskowego mikrośrodowiska hematopoetycznego dla trzech pędów hematopoezy szpiku kostnego naraz: erytrocytowego, mieloidalnego i megakariocytarnego, tworząc dość duże platformy tkanki hematopoetycznej i pewnej masy kostnej.

Następnie autorzy zajęli się kwestią zdolności pojedynczych klonogenicznych komórek progenitorowych podścieliska do przechodzenia tych typów różnicowania komórek w zamkniętym systemie komór dyfuzyjnych. Ponadto konieczne było ustalenie, czy poszczególne klony posiadają polipotencję, czy też manifestacja potencjału różnicowania wymaga współdziałania kilku klonów o ustalonej cesze cytodyferencjacji, których różne stosunki determinują preferencyjne formowanie tkanki kostnej, siateczkowatej lub chrzęstnej. Łącząc dwa podejścia metodologiczne - uzyskanie monoklonalnych szczepów komórek progenitorowych podścieliska szpiku kostnego i przeszczepienie ich do komór dyfuzyjnych - R. Chailakhyan i współautorzy (2001) uzyskali wyniki, które pozwoliły im zbliżyć się do zrozumienia strukturalnej organizacji podścieliska szpiku kostnego. Transplantacja monoklonalnych szczepów komórek progenitorowych podścieliska do komór typu O spowodowała powstanie zarówno tkanki kostnej, jak i chrzęstnej, co wskazuje na zdolność potomków pojedynczej komórki tworzącej kolonię podścieliska do jednoczesnego tworzenia tkanki kostnej i chrzęstnej. Założenie, że tkanka kostna i chrzęstna pochodzą ze wspólnej komórki progenitorowej podścieliska, było wielokrotnie wysuwane. Jednak hipoteza ta nie miała poprawnego potwierdzenia eksperymentalnego. Powstawanie kości i chrząstki w komorach dyfuzyjnych było niezbędnym dowodem istnienia wspólnej komórki progenitorowej dla tych dwóch typów tkanek wśród komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego.

Następnie 29 szczepów klonalnych z drugiego-trzeciego pasażu uzyskanych z pierwotnych kultur szpiku kostnego królika umieszczono w komorach dyfuzyjnych i wszczepiono dootrzewnowo homologicznym zwierzętom. Badania wykazały, że 45% monoklonalnych szczepów szpiku kostnego posiada potencjał osteogenny. Dziewięć komór zawierało wyłącznie tkankę siateczkowatą, ale była ona obecna razem z tkanką kostną i chrzęstną w 13 kolejnych komorach, co stanowiło 76% wszystkich szczepów. W komorach typu O, gdzie możliwe było różnicowanie zarówno tkanki kostnej, jak i chrzęstnej, przebadano 16 szczepów. W czterech komorach (25%) uformowała się zarówno tkanka kostna, jak i chrzęstna. Należy raz jeszcze zauważyć, że w badaniach R. Chailakhyana i in. (2001) pojedyncze komórki progenitorowe przeszły od 31 do 34 podwojeń w obrębie szczepu komórkowego, a ich potomstwo składało się z 0,9-2,0 x 10 ⁹ komórek. Liczba mitoz, jakie przeszły komórki progenitorowe szczepów poliklonalnych, była praktycznie identyczna jak w przypadku szczepów monoklonalnych. Tempo rozwoju szczepów poliklonalnych, zwłaszcza w pierwszej fazie ich formowania, zależało w znacznym stopniu od liczby kolonii użytych do zainicjowania szczepów. Diploidalne szczepy ludzkich fibroblastów zarodkowych (WI-38), po reklonowaniu na poziomie 12-15 podwojenia, również tworzyły kolonie różniące się średnicą i zawartością komórek. Duże kolonie zawierające ponad 103 komórek stanowiły tylko 5-10%. Wraz ze wzrostem liczby podziałów odsetek dużych kolonii malał. Mono- i poliklonalne szczepy fibroblastów podścieliska szpiku kostnego zachowywały diploidalny zestaw chromosomów po 20 i więcej podwojeniach, a tendencja ich rozwoju była porównywalna z dynamiką rozwoju diploidalnych szczepów fibroblastów zarodkowych. Analiza potencjału różnicowania poszczególnych komórek progenitorowych podścieliska szpiku kostnego, przeprowadzona poprzez przeszczepienie szczepów monoklonalnych do komór dyfuzyjnych, wykazała, że połowa z nich była osteogenna. Duże kolonie stanowiły 10% ich całkowitej liczby. W konsekwencji liczba komórek tworzących kolonie osteogenne odpowiadała około 5% ich całkowitej populacji. Całkowita masa zidentyfikowanych przez autorów komórek progenitorowych osteogennych obejmowała komórki zdolne do jednoczesnego tworzenia tkanki kostnej i chrzęstnej. Ponadto po raz pierwszy ustalono, że te dwa rodzaje tkanek w organizmie dorosłym mają wspólną komórkę progenitorową: 25% badanych klonów zostało utworzonych przez takie komórki, a ich liczba wśród całkowitej populacji komórek progenitorowych wynosiła co najmniej 2,5%.

Tak więc, heterotopowa transplantacja pojedynczych klonów fibroblastów szpiku kostnego ujawniła nowe aspekty organizacji strukturalnej populacji komórek progenitorowych mezenchymalnych. Odkryto komórki progenitorowe podścieliska, które są zdolne do przenoszenia specyficznego mikrośrodowiska dla wszystkich pędów hematopoetycznych naraz, których liczba wśród dużych klonów badanych w różnych modelach waha się od 5 do 15% (0,5-1,5% całkowitej liczby wykrytych komórek progenitorowych). Obok klonów, które przenoszą kompletne mikrośrodowisko szpiku kostnego, istnieją komórki progenitorowe przeznaczone wyłącznie do osteogenezy, które po przeniesieniu w układzie otwartym tworzą tkankę kostną, która nie podtrzymuje rozwoju hematopoezy. Ich liczba w stosunku do całkowitej liczby komórek progenitorowych wynosi 1,5-3%. Niektóre z tych komórek są zdolne do tworzenia tkanki kostnej z ograniczonym okresem samoutrzymywania. W konsekwencji populacja komórek progenitorowych podścieliska jest heterogeniczna pod względem potencjału różnicowania. Wśród nich istnieje kategoria komórek, które twierdzą, że są komórkami macierzystymi podścieliska, zdolnymi do różnicowania się we wszystkich trzech kierunkach charakterystycznych dla tkanki podścieliska szpiku kostnego, tworząc kość, chrząstkę i tkankę siateczkowatą. Przedstawione dane pozwalają mieć nadzieję, że przy użyciu różnych markerów komórkowych będzie możliwe określenie wkładu każdego typu komórek podścieliska w organizację specyficznego mikrośrodowiska i wspieranie hematopoezy w kulturach Dextera.

Cechy komórek macierzystych mezenchymalnych

W ostatnich latach ustalono, że w stacjonarnych hodowlach szpiku kostnego wielopotencjalne komórki progenitorowe mezenchymalne są reprezentowane przez ograniczoną populację małych komórek agranularnych (komórki RS-1) charakteryzujących się niską zdolnością do tworzenia kolonii i brakiem ekspresji antygenu Ki-67 specyficznego dla komórek proliferujących. Parametry antygenowe uśpionych komórek RS-1 różnią się od spektrum antygenów szybko proliferujących zaangażowanych komórek progenitorowych podścieliska. Ustalono, że wysokie tempo proliferacji zaangażowanych komórek progenitorowych obserwuje się tylko w obecności komórek RS-1. Z kolei komórki RS-1 zwiększają tempo wzrostu pod wpływem czynników wydzielanych przez najbardziej dojrzałe pochodne wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych. Wydaje się, że komórki RS-1 są podklasą nie zaangażowanych MSC zdolnych do recyklingu. W warunkach in vitro komórki progenitorowe macierzy szpiku kostnego oporne na 5-fluorouracyl charakteryzują się niską zawartością RNA i wysoką ekspresją genu dekarboksylazy ornityny, będącego markerem komórek nieproliferujących.

Intensywna proliferacja komórek progenitorowych podścieliska rozpoczyna się po ich utrwaleniu na podłożu. W tym przypadku ekspresja profilu markerowego słabo zróżnicowanych komórek następuje: SH2 (receptor TGF-(3)), SH3 (domena białka sygnałowego), kolageny typu I i III, fibronektyna, receptory adhezyjne VCAM-1 (CD106) i ICAM (CD54), kadheryna-11, CD44, CD71 (receptor transferyny), CD90, CD120a i CD124, ale bez ekspresji charakterystycznych markerów komórek macierzystych hematopoezy (CD34, CD14, CD45). Wzrost klonalny umożliwia wielokrotne pasażowanie komórek macierzystych mezenchymalnych z wytworzeniem licznych genetycznie jednorodnych komórek pluripotentnych progenitorowych podścieliska w hodowli. Po 2-3 pasażach ich liczba osiąga 50-300 milionów. W hodowli o wystarczającej gęstości, po zatrzymaniu proliferacji, komórki progenitorowe podścieliska, w przeciwieństwie do fibroblastów tkanki krwiotwórczej, różnicują się w adipocyty, miocyty, komórki chrząstki i kości. Połączenie trzech sygnałów regulacyjnych różnicowania, w tym 1-metyloizobutyloksantyny (induktora wewnątrzkomórkowego tworzenia cAMP), deksametazonu (inhibitora fosfolipaz A i C) i indometacyny (inhibitora cyklooksygenazy, który również zmniejsza aktywność syntazy tromboksanu), przekształca do 95% komórek mezenchymalnych progenitorowych w adipocyty. Powstawanie adipocytów z niedojrzałych elementów podścieliska potwierdza ekspresja genu lipazy lipoproteinowej, histochemiczne wykrywanie apolipoprotein i receptorów peroksysomalnych. Komórki tego samego klonu pod wpływem TGF-b w podłożu bez surowicy tworzą jednorodną populację chondrocytów. Wielowarstwowa hodowla komórkowa tej tkanki chrzęstnej charakteryzuje się rozwiniętą macierzą międzykomórkową składającą się z proteoglikanu i kolagenu typu II. W pożywce zawierającej 10% Działanie kompleksu sygnału różnicowania składającego się z b-glicerofosforanu (nieorganicznego donora fosforanu), kwasu askorbinowego i deksametazonu w tej samej hodowli komórek progenitorowych podścieliska prowadzi do tworzenia agregatów komórkowych. W takich komórkach obserwuje się postępujący wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej i poziomów osteopontyny, co wskazuje na tworzenie się tkanki kostnej, której mineralizacja komórek jest potwierdzona postępującym wzrostem zawartości wapnia wewnątrzkomórkowego.

Według niektórych danych zdolność komórek macierzystych mezenchymalnych do nieograniczonego podziału i reprodukcji różnych typów komórek linii różnicowania mezenchymalnego łączy się z wysokim stopniem plastyczności. Po wprowadzeniu do komór lub istoty białej mózgu komórki macierzyste mezenchymalne migrują do miąższu tkanki nerwowej i różnicują się w pochodne linii komórek glejowych lub neuronalnych. Ponadto istnieją informacje na temat transdyferencjacji MSC w komórki macierzyste hematopoezy zarówno in vitro, jak i in vivo. Bardziej szczegółowa analiza w niektórych badaniach wykazała wyjątkowo wysoką plastyczność MSC, która objawia się ich zdolnością do różnicowania w astrocyty, oligodendrocyty, neurony, kardiomiocyty, komórki mięśni gładkich i komórki mięśni szkieletowych. Wiele badań in vitro i in vivo nad potencjałem transdyferencjacyjnym komórek MSC wykazało, że multipotencjalne komórki progenitorowe mezenchymalne pochodzące ze szpiku kostnego różnicują się ostatecznie w linie komórkowe tworzące tkankę kostną, chrzęstną, mięśniową, nerwową i tłuszczową, a także ścięgna i podścielisko wspomagające hematopoezę.

Jednakże inne badania nie ujawniły żadnych oznak ograniczenia pluripotencji genomu komórek macierzystych mezenchymalnych i populacji progenitorowych komórek podścieliska, chociaż zbadano ponad 200 klonów MSC wyizolowanych z jednej hodowli pierwotnej w celu przetestowania możliwej pluripotencji komórek podścieliska. Zdecydowana większość klonów in vitro zachowała zdolność do różnicowania się w kierunkach osteogennym, chrzęstnym i adipogennym. Po wykluczeniu prawdopodobieństwa migracji komórek biorcy poprzez przeszczepienie komórek macierzystych mezenchymalnych pod torebkę nerki lub w komorach dyfuzyjnych okazało się, że komórki progenitorowe podścieliska in situ zachowują heterogeniczny fenotyp, co wskazuje albo na brak czynników restrykcyjnych w strefie przeszczepu, albo na brak pluripotencji MSC jako takiej. Jednocześnie dopuszcza się istnienie rzadkiego typu somatycznych pluripotencjalnych komórek macierzystych, które są wspólnymi prekursorami wszystkich dorosłych komórek macierzystych.

Wielo-, ale nie pluripotencja prawdziwych komórek macierzystych mezenchymalnych, które stanowią bardzo małą część komórek szpiku kostnego i są zdolne do proliferacji w pewnych warunkach podczas hodowli in vitro bez różnicowania, jest potwierdzona ich indukowanym zaangażowaniem w komórki tkanki kostnej, chrzęstnej, tłuszczowej, mięśniowej, a także tenocyty i elementy podścieliska, które wspierają hematopoezę. Z reguły przedłużona ekspozycja na podłoże hodowlane z surowicą cielęcą wywołuje uwalnianie MSC do zaangażowanych komórek progenitorowych podścieliska, których potomstwo ulega spontanicznemu różnicowaniu końcowemu. In vitro możliwe jest osiągnięcie ukierunkowanego tworzenia osteoblastów poprzez dodanie deksametazonu, ß-glicerofosforanu i kwasu askorbinowego do podłoża kondycjonującego, podczas gdy połączenie deksametazonu i sygnałów różnicowania insuliny indukuje tworzenie adipocytów.

Ustalono, że przed wejściem w etap końcowego różnicowania, komórki macierzyste szpiku kostnego MSC początkowo różnicują się w fibroblastopodobne komórki macierzyste mezenchymalne w określonych warunkach hodowli. Pochodne tych komórek in vivo uczestniczą w formowaniu kości, chrząstki, ścięgien, tkanki tłuszczowej i mięśniowej, a także podścieliska, które wspiera hematopoezę. Wielu autorów rozumie termin „multipotencjalne komórki progenitorowe mezenchymalne” jako oznaczający zarówno same komórki MSC, jak i zaangażowane komórki progenitorowe podścieliska szpiku kostnego i tkanek mezenchymalnych. Analiza klonalna multipotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych pochodzących ze szpiku kostnego wykazała, że nieco ponad jedna trzecia wszystkich klonów różnicuje się w osteo-, chondro- i adipocyty, podczas gdy komórki pozostałych klonów mają jedynie potencjał osteogenny i tworzą wyłącznie chondro- i osteocyty. Klon wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych, takich jak BMC-9, w odpowiednich warunkach mikrośrodowiskowych różnicuje się w komórki o fenotypie i cechach funkcjonalnych nie tylko osteoblastów, chondrocytów i adipocytów, ale także komórek podścieliska, które wspierają hematopoezę. Klon komórek RCJ3.1 wyizolowanych ze szpiku kostnego płodu szczura różnicuje się w komórki mezenchymalne o różnych fenotypach. Pod wpływem łącznego działania kwasu askorbinowego, b-glicerofosforanu i deksametazonu elementy komórkowe tego klonu najpierw tworzą wielojądrowe miocyty, a następnie kolejno adipocyty, chondrocyty i wysepki zmineralizowanej tkanki kostnej. Populacja komórek ziarnistych z okostnej płodów szczurów odpowiada niezwiązanym multipotencjalnym komórkom progenitorowym mezenchymalnym, gdyż charakteryzuje się niską szybkością proliferacji, nie wyraża markerów różnicowania, a w warunkach hodowlanych różnicuje się w chondro-, osteo- i adipocyty, a także komórki mięśni gładkich.

Należy zatem uznać, że kwestia pluri- czy multipotencjalności genomu komórek macierzystych mezenchymalnych pozostaje otwarta, co w konsekwencji wpływa także na poglądy dotyczące potencjału różnicowania się komórek progenitorowych podścieliska, który również nie został ostatecznie ustalony.

Doświadczalnie udowodnioną i ważną cechą komórek macierzystych mezenchymalnych jest ich zdolność do opuszczania niszy tkankowej i krążenia w ogólnym krwiobiegu. Aby aktywować program różnicowania genetycznego, takie krążące komórki macierzyste muszą wejść do odpowiedniego mikrośrodowiska. Wykazano, że przy systematycznym wprowadzaniu MSC do krwiobiegu zwierząt biorców, niedojrzałe komórki są wszczepiane do różnych narządów i tkanek, a następnie różnicują się w komórki krwi, miocyty, adipocyty, chondrocyty i fibroblasty. W konsekwencji, w lokalnych strefach tkankowych, interakcje regulujące sygnały zachodzą między niezaangażowanymi i zaangażowanymi komórkami progenitorowymi podścieliska, a także między nimi a otaczającymi dojrzałymi komórkami. Zakłada się, że różnicowanie jest indukowane przez parakrynowe czynniki regulacyjne pochodzenia mezenchymalnego i niemezenchymalnego (czynniki wzrostu, eikozanoidy, cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej), które zapewniają połączenia przestrzenne i czasowe w mikrośrodowisku wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych. Dlatego lokalne uszkodzenie tkanki mezenchymalnej powinno prowadzić do powstania stref mikrośrodowiska wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych, które jakościowo różnią się od kompleksu sygnałów regulacyjnych nienaruszonych tkanek, w których zachodzą procesy regeneracji fizjologicznej, a nie reparacyjnej. Różnica ta jest niezwykle istotna pod względem specjalizacji fenotypu komórkowego w normalnym i indukowanym uszkodzeniem mikrośrodowisku.

Zgodnie z koncepcjami, to właśnie tutaj osadzone są mechanizmy fundamentalnej różnicy między dwoma znanymi procesami – regeneracją fizjologiczną i proliferacją zapalną. Pierwszy z nich kończy się przywróceniem wyspecjalizowanego składu komórkowego tkanki i jej funkcji, podczas gdy wynikiem realizacji procesu proliferacji jest powstanie dojrzałych elementów tkanki łącznej i utrata funkcji strefy uszkodzonej tkanki. Tak więc, aby opracować optymalne programy wykorzystania multipotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych w medycynie regeneracyjno-plastycznej, konieczne jest dokładne zbadanie cech wpływu czynników mikrośrodowiskowych na różnicowanie MSC.

Zależność struktury przedziału komórek macierzystych od komórkowych regulatorów para- i autokrynowych, których ekspresja jest modulowana przez sygnały zewnętrzne, nie budzi wątpliwości. Spośród funkcji czynników regulacyjnych najważniejsze są kontrola asymetrycznego podziału MSC i ekspresja genów determinujących stadia zaangażowania i liczbę podziałów komórkowych. Sygnały zewnętrzne, od których zależy dalszy rozwój MSC, dostarczane są przez ich mikrośrodowisko. W stanie niedojrzałym MSC proliferują przez długi czas, zachowując jednocześnie zdolność do różnicowania się w linie adipocytów, miofibroblastów, podścieliska tkanki krwiotwórczej, komórek chrząstki i kości. Ustalono, że ograniczona populacja CD34-ujemnych elementów komórkowych podścieliska krążących we krwi powraca z ogólnego krwiobiegu do podścieliska szpiku kostnego, gdzie ulega przekształceniu w linie CD34-dodatnich komórek macierzystych krwiotwórczych. Te obserwacje sugerują, że recyrkulacja progenitorowych komórek mezenchymalnych w krwiobiegu utrzymuje równowagę tkankową komórek macierzystych podścieliska w różnych narządach poprzez mobilizację wspólnej puli niedojrzałych elementów podścieliska szpiku kostnego. Różnicowanie MSC w komórki o wielu fenotypach mezenchymalnych i ich udział w regeneracji lub naprawie kości, chrząstki, tkanki tłuszczowej i ścięgien in vivo zostało udowodnione przy użyciu modeli transferu adopcyjnego u zwierząt doświadczalnych. Według innych autorów odległa migracja MSC wzdłuż łożyska naczyniowego jest połączona z krótkim lub lokalnym ruchem wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych w obrębie tkanki podczas naprawy chrząstki, regeneracji mięśni i innych procesów naprawczych.

Lokalne rezerwy macierzyste tkanki podścieliskowej działają jako źródło komórek w procesach fizjologicznej regeneracji tkanek i są uzupełniane przez transport na odległość MSC w miarę zużywania zasobów macierzystych tkanki podścieliskowej. Jednakże w warunkach konieczności awaryjnej mobilizacji potencjału komórkowego naprawczego, na przykład w przypadku urazu wielonarządowego, cały szczebel MSC bierze udział w procesach regeneracji naprawczej, a komórki progenitorowe mezenchymalne szpiku kostnego są rekrutowane na obwód poprzez ogólny przepływ krwi.

Transplantacja komórek macierzystych mezenchymalnych

Można prześledzić pewne paralele między procesami fizjologicznej regeneracji tkanek a ich powstawaniem w trakcie rozwoju wewnątrzmacicznego. W embriogenezie człowieka i ssaków powstawanie różnych typów wyspecjalizowanych komórek następuje z ekto-, mezo- i endodermalnego puli warstw zarodkowych, ale z obowiązkowym udziałem mezenchymy. Luźna sieć komórkowa embrionalnej tkanki mezenchymalnej pełni liczne funkcje regulacyjne, metaboliczne, ramowe i morfogenetyczne. Układanie tymczasowych narządów następuje dopiero po kondensacji mezenchymy ze względu na klonogeniczny wzrost komórek progenitorowych, które generują pierwotne sygnały morfogenetyczne organogenezy. Pochodne stromalne embrionalnej mezenchymy tworzą szkielet komórkowy tymczasowych narządów i stanowią podstawę ich przyszłego zaopatrzenia energetyczno-plastycznego ze względu na wzrost pierwotnych naczyń krwionośnych i limfatycznych. Innymi słowy, elementy stromalne jednostki mikrokrążenia narządów płodowych powstają przed uformowaniem ich jednostek strukturalnych i funkcjonalnych. Ponadto aktywna migracja komórek mezenchymalnych podczas organogenezy zapewnia orientację przestrzenną rozwijających się organów poprzez zaznaczanie granic ich objętości poprzez ograniczenie homeotycznych typów Hox. Struktura podścieliska służy również jako podstawa do montażu jednostek strukturalnych i funkcjonalnych narządów miąższowych, które często obejmują morfogenetycznie i funkcjonalnie całkowicie różne komórki. W konsekwencji, podczas embriogenezy, funkcje mezenchymy są podstawowe i są realizowane poprzez generowanie sygnałów regulacyjnych, które aktywują regionalną proliferację i różnicowanie komórek nabłonka progenitorowego. Embrionalne komórki mezenchymalne wytwarzają czynniki wzrostu, takie jak HGF-b, HGF-b, CSF, dla których komórki progenitorowe miąższu mają odpowiadające receptory. W zróżnicowanej dojrzałej tkance dorosłego organizmu, sieć komórek podścieliska generuje również sygnały w celu utrzymania żywotności i proliferacji komórek progenitorowych pochodzenia niemezenchymalnego. Jednakże spektrum sygnałów regulacyjnych podścieliska w ontogenezie postnatalnej jest inne (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF itp.) i ma na celu zapewnienie fizjologicznej regeneracji lub naprawy uszkodzonych stref tkankowych. Ponadto charakterystyki widmowe czynników regulacyjnych podścieliska w każdym typie tkanki, a nawet w obrębie jednego narządu, są różne. W szczególności hematopoeza i limfopoeza z proliferacją i różnicowaniem komórek hematopoetycznych i immunokompetentnych występują tylko w niektórych narządach, w granicach których działa mikrośrodowisko podścieliska, zapewniając warunki do dojrzewania komórek hematopoetycznych i limfoidalnych. Zdolność komórek hematopoetycznych i limfoidalnych do zasiedlania danego narządu, proliferacji i dojrzewania w jego niszach mikrostrukturalnych zależy od czynników regulacyjnych mikrośrodowiska.

Wśród składników macierzy zewnątrzkomórkowej, które wytwarzają wielopotencjalne komórki progenitorowe mezenchymalne, należy wymienić fibronektynę, lamininę, kolagen i proteoglikany, a także CD44 (receptor hialuronianu i osteopontyny), które odgrywają główną rolę w organizowaniu interakcji międzykomórkowych i tworzeniu macierzy zewnątrzkomórkowej w szpiku kostnym i tkance kostnej. Udowodniono, że wielopotencjalne komórki progenitorowe mezenchymalne szpiku kostnego tworzą mikrośrodowisko podścieliska, które dostarcza sygnałów indukcyjnych i regulacyjnych nie tylko do MSC, ale także do hematopoetycznych komórek progenitorowych i innych niemezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Wiadomo, że udział MSC w hematopoezie jest determinowany przez ich zdolność do różnicowania się w komórki podścieliska, które wspierają hematopoezę, a ten sygnał instrukcyjny jest odbierany przez MSC bezpośrednio z hematopoetycznych komórek macierzystych. Dlatego w kulturze sieć komórek macierzystych podścieliska służy jako baza odżywcza dla rozwoju wszystkich klonów komórek hematopoetycznych.

W dojrzałym organizmie intensywność hemo- i limfopoezy znajduje się w stanie dynamicznej równowagi z „wydatkiem” dojrzałych krwinek i komórek układu odpornościowego na obwodzie. Ponieważ komórki podścieliska szpiku kostnego i narządów limfatycznych odnawiają się niezwykle rzadko, nie dochodzi w nich do znaczącej restrukturyzacji struktur podścieliska. Układ może zostać wyprowadzony z dynamicznej równowagi przez mechaniczne uszkodzenie któregokolwiek z narządów hemo- lub limfopoezy, co prowadzi do równomiernych, sekwencyjnych zmian, które dotyczą nie tylko i nie tyle elementów hematopoetycznych lub limfoidalnych, co struktur podścieliska uszkodzonego narządu. W procesie regeneracji naprawczej najpierw formuje się baza podścieliska, która następnie jest ponownie zasiedlana przez komórki hematopoetyczne lub immunokompetentne. Ten znany od dawna fakt sprawia, że regeneracja pourazowa jest wygodnym modelem do badania mikrośrodowiska podścieliska narządów hematopoetycznych. W szczególności mechaniczne opróżnianie jamy szpikowej kości cewkowych jest wykorzystywane do badania regeneracji naprawczej szpiku kostnego - łyżeczkowanie, które pozwala na szybkie i skuteczne usunięcie tkanki krwiotwórczej ze stanu równowagi dynamicznej. Badając procesy regeneracji naprawczej składników hematopoetycznych i podścieliskowych szpiku kostnego po mechanicznym opróżnieniu jamy szpikowej kości piszczelowej świnek morskich, stwierdzono, że nie ma bezpośredniej korelacji między wskaźnikami regeneracji komórek hematopoetycznych i podścieliskowych (liczba komórek hematopoetycznych, stężenie i liczba komórek progenitorowych podścieliska). Ponadto okazało się, że wzrost populacji komórek progenitorowych podścieliska następuje wcześniej po łyżeczkowaniu, a same fibroblasty podścieliska stają się fosfatazo-dodatnie, co jest typowe dla tkanki osteogennej. Ustalono również, że łyżeczkowanie 3-5 kości cewkowych powoduje wzrost populacji tych komórek w szpiku kostnym kości nieoperowanych, a nawet w śledzionie, która u świnek morskich jest wyłącznie narządem limfopoetycznym.

Obraz morfologiczny procesów naprawczych w szpiku kostnym wyłyżeczkowanych kości piszczelowych świnek morskich generalnie odpowiada danym opisanym w literaturze, uzyskanym w doświadczeniach na zwierzętach innych gatunków, a dynamika zmian zachodzących po usunięciu tkanki krwiotwórczej jest taka sama dla wszystkich gatunków zwierząt, a różnica dotyczy jedynie parametrów czasowych. Morfologicznie kolejność faz przywracania hematopoezy w opróżnionej jamie rdzeniowej składa się z następujących po sobie procesów organizacji skrzepu krwi, tworzenia grubej włóknistej tkanki kostnej, jej resorpcji, rozwoju zatok i tworzenia siateczkowatego podścieliska, które następnie jest ponownie zasiedlane przez elementy krwiotwórcze. W tym przypadku liczba progenitorowych komórek krwiotwórczych w procesie regeneracji tkanki szpiku kostnego wzrasta równolegle ze wzrostem zawartości komórek macierzystych krwiotwórczych.

Yu. Gerasimov i współautorzy (2001) porównali zmiany w liczbie komórek hematopoetycznych i liczbie komórek progenitorowych podścieliska w poszczególnych fazach procesu regeneracji. Okazało się, że ilościowe zmiany w komórkach szpiku kostnego w wyłyżeczkowanej kości odpowiadają dynamice cech morfologicznych regeneracji. Autorzy wiążą spadek zawartości komórkowej w regeneracie w ciągu pierwszych trzech dni z obumieraniem komórek hematopoetycznych na skutek niekorzystnego wpływu mikrośrodowiska stworzonego przez proliferującą tkankę siateczkowatą w zachowanym szpiku kostnym w okolicy nasady kości, a także z powstawaniem ognisk tkanki osteoidalnej w tej ostatniej i uszkodzeniem naczyń podczas łyżeczkowania. W 7-12 dniu wzrost poziomu komórek jądrzastych zbiega się z pojawieniem się pojedynczych ognisk hematopoezy mieloidalnej w strefach proliferacji elementów podścieliska. W 20. dniu pojawiają się znaczne obszary zregenerowanego szpiku kostnego i dobrze rozwinięte zatoki, czemu towarzyszy znaczny wzrost całkowitej liczby komórek. Jednak liczba elementów hematopoetycznych w tym okresie wynosi 68% poziomu kontrolnego. Jest to zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi, że liczba komórek hematopoetycznych po łyżeczkowaniu osiąga normę dopiero w 35–40. dniu po zabiegu.

We wczesnym okresie pourazowym głównym źródłem przywrócenia hematopoezy są lokalne elementy komórkowe zachowane podczas łyżeczkowania. W późniejszych stadiach głównym źródłem regeneracji tkanki hematopoetycznej szpiku kostnego są komórki macierzyste, ponownie zasiedlające wolne strefy podścieliska. Jeśli chodzi o poszczególne kategorie komórek podścieliska (śródbłonkowe, siateczkowate i osteogenne), źródła, które zapewniają ich powstawanie podczas reorganizacji jamy szpikowej, pozostają niejasne. Wyniki badania Yu. V. Gerasimova i współautorów (2001) wskazują, że w szpiku kostnym zachowanym po łyżeczkowaniu stężenie komórek tworzących kolonie fibroblastów jest znacznie wyższe niż w normalnym szpiku kostnym. Autorzy uważają, że łyżeczkowanie powoduje intensywniejsze selektywne wypłukiwanie komórek hematopoetycznych w porównaniu z komórkami podścieliska tworzącymi kolonie, które uczestniczą w tworzeniu podścieliska i są silniej związane z jego główną substancją niż komórki hematopoetyczne.

Dynamika zmian liczby komórek tworzących kolonie fibroblastów koreluje z intensywnością procesów osteogenezy, następczą resorpcją beleczek kostnych i powstawaniem siateczkowatego podścieliska, które jest zasiedlane przez komórki hematopoetyczne. Większość komórek progenitorowych podścieliska w określonych terminach regeneracji tworzy grubą włóknistą tkankę kostną i siateczkowate podścielisko. W przypadku złamań kości udowej w warunkach przedłużonej osteosyntezy, 5 dnia w strefie regeneracji wzrasta stężenie i liczba komórek tworzących kolonie fibroblastów, a w okresie intensywnego kościotworzenia ich liczba wzrasta 6-krotnie. Wiadomo, że komórki szpiku kostnego tworzące kolonie fibroblastów mają właściwości osteogenne. Liczba komórek progenitorowych podścieliska wzrasta przed zasiedleniem wyłyżeczkowanego obszaru szpiku kostnego przez komórki hematopoetyczne. Jest to zgodne z danymi, że komórki podścieliska zapewniają tworzenie mikrośrodowiska hematopoetycznego. Wydaje się, że stworzenie mikrośrodowiska hematopoetycznego wiąże się z pewnym poziomem regeneracji tkanki podścieliskowej, a liczba komórek hematopoetycznych wzrasta wraz z rozbudową platformy podścieliskowej odpowiedniej do hematopoezy.

Największe zainteresowanie budzą dane autorów, że bezpośrednio po łyżeczkowaniu wzrasta liczba komórek progenitorowych podścieliska w odległych częściach szkieletu. Począwszy od szóstej godziny i do dwudziestego dnia włącznie obserwuje się ponad dwukrotny wzrost zarówno stężenia, jak i liczby komórek tworzących kolonie fibroblastów w przeciwległej kości piszczelowej. Mechanizm tego zjawiska jest prawdopodobnie związany z faktem, że masywne uszkodzenie szpiku kostnego prowadzi do powstania dużej liczby skrzepów krwi z jednoczesnym zniszczeniem znacznej liczby płytek krwi i uwolnieniem do krwi czynnika wzrostu pochodzącego z płytek krwi (PDGF), o którym wiadomo, że powoduje proliferację komórek tworzących kolonie fibroblastów zlokalizowanych w organizmie poza pulą proliferacyjną. W eksperymentach na królikach miejscowe podanie MSC sprzyja odbudowie tkanki chrzęstnej chirurgicznie uszkodzonego stawu kolanowego, co może być związane z powstawaniem chondrocytów pochodzących z wstrzykniętych MSC. Jednakże naprawcza regeneracja ubytków kostnych u szczurów laboratoryjnych jest znacznie wzmocniona przez zastosowanie komórek macierzystych mezenchymalnych zamkniętych w ceramicznej ramie. Dlatego można założyć, że jeśli nie RBOC, to jakiś inny czynnik pochodzący z uszkodzonych komórek podścieliska wywiera odległy stymulujący wpływ na proliferację komórek progenitorowych mezenchymalnych w nienaruszonych strefach szpiku kostnego i stymuluje ich migrację do obszaru ubytku szpiku kostnego. Z kolei temu przeczą dane literaturowe z poprzednich lat wskazujące, że komórki podścieliska odpowiedzialne za mikrośrodowisko, w przeciwieństwie do komórek hematopoetycznych, nie są zdolne do migracji i pochodzą ze źródeł lokalnych.

Niemniej jednak wyniki badania Yu. Gerasimova i współpracowników (2001) wskazują, że uraz mechaniczny powoduje nie tylko gwałtowną restrukturyzację tkanki podścieliskowej w wyłyżeczkowanej kości, ale także znaczące zmiany w podścielisku w odległych nienaruszonych kościach, tj. występuje systemowa odpowiedź tkanki podścieliskowej na miejscowy uraz. Co więcej, gdy dochodzi do wielourazowego uszkodzenia - wielokrotnego łyżeczkowania - reakcja ta ulega nasileniu i jest obserwowana nie tylko w operowanej kości i odległych częściach szkieletu, ale także w narządach limfatycznych, w szczególności w śledzionie. Mechanizm takiej systemowej odpowiedzi tkanki podścieliskowej szpiku kostnego i śledziony na miejscowy uraz i wielouraz pozostaje nieznany. Przypuszcza się, że proces ten jest związany z działaniem czynnika humoralnego wydzielanego przez podścielisko mezenchymalne jamy rdzeniowej szpiku kostnego. Możliwość produkcji przez komórki macierzyste szpiku kostnego i śledziony narządowo nieswoistego czynnika humoralnego, odpowiedzialnego za proliferację komórek tworzących kolonie fibroblastów, potwierdzają dane dotyczące ich aktywności stymulującej tworzenie kolonii w monowarstwowych kulturach szpiku kostnego.

W tym kontekście warto zauważyć, że przy systemowym podaniu wielopotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych ich pochodne repopulują nie tylko szpik kostny, ale także inne tkanki, co jest wykorzystywane w szczególności w terapii genowej. Wykazano, że przy dożylnym podaniu dużych ilości MSC z genomem typu dzikiego myszom z mutacją w genie kolagenu I, komórki dawcy zastępują do 30% komórek w tkance kostnej i chrzęstnej biorców, a transfkowane mysie komórki macierzyste mezenchymalne wydzielające ludzką IL-3 skutecznie wspomagają hematopoezę przez 9 miesięcy w przypadku ich równoczesnego podawania z ludzkimi komórkami macierzystymi hematopoetycznymi myszom z niedoborami odporności.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Modyfikacja genetyczna komórek macierzystych mezenchymalnych

Wśród sukcesów eksperymentalnej modyfikacji genetycznej MSC warto odnotować transfeccję genu czynnika IX do ludzkich MSC z późniejszym przeniesieniem komórek transfekcyjnych do myszy z niedoborem odporności, co prowadzi do pojawienia się antyhemofilowego czynnika B we krwi przez 8 tygodni po przeszczepie. W tym eksperymencie przeprowadzono potranslacyjną modyfikację czynnika IX przez y-glutamylokarboksylazę w transfekowanych komórkach. Transdukcja MSC za pomocą wektora retrowirusowego kodującego ludzki czynnik IX była mniej udana - późniejsze podanie tych komórek psu z hemofilią B zapewniło terapeutyczny poziom czynnika IX, utrzymując prawidłową intensywność hemostazy krzepnięcia, tylko przez 12 dni.

Transplantacja komórek macierzystych mezenchymalnych do miąższu mózgu zwierząt wykazała, że niedojrzałe komórki dawcy przekształcają się w populacje neuronalne i glejowe. Wszczepienie pochodnych neuronalnych zdrowej tkanki mezenchymalnej dawcy teoretycznie umożliwia korygowanie genetycznych nieprawidłowości metabolizmu mózgu u pacjentów z chorobą Gauchera i innymi zaburzeniami metabolizmu lipidów, gangliozydów lub węglowodanów.

Eksperymentalne poszukiwanie warunków transdyferencjacji komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego w komórki progenitorowe tkanki nerwowej i wątroby jest w toku. Uwaga badaczy skupia się na kombinacjach induktorów różnicowania i specjalnych kondycjonowanych mediów. W szczególności, aby wyizolować pierwotną hodowlę komórek podścieliska, komórki szpiku kostnego przemyte i zawieszone ponownie w podłożu hodowlanym DMEM/F12 (1/1) z 10% surowicy cielęcej są wysiewane w gęstości 200 000/cm2. Po 24 godzinach komórki nieprzylegające są usuwane, a komórki podobne do fibroblastów przyczepione do plastiku są hodowane przez tydzień. Do różnicowania komórek macierzystych szpiku kostnego w neuroblasty stosuje się podłoże kondycjonowane uzyskane w wyniku trzydniowej hodowli pierwotnej mysich fibroblastów zarodkowych, a także podłoże DMEM/F12 (1/1) z 2% surowicy cielęcej i dodatkiem 20 ng/ml NF lub 10-6 M kwasu retinowego (neuroinduktory stosowane do różnicowania nerwowego mysich i ludzkich komórek macierzystych zarodkowych). Różnicowanie komórek macierzystych szpiku kostnego w komórki prekursorowe hepatocytów indukuje się w podłożu kondycjonowanym powstałym w wyniku trzydniowej hodowli pierwotnej mysich komórek wątroby zarodkowych w podłożu DMEM/F12 (1/1) z dodatkiem 10% surowicy cielęcej.

Tutaj należy raz jeszcze zauważyć, że komórki tworzące kolonie w podścielisku szpiku kostnego są heteromorficzne i można je podzielić na dwa typy. Pierwszy typ obejmuje komórki podobne do fibroblastów, które tworzą filopodia z dużymi jądrami i jednym lub dwoma jąderkami. Drugi typ jest reprezentowany przez małe komórki wrzecionowate. Podczas hodowli komórek obu typów w kondycjonowanym medium uzyskanym na warstwie odżywczej pierwotnych mysich fibroblastów zarodkowych, komórki podobne do neuroblastów pojawiają się w hodowli 3-4 dnia. Na tym etapie najczęściej mają one formę wrzecionowatą z jednym lub dwoma długimi wypustkami kończącymi się filopodiami. Mniej powszechne są komórki piramidalne lub gwiaździste z krótkimi dendrytami. Dendryty niektórych neuroblastów mają charakterystyczne rozszerzenia (pąki wzrostu) i rozgałęzienia w swojej dystalnej części, podczas gdy inne mają wyraźne stożki wzrostu z filopodiami, przez które rosną dendryty. Podobne cechy morfologiczne (pączki i stożki wzrostu z filopodiami) właściwe neuroblastom różnicującym się w neurony zostały szczegółowo opisane w badaniach nad neurogenezą. Na tej podstawie niektórzy autorzy dochodzą do wniosku, że komórki, które znaleźli w hodowli, są neuroblastami. W szczególności E. Shchegelskaya i współautorzy (2002) po hodowli pierwotnej hodowli komórek podścieliska przez dwa tygodnie w kondycjonowanym medium zmienianym co 3–4 dni stwierdzili, że niektóre komórki proliferowały, utrzymując stan niezróżnicowany. Zewnętrznie takie komórki przypominały fibroblasty i zostały wykryte w hodowli wraz z różnicującymi się neuroblastami. Większość komórek (około 80%) znajdowała się na różnych etapach różnicowania w komórki tkanki nerwowej, głównie w neurony. Wypustki dendrytyczne tych komórek znajdowały się w bliskim kontakcie ze sobą, tak że komórki stopniowo tworzyły sekcje sieci nerwowej na podłożu w postaci długich wielokomórkowych pasm. Wypustki dendrytyczne neuroblastów stały się znacznie dłuższe, niektóre z nich przekroczyły długość samego ciała neuronu 8-10 razy. Udział komórek piramidalnych i gwiaździstych stopniowo wzrastał. Dendryty komórek gwiaździstych rozgałęziały się. Zdaniem autorów późniejsze różnicowanie komórek piramidalnych i gwiaździstych w porównaniu do komórek wrzecionowatych odpowiada kolejności etapów normalnej neurogenezy u zwierząt. W rezultacie autorzy wnioskują, że komórki macierzyste podścieliska szpiku kostnego przechodzą indukowaną neurogenezę, podczas której z neuroblastów in vitro powstają wszystkie trzy główne typy neuronów. Prekursory komórek nerwowych wykryto również podczas hodowli komórek podścieliska szpiku kostnego przez 3-4 dni w pożywce z 2% surowicy płodowej i 20 ng/ml LIF. Jednak w tym przypadku komórki macierzyste dzieliły się bardzo powoli, różnicowanie neuroblastów nastąpiło tylko w 30% przypadków i nie tworzyły sieci neuronowych. Wykorzystując kwas retinowy jako jeden z czynników indukujących różnicowanie komórek nerwowych, autorzy uzyskali do 25-30% komórek nerwowych w hodowli,z przewagą elementów glejowych - astrocytów i oligodendrocytów. Neurony stanowiły zaledwie jedną trzecią wszystkich komórek nerwowych, chociaż były reprezentowane przez wszystkie trzy typy: komórki wrzecionowate, piramidalne i gwiaździste. W 6 dniu hodowli komórek podścieliska w podłożu z kwasem retinowym komórki nerwowe stały się bardziej zróżnicowane, a w pojedynczych neuronach piramidalnych stwierdzono aksony, które w normalnej neuroontogenezie pojawiają się później niż powstawanie wypustek dendrytycznych. Zdaniem autorów, pomimo niskiej wydajności komórek nerwowych, metoda indukcji kwasem retinowym ma swoje zalety: oligodendrocyty i astrocyty pełnią funkcje mielinizujące i odżywcze podczas wzrostu dendrytów i aksonów i są niezbędne do prawidłowego tworzenia tkanki nerwowej. Dlatego do naprawy jej uszkodzonych obszarów in vivo lepiej jest zastosować zawiesinę neuronów wzbogaconą o komórki glejowe.

W drugiej serii eksperymentów autorzy próbowali wywołać różnicowanie komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego w komórki wątroby. Po trzech dniach hodowli komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego w kondycjonowanym medium uzyskanym przez inkubację mysich hepatocytów zarodkowych, znaleziono duże, kuliste komórki, często dwujądrowe, z inkluzjami cytoplazmatycznymi o różnej wielkości. Komórki te znajdowały się na różnych etapach różnicowania i różniły się rozmiarem, liczbą jąder i inkluzjami w cytoplazmie. W większości tych komórek wykryto glikogen, na podstawie którego autorzy zidentyfikowali je jako komórki prekursorowe hepatocytów. Ponieważ w hodowli nie znaleziono żadnych komórek podobnych do neuroblastów, stwierdzono, że kondycjonowane medium uzyskane w wyniku hodowli hepatocytów zarodkowych nie zawierało czynników różnicowania komórek nerwowych i odwrotnie, zawierało czynniki indukujące różnicowanie komórek podścieliska szpiku kostnego w komórki prekursorowe hepatocytów. Podsumowując, autorzy sugerują obecność pluripotencji w komórkach podścieliska szpiku kostnego, ponieważ różnicują się one in vitro w komórki nerwowe lub tkanki wątroby w zależności od zastosowanych specyficznych warunków środowiskowych i induktorów.

Niektóre badania rzeczywiście prawidłowo wykazały różnicowanie komórek macierzystych szpiku kostnego w kardiomiocyty, komórki chrząstki, kości i tkanki nerwowej. Istnieją dowody, że wśród komórek szpiku kostnego występują populacje komórek macierzystych zdolnych do różnicowania się w hepatocyty. W świetle tych danych wyniki powyższych eksperymentów na myszach można nadal uważać za dalsze potwierdzenie obecności w szpiku kostnym pluripotentnych komórek macierzystych mezenchymalnych zdolnych do różnicowania się w komórki różnych tkanek dorosłego organizmu.

Transplantacja komórek macierzystych mezenchymalnych

W transplantologii klinicznej ludzkie komórki macierzyste mezenchymalne mogą być stosowane w celu zapewnienia ekspansji komórek macierzystych układu krwiotwórczego, jak również ich wczesnych prekomisyjnych potomków. W szczególności wprowadzenie autologicznych komórek macierzystych układu krwiotwórczego i MSC pacjentom onkologicznym po chemioterapii wysokodawkowej przyspiesza przywracanie liczby neutrofili i płytek krwi we krwi obwodowej. Allo- i autologiczne przeszczepy komórek macierzystych mezenchymalnych są stosowane w leczeniu szpiczaka mnogiego, niedokrwistości aplastycznej i samoistnej trombocytopenii - chorób związanych z pierwotnym defektem w podścielisku tkanki hematopoetycznej. Skuteczność terapii komórkowej w onkohematologicznej patologii jest w wielu przypadkach wyższa przy jednoczesnym wprowadzeniu komórek macierzystych podścieliska i hematopoetycznych, co objawia się skróceniem pooperacyjnego okresu przywracania hematopoezy, zmniejszeniem liczby zgonów z powodu nieselektywnego niszczenia regionalnych i krążących komórek nowotworowych, w których giną również własne komórki progenitorowe hematopoetyczne pacjenta. Perspektywy wykorzystania MSC i innych multipotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych w praktyce klinicznej wynikają ze względnej łatwości ich uzyskania z aspiratów szpiku kostnego, ekspansji w hodowli i transfeccji genów terapeutycznych. Jednocześnie miejscowa implantacja multipotencjalnych komórek progenitorowych mezenchymalnych może być stosowana w celu kompensacji lokalnych defektów tkankowych, a w przypadku ogólnoustrojowych dysfunkcji tkanek pochodzenia mezenchymalnego nie wyklucza się ich wprowadzenia do ogólnego krwiobiegu.

Autorzy prac, w których analizuje się perspektywy wykorzystania MSC do przeszczepów miejscowych, systemowych i terapii genowej z punktu widzenia biologii komórek podścieliska, są ostrożniejsi w swoim rozumowaniu. Tradycyjnie szpik kostny po urodzeniu jest uważany za narząd składający się z dwóch głównych układów wyraźnie zdefiniowanych linii komórkowych - samej tkanki krwiotwórczej i związanego z nią podścieliska. Dlatego też komórki macierzyste mezenchymalne szpiku kostnego były początkowo traktowane wyłącznie jako źródło podłoża podścieliska do produkcji czynników regulacyjnych mikrośrodowiska krwiotwórczego. Następnie uwaga badaczy przeniosła się na badanie roli MSC jako źródła macierzystego tkanek szkieletowych. Najnowsze dane wskazują na nieoczekiwany potencjał różnicowania komórek podścieliska szpiku kostnego z tworzeniem tkanki nerwowej lub mięśniowej. Innymi słowy, komórki macierzyste mezenchymalne wykazują plastyczność transgermalną - zdolność do różnicowania się w typy komórek fenotypowo niezwiązane z komórkami tkanki pierwotnej. Jednocześnie niektóre aspekty biologii komórek macierzystych szpiku kostnego pozostają niejasne i nierozwiązane zarówno w ogólnych terminach biologicznych, jak i w poszczególnych szczegółach, w tym identyfikacja, natura, pochodzenie, rozwój i funkcja in vivo komórek macierzystych szpiku kostnego, a także dopuszczalny potencjał różnicowania ex vivo i możliwości terapeutycznego wykorzystania in vivo. Dane uzyskane na temat potencjału MSC, a także wyniki badań nad potencjałem regeneracyjnym innych komórek macierzystych, stoją w ostrej sprzeczności z dogmatami ustanowionymi w biologii.

W hodowli o niskiej gęstości komórki macierzyste podścieliska szpiku kostnego tworzą odrębne kolonie, z których każda pochodzi z pojedynczej komórki progenitorowej. Procent komórek progenitorowych podścieliska w jądrzastych komórkach szpiku kostnego, określony przez zdolność do tworzenia kolonii, jest w dużym stopniu zależny zarówno od warunków hodowli, jak i gatunków MSC. Na przykład u gryzoni obecność napromieniowanych komórek odżywczych szpiku kostnego i surowicy w hodowli jest absolutnie konieczna do uzyskania maksymalnej liczby komórek progenitorowych podścieliska, podczas gdy u ludzi wydajność tworzenia kolonii przez komórki macierzyste mezenchymalne jest niezależna zarówno od komórki odżywczej, jak i od podłoża hodowlanego. Liczba znanych czynników mitogennych, które stymulują proliferację komórek progenitorowych podścieliska, jest ograniczona. Należą do nich PDGF, EGF, FGF, TGF-b i IGF1. W optymalnych warunkach hodowli poliklonalne linie MSC mogą wytrzymać ponad 50 podziałów komórkowych in vitro, co umożliwia uzyskanie miliardów komórek podścieliska szpiku kostnego z 1 ml aspiratu.

Jednakże populacja komórek macierzystych szpiku kostnego jest heterogenna, co objawia się zarówno zmiennością wielkości kolonii, różnym tempem ich powstawania, jak i różnorodnością morfologii komórkowej, która obejmuje zakres od wrzecionowatych komórek przypominających fibroblasty do dużych płaskich komórek. Podczas rozwoju takich kultur, heterogeniczność fenotypowa jest również zauważalna po 20 dniach. Niektóre kolonie charakteryzują się wysoką ekspresją fosfatazy alkalicznej, inne nie wyrażają jej wcale, a kolonie trzeciego typu są fosfatazo-dodatnie w regionie centralnym i fosfatazo-ujemne na obwodzie. Poszczególne kolonie tworzą guzki tkanki kostnej (początek mineralizacji macierzy jest oznaczany przez barwienie czerwienią alizarynową lub wapniem według Van Kossa). W innych koloniach występuje akumulacja tłuszczu, identyfikowana przez barwienie G czerwienią olejową. Rzadziej kolonie komórek macierzystych mezenchymalnych tworzą chrząstki barwione błękitem alcjańskim).

Po ektopowym przeszczepieniu do zwierząt doświadczalnych, poliklonalne linie MGK tworzą ektopową kość z siateczkowatym podścieliskiem związanym z mielopoezą i adipocytami, a rzadziej z tkanką chrzęstną. Gdy przeszczepiane są monoklonalne linie komórek podścieliskowych szpiku kostnego, w niektórych przypadkach obserwuje się chimeryzm, w którym de novo kość składa się z komórek tkanki kostnej, zawiera podścielisko i adipocyty pochodzenia dawcy, podczas gdy komórki linii hematopoetycznej i układu naczyniowego pochodzą od biorcy.

Wyniki tych badań potwierdzają macierzysty charakter komórek macierzystych macierzystych szpiku kostnego, z których wywodzi się linia klonalna. Wskazują one również, że nie wszystkie komórki klonogeniczne w hodowli są prawdziwie wielopotencjalnymi komórkami macierzystymi. Niektórzy badacze uważają, a my podzielamy ich opinię, że najbardziej wiarygodne informacje na temat rzeczywistego potencjału różnicowania poszczególnych klonów można uzyskać jedynie in vivo po przeszczepie, a nie poprzez określenie fenotypu ich pochodnych in vitro. Ekspresja w hodowli markerów fenotypowych osteo-, chondro- lub adipogenezy (określonych za pomocą mRNA lub technik histochemicznych), a nawet produkcja zmineralizowanej macierzy nie odzwierciedlają stopnia pluripotencji pojedynczego klonu in vivo. Dlatego identyfikacja komórek macierzystych w grupie komórek macierzystych jest możliwa jedynie a posteriori, w odpowiednich warunkach biologicznego testu transplantacyjnego. W szczególności chondrogenezę bardzo rzadko obserwuje się w otwartych systemach transplantacji, podczas gdy tworzenie chrząstki nie jest niczym niezwykłym w zamkniętych systemach, takich jak komory dyfuzyjne lub mikrokultury in vitro komórek podścieliska, gdzie osiąga się lokalne niskie napięcie tlenu, co sprzyja tworzeniu tkanki chrzęstnej. Dlatego nawet technika transplantacji, jak również niespecyficzne warunki hodowli in vitro, znacząco wpływają na zakres różnicowania MSC.

Eksperymentalna transplantacja w określonych warunkach eksperymentalnych jest złotym standardem określania potencjału różnicowania komórek macierzystych szpiku kostnego i kluczowym elementem ich identyfikacji. Historycznie rzecz biorąc, badania nad transplantacją komórek macierzystych szpiku kostnego są związane z ogólnym problemem transplantacji szpiku kostnego. Ustalono, że mikrośrodowisko hematopoetyczne powstaje w wyniku transplantacji linii komórek macierzystych szpiku kostnego i zapewnia ektopowy rozwój tkanki hematopoetycznej w strefie transplantacji. Pochodzenie mikrośrodowiska od dawcy i tkanki hematopoetycznej od gospodarza pozwala nam uznać ektopową kość za prawdziwy „odwrócony” przeszczep szpiku kostnego. Lokalna transplantacja komórek macierzystych szpiku kostnego sprzyja skutecznej korekcji defektów kości, bardziej wyraźnej niż w przypadku spontanicznej regeneracji naprawczej. Kilka badań przedklinicznych na modelach eksperymentalnych przekonująco wykazało możliwość wykorzystania przeszczepów komórek podścieliska szpiku kostnego w ortopedii, chociaż potrzeba najbardziej starannej pracy i analizy, aby zoptymalizować te metody, nawet w najprostszych przypadkach. W szczególności optymalne warunki ekspansji osteogenicznych komórek podścieliska ex vivo nie zostały jeszcze ustalone, struktura i skład idealnego nośnika, a także liczba komórek niezbędnych do objętościowej regeneracji kości, pozostają nieopracowane.

Oprócz wykorzystania ex vivo rozszerzonych komórek macierzystych szpiku kostnego do regeneracji tkanek pochodzenia mezenchymalnego, nieortodoksyjna plastyczność MSC otwiera potencjalne zastosowania do regeneracji komórek nerwowych lub dostarczania produktów genowych do OUN. Zasadniczo upraszcza to terapię komórkową uszkodzeń układu nerwowego, ponieważ nie ma potrzeby uzyskiwania autologicznych ludzkich komórek macierzystych układu nerwowego. Zgłaszano potencjalne zastosowania komórek szpiku kostnego do generowania kardiomiocytów i miogennych komórek progenitorowych zarówno prawdziwego pochodzenia podścieliskowego, jak i pozapodścieliskowego.

Prowadzone są eksperymenty nad systemowym przeszczepem komórek macierzystych szpiku kostnego w celu leczenia powszechnych chorób szkieletowych. Nie ma wątpliwości, że komórki macierzyste szpiku kostnego są populacją odpowiedzialną za zaburzenia genetyczne w chorobach szkieletowych, co dobrze ilustruje wektorowy transfer informacji genetycznej za pomocą tych komórek, co prowadzi do powstawania patologicznej tkanki kostnej u zwierząt doświadczalnych. Jednak zdolność komórek macierzystych do implantacji, wszczepiania, proliferacji i różnicowania w kościach szkieletowych po wprowadzeniu do ogólnego krwiobiegu nie została jeszcze udowodniona.

Dzieje się tak częściowo dlatego, że w standardowym przeszczepie szpiku kostnego podścielisko nie jest przeszczepiane razem z tkanką hematopoetyczną, więc ścisłe kryteria oceny udanego wszczepienia ogólnoustrojowo podawanych komórek podścieliska nie zostały jeszcze opracowane. Należy pamiętać, że obecność genów markerowych w ekstraktach tkankowych lub izolacja komórek pochodzenia dawcy w hodowli nie wskazuje na wszczepienie komórek, a jedynie na ich przeżycie. Nawet śródtętnicze wstrzyknięcie komórek podścieliska szpiku kostnego do kończyny myszy może prowadzić do praktycznie zerowego wszczepienia, pomimo faktu, że komórki pochodzenia dawcy występują w dużej liczbie w mikronaczyniach szpiku kostnego. Niestety, takie komórki są zwykle opisywane jako „wszczepione” po prostu na podstawie wykrycia genów markerowych dla komórek dawcy w hodowli ex vivo. Ponadto należy przedstawić przekonujące dowody długoterminowej integracji zróżnicowanych i funkcjonalnie aktywnych komórek pochodzenia dawcy w badanych tkankach. W wielu opublikowanych artykułach donoszących o wszczepianiu komórek macierzystych szpiku kostnego w szkielet, brak wyraźnych danych tego rodzaju jest uderzający. Należy jednak zauważyć, że niektóre prawidłowe eksperymenty na zwierzętach rzeczywiście wykazały ograniczone, ale rzeczywiste wszczepianie komórek macierzystych macierzystych po ich podaniu systemowym.

Dane te są zgodne z wynikami badań nad możliwością dostarczania miogennych komórek progenitorowych szpiku kostnego do mięśni za pośrednictwem układu naczyniowego. Nie należy jednak zapominać, że zarówno tkanka szkieletowa, jak i mięśniowa powstają podczas rozwoju i wzrostu w oparciu o ruchy komórek pozanaczyniowych, które wykorzystują procesy migracji, które nie obejmują krążenia krwi. Jeśli istnieje niezależna droga krążenia do dostarczania komórek progenitorowych do tkanek fazy stałej, czy można założyć istnienie fizjologicznie krążących komórek progenitorowych mezenchymalnych? Jakie jest pochodzenie tych komórek zarówno w rozwijającym się, jak i poporodowym organizmie i w jaki sposób przenikają one przez ścianę naczyniową? Rozwiązanie tych pytań wydaje się absolutnie konieczne i wymaga najbardziej starannej analizy przedklinicznej. Nawet po znalezieniu odpowiedzi na te pytania problematyczne aspekty kinetyczne związane ze wzrostem szkieletu i przebudową tkanki łącznej pozostaną nierozwiązane. Jednocześnie leczenie zaburzeń osteogenezy poprzez zastąpienie całej populacji zmutowanych komórek progenitorowych szkieletu zdrowymi elementami podścieliska wydaje się być realną perspektywą kliniczną. W tym przypadku lokalne strefy złamań lub deformacje spowodowane patologiczną osteogenezą, a także destrukcyjne zmiany w tkance kostnej, mogą być korygowane za pomocą komórek macierzystych podścieliska hodowanych in vitro. Dlatego wskazane jest skoncentrowanie przyszłych badań na problemach transformacji lub korekty genetycznej autologicznych zmutowanych komórek progenitorowych osteogenicznych ex vivo.

Inżynieria genetyczna komórek, krótkoterminowa lub stała, stała się podstawą biologii komórkowej i molekularnej, źródłem wielu odkryć naukowych dotyczących roli poszczególnych białek w metabolizmie komórkowym in vitro i in vivo. Zastosowanie technologii molekularnych do korygowania patologii dziedzicznych i chorób człowieka jest bardzo obiecujące dla medycyny praktycznej, ponieważ właściwości komórek macierzystych podścieliska szpiku kostnego umożliwiają opracowanie unikalnych schematów transplantacji w celu korygowania chorób genetycznych szkieletu. Jednocześnie komórki prekursorowe mezenchymalne można łatwo uzyskać od przyszłego biorcy, są podatne na manipulacje genetyczne i są zdolne do namnażania się w dużych ilościach w krótkim czasie. Zastosowanie komórek macierzystych mezenchymalnych pozwala uniknąć ograniczeń i ryzyka związanego z dostarczaniem materiału informacyjnego genetycznego bezpośrednio do pacjenta za pomocą wewnątrznaczyniowych konstrukcji wektorowych. Podobna strategia ma zastosowanie do komórek macierzystych zarodka, ale autologiczne komórki podścieliska szpiku kostnego po urodzeniu są bardziej preferowanym materiałem, ponieważ ich wprowadzenie wyklucza możliwe powikłania immunologiczne po przeszczepie. Aby uzyskać krótkotrwały efekt, na przykład przyspieszenie regeneracji kości, najbardziej optymalną metodą jest modyfikacja genetyczna komórek macierzystych mezenchymalnych za pomocą elektroporacji, fuzji chemicznej, lipofekcji, plazmidów i konstrukcji adenowirusowych. W szczególności, transfekcja wirusowa do komórek macierzystych szpiku kostnego BMP-2 okazała się skuteczna w przyspieszaniu regeneracji kości w doświadczalnych urazach wielonarządowych. Tworzenie konstrukcji wektorowych adenowirusowych jest preferowane ze względu na brak toksyczności. Jednak modyfikacja genetyczna komórek macierzystych szpiku kostnego w tym przypadku charakteryzuje się wyjątkowo niską stabilnością. Ponadto, normalne transformowane komórki macierzyste szpiku kostnego wymagają użycia nośników wektorowych informacji genetycznej, które są 10 razy bardziej zakaźne niż inne typy komórek, co znacznie zwiększa odsetek śmierci transfekowanych komórek.

Leczenie chorób recesywnych wywołanych niską lub zerową aktywnością biologiczną niektórych genów wymaga długotrwałej lub trwałej modyfikacji komórek macierzystych mezenchymalnych, co wymaga stosowania wirusów adeno-zależnych, retrowirusów, lentiwirusów lub chimer adeno-retrowirusowych. Regiony transportowe tych wirusów są zdolne do przenoszenia dużych transfektów DNA (do 8 kb). Literatura naukowa donosiła już o egzogennej aktywności biologicznej komórek podścieliska szpiku kostnego transfekowanych konstruktami retrowirusowymi kodującymi syntezę cząsteczek regulatorowych i markerowych - IL-3, CD2, czynnik VIII, a także enzymów biorących udział w syntezie L-DOPA. Jednak nawet w tych badaniach autorzy wskazują na szereg ograniczeń, które należy pokonać przed praktycznym zastosowaniem tej technologii. Pierwszym problemem jest optymalizacja procesu modyfikacji MSC ex vivo. Wiadomo, że długotrwała (3-4 tygodnie) proliferacja komórek podścieliska szpiku kostnego in vitro zmniejsza ich transfekcję. Jednocześnie, aby osiągnąć wysoki poziom modyfikacji genetycznej MSC, konieczne jest przeprowadzenie kilku cykli transfeccji. Drugi problem wiąże się z czasem trwania ekspresji genów terapeutycznych, który nie przekracza jeszcze czterech miesięcy. Naturalny spadek efektywnej ekspresji genów jest spowodowany inaktywacją promotora i śmiercią zmodyfikowanych komórek. Biorąc pod uwagę ogólne perspektywy przenoszenia informacji genetycznej za pomocą komórek macierzystych mezenchymalnych, wyniki wstępnych badań wskazują na potrzebę dalszej optymalizacji metod transfeccji ex vivo, wyboru odpowiedniego promotora regulującego aktywność biologiczną w pożądanym kierunku oraz zwiększenia zdolności zmodyfikowanych komórek macierzystych szpiku kostnego do samoutrzymywania się in vivo po przeszczepie. Należy zauważyć, że stosowanie konstrukcji retrowirusowych do modyfikacji komórek macierzystych szpiku kostnego w pożądanym kierunku nie zawsze wymaga ich obowiązkowego wszczepienia. Transfkowane komórki macierzyste mezenchymalne mogą pełnić funkcję naprawczą na tle stabilnej rezydencji i bez obowiązkowej aktywnej fizycznej inkorporacji i funkcjonowania w tkance łącznej. W tym przypadku należy je traktować jako biologiczną mini-pompę produkującą in vivo czynnik, którego niedobór determinuje wystąpienie patologii genetycznej.

Znacznie bardziej problematyczne jest wykorzystanie transformowanych komórek macierzystych szpiku kostnego do leczenia dominującej patologii genetycznej, która charakteryzuje się ekspresją genu o patologicznej lub nieprawidłowej aktywności biologicznej, ponieważ w tym przypadku konieczne jest zablokowanie transferu lub implementacji zniekształconej informacji genetycznej. Jedną z metod inżynierii genetycznej jest homologiczna rekombinacja komórek macierzystych zarodka w celu tworzenia zwierząt transgenicznych. Jednak niezwykle niski stopień homologicznej rekombinacji w połączeniu z problemami identyfikacji, separacji i ekspansji takich rekombinantów prawdopodobnie nie przyczyni się do powszechnego stosowania tej metody w najbliższej przyszłości, nawet jeśli zostaną opracowane nowe metody technologiczne. Drugie podejście w terapii genowej dominującej patologii opiera się na automatycznej korekcie uszkodzonego DNA, ponieważ mutacje genetyczne można korygować poprzez wprowadzenie egzogennego DNA o pożądanej sekwencji (krótkie oligonukleotydy DNA lub chimeryczne oligonukleotydy RNA/DNA), które wiąże się z homologami w uszkodzonym genomie. Trzecia opcja polega na blokowaniu przekazywania informacji patologicznych. Można to osiągnąć poprzez zastosowanie specjalnie zaprojektowanych oligonukleotydów, które wiążą się ze specyficznym genem, tworząc strukturę helisy potrójnej, eliminując możliwość transkrypcji.

Chociaż korekta choroby genetycznej na poziomie genomu pozostaje najbardziej optymalną i preferowaną metodą terapeutyczną, mRNA jest również obiecującym wektorem (być może nawet bardziej dostępnym) do blokowania dominującego genu negatywnego. Cząsteczki białka z oligonukleotydem antysensowym lub kompletnymi sekwencjami blokującymi wiązanie mRNA z aparatem biosyntezy komórkowej są od dawna stosowane w celu zahamowania translacji i/lub zwiększenia degradacji mRNA. Ponadto dwuniciowy RNA indukuje szybką degradację mRNA, której mechanizm pozostaje niejasny. Jednak mało prawdopodobne jest, aby samo wyeliminowanie mRNA transkrybowanych z mutowanego allelu z krótkimi lub pojedynczymi mutacjami promowało ekspresję mRNA normalnego allelu. Alternatywą jest zastosowanie rybosyntez typu hammerhead i hairpin, które mają zdolność wiązania się z wysoce specyficznymi regionami mRNA z późniejszą indukcją ich rozszczepienia i inaktywacji podczas translacji. Obecnie bada się możliwość wykorzystania tej metody w terapii patologicznej osteogenezy. Niezależnie od tego, co dokładnie jest celem - elementy genomiczne czy cytoplazmatyczne - sukces nowych technologii terapii genowej będzie zależał od skuteczności wprowadzania odczynników do komórek macierzystych szpiku kostnego ex vivo, optymalnego wyboru konkretnego wektora oraz stabilnej zdolności komórek macierzystych mezenchymalnych do ekspresji niezbędnych czynników in vivo.

Tak więc odkrycie komórek macierzystych mezenchymalnych o ich nieoczekiwanych właściwościach tworzy nowy schemat koncepcyjny dla rozwoju linii komórkowych. Jednak konieczne są dalsze badania interdyscyplinarne, aby zrozumieć biologiczną rolę komórek macierzystych podścieliska, ich naturę, ich zdolność do transdyferencjacji lub dedyferencjacji, ich znaczenie fizjologiczne podczas rozwoju embrionalnego, wzrostu postnatalnego, dojrzewania i starzenia się, a także w chorobach człowieka.