Neuronalne komórki macierzyste

Dowody eksperymentalne na możliwość regeneracji komórek OUN uzyskano znacznie wcześniej niż odkrycie komórek macierzystych zarodka w badaniach, które wykazały obecność komórek w neokorze, hipokampie i opuszkach węchowych mózgu dorosłych szczurów, które wychwytują 3H-tymidynę, tj. są zdolne do syntezy i podziału białek. Jeszcze w latach 60. ubiegłego wieku zakładano, że komórki te są prekursorami neuronów i bezpośrednio uczestniczą w procesach uczenia się i zapamiętywania. Nieco później ujawniono obecność synaps na neuronach utworzonych de novo i pojawiły się pierwsze prace nad wykorzystaniem komórek macierzystych zarodka w celu indukowania neurogenezy in vitro. Pod koniec XX wieku eksperymenty z ukierunkowanym różnicowaniem ESC w komórki progenitorowe neuronów, neurony dopaminergiczne i serotoninergiczne doprowadziły do rewizji klasycznych poglądów na temat zdolności komórek nerwowych ssaków do regeneracji. Wyniki licznych badań przekonująco udowodniły zarówno realność przebudowy sieci neuronowych, jak i obecność neurogenezy w całym okresie życia postnatalnego organizmu ssaków.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Źródła komórek macierzystych układu nerwowego

Ludzkie nerwowe komórki macierzyste są izolowane podczas operacji w okolicy podkomorowej komór bocznych i zębatego zakrętu hipokampa, których komórki tworzą neurosfery (neuralne sfery) w hodowli, a po rozproszeniu i preformacji tych ostatnich - wszystkie główne typy komórek ośrodkowego układu nerwowego lub, w specjalnym medium, nowe mikrosfery. W hodowlach zawiesinowych zdysocjowanej tkanki wyizolowanej z okolic okołokomorowych mózgu zarodkowego powstają również neurosfery.

Markery niedojrzałych komórek mózgowych obejmują nestynę, beta-tubulinę III (marker linii neuronalnej), wimentynę, GFAP i NCAM, które są identyfikowane immunocytochemicznie przy użyciu przeciwciał monoklonalnych. Nestyna (pośrednie białko neurofilamentu typu IV) jest wyrażana przez wielopotencjalne komórki neuroektodermalne. To białko jest używane do identyfikowania i izolowania wielopotencjalnych komórek progenitorowych neuroepitelialnych z OUN przy użyciu przeciwciał monoklonalnych Rat-401, które mogą wykryć do 95% komórek cewy nerwowej u zarodków szczurów jedenastego dnia ciąży. Nestyna nie jest wyrażana na zróżnicowanych potomkach komórek macierzystych neuronów, ale jest obecna we wczesnych komórkach progenitorowych neuronów, neuronach postmitotycznych i wczesnych neuroblastach. Ten marker był używany do identyfikowania komórek progenitorowych neuroepitelialnych i do udowodnienia istnienia komórek macierzystych w OUN. Wimentyna (pośrednie białko neurofilamentu typu III) jest wyrażana przez komórki progenitorowe neuronów i komórek glejowych, a także neurony, fibroblasty i komórki mięśni gładkich. Dlatego oba markery immunocytochemiczne nie mają specyficzności wymaganej do oddzielnej identyfikacji komórek macierzystych i progenitorowych neuronów. Beta-tubulina III ustala neuronalny kierunek różnicowania komórek macierzystych, podczas gdy astrocyty typu I są identyfikowane przez ekspresję GFAP, a oligodendrocyty specyficznie wyrażają galaktocerebrozyd (Ga!C).

FGF2 i EGF działają jako mitogeny dla komórek progenitorowych neuronów, wspomagając proliferację niezróżnicowanych komórek progenitorowych w hodowli z tworzeniem neurosfer. Szybkość podziału komórek macierzystych neuronów znacznie wzrasta pod wpływem FGF2, a także przy zastosowaniu kombinacji FGF2 + EGF. Proliferacyjne działanie FGF2 jest pośredniczone przez receptory FGF2-R1. Heparyna zwiększa powinowactwo wiązania receptora FGF2 i dramatycznie wzmacnia jego mitogenny wpływ na komórki nabłonka nerwowego. We wczesnych stadiach embriogenezy receptory FGF2 są wyrażane w telencephalonie szczura, podczas gdy w późniejszych stadiach ich lokalizacja jest ograniczona do strefy komorowej. Szczyt ekspresji FGF2-R1 przez komórki postmitotyczne obserwuje się po zakończeniu wczesnego okresu neurogenezy. Początkowy okres rozwoju telencephalonie charakteryzuje się niskim poziomem ekspresji receptora EGF, głównie w komórkach regionu brzusznego. Na późniejszych etapach embriogenezy ekspresja EGF-R wzrasta w kierunku grzbietowym. W mózgu gryzoni EGF ma duże powinowactwo do receptora transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-beta-R), z którym wiąże się preferencyjnie. Pośrednich dowodów na funkcjonalną rolę EGF-R dostarczają dane dotyczące dysgenezji korowej przedniego mózgu, która występuje w późnym okresie embriogenezy i postnatalnej ontogenezy, zmniejszonej funkcji przedniego mózgu, śmierci komórek korowych i ektopii hipokampa u myszy z wyłączonym genem receptora EGF. Ponadto obecność TGF-a w podłożu odżywczym jest absolutnie niezbędna do tworzenia neurosfer. Po usunięciu czynników wzrostu z kondycjonowanego podłoża komórki przestają się dzielić i ulegają spontanicznemu różnicowaniu z tworzeniem neuronów, astrocytów i oligodendroblastów.

Biorąc to pod uwagę, reagregację rozdzielonych komórek macierzystych i hodowlę neurosfer przeprowadza się w pożywkach zawierających EGF i podstawowy FGF lub FGF2, ale bez dodawania surowicy. Wykazano, że EGF indukuje proliferację komórek macierzystych strefy podwyściółkowej komór bocznych, a podstawowy FGF promuje proliferację komórek macierzystych prążkowia, hipokampa, neokorteksu i nerwu wzrokowego dojrzałego mózgu. Połączenie EGF i podstawowego FGF jest absolutnie niezbędne do aktywnej proliferacji komórek macierzystych izolowanych z wyściółki trzeciej i czwartej komory przodomózgowia, a także z kanału kręgowego piersiowego i lędźwiowego rdzenia kręgowego.

Po dysocjacji zawiesinę nerwowych komórek macierzystych hoduje się w plastikowych naczyniach lub wielodołkowych płytkach bez adhezyjnego podłoża, aby zwiększyć rozmiar nowo utworzonych neurosfer, co zwykle trwa około 3 tygodni. Metoda wielokrotnej dyspersji i reprodukcji neurosfer pozwala na uzyskanie wystarczającej liczby liniowych klonów wielopotencjalnych komórek macierzystych do przeszczepu śródmózgowego. Zasada ta jest również podstawą tworzenia banku komórek macierzystych izolowanych z ludzkiego mózgu embrionalnego. Ich długotrwałe (przez kilka lat) klonowanie umożliwia uzyskanie stabilnych linii nerwowych komórek macierzystych, z których podczas indukowanego różnicowania powstają neurony katecholaminergiczne.

Jeśli neurosfery nie są rozproszone i nie rosną na podłożach adhezyjnych w mediach pozbawionych czynników wzrostu, proliferujące komórki macierzyste zaczynają spontanicznie różnicować się, tworząc neuronalne i glejowe komórki prekursorowe wyrażające markery wszystkich typów komórek nerwowych: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulinę III (neurony), GFAP (astrocyty) i CalC, 04 (oligodendrocyty). W przeciwieństwie do komórek myszy i szczurów, neurony stanowią ponad 40% wszystkich zróżnicowanych komórek w hodowlach ludzkich komórek macierzystych nerwowych (od 1 do 5% u gryzoni), ale powstaje znacznie mniej oligodendrocytów, co jest bardzo ważne z punktu widzenia terapii komórkowej chorób demielinizacyjnych. Problem rozwiązuje się poprzez dodanie pożywki hodowlanej B104, która stymuluje powstawanie komórek wytwarzających mielinę.

Podczas hodowli komórek progenitorowych neuronów z mózgu ludzkich zarodków w podłożu zawierającym EGF, podstawowy FGF i LIF liczba komórek prekursorowych linii neuronów wzrasta 10 milionów razy. Komórki namnażane in vitro zachowują zdolność do migracji i różnicowania się w elementy nerwowe i glejowe po przeszczepieniu do mózgu dojrzałych szczurów. Jednak in vivo liczba podziałów wielopotencjalnych komórek prekursorowych jest ograniczona. Wielokrotnie zauważono, że limit Hayflicka dla „dorosłej” nerwowej komórki macierzystej (około 50 mitoz) jest nadal nieosiągalny nawet w eksperymencie - komórki w postaci neurosfer zachowują swoje właściwości tylko przez 7 miesięcy i dopiero po 8 pasażowaniach. Uważa się, że wynika to ze specyfiki ich metod dyspersji podczas pasażu (trypsynizacji lub działania mechanicznego), co gwałtownie zmniejsza aktywność proliferacyjną komórek z powodu zerwania kontaktów międzykomórkowych. Rzeczywiście, jeśli zamiast dyspersji zastosuje się metodę podziału neurosfer na 4 części, żywotność komórek podczas pasażu znacznie wzrasta. Metoda ta pozwala na hodowlę ludzkich komórek macierzystych nerwowych przez 300 dni. Jednak po tym okresie komórki tracą aktywność mitotyczną i ulegają degeneracji lub wchodzą w etap spontanicznego różnicowania z tworzeniem neuronów i astrocytów. Na tej podstawie autor uważa, że 30 mitoz to maksymalna liczba podziałów dla hodowanych komórek macierzystych nerwowych.

Gdy ludzkie komórki macierzyste układu nerwowego są hodowane in vitro, powstają głównie neurony GABAergiczne. Bez specjalnych warunków, komórki progenitorowe układu nerwowego dają początek neuronom dopaminergicznym (niezbędnym do terapii komórkowej choroby Parkinsona) tylko w pierwszych pasażach, po czym wszystkie neurony w hodowli składają się wyłącznie z komórek GABAergicznych. U gryzoni IL-1 i IL-11, a także fragmenty błon komórek nerwowych, LIF i GDNF, powodują indukcję neuronów dopaminergicznych in vitro. Jednak to podejście metodologiczne okazało się nieskuteczne u ludzi. Niemniej jednak, gdy neurony GABAergiczne są przeszczepiane wewnątrzczaszkowo in vivo, pod wpływem czynników mikrośrodowiskowych powstają komórki nerwowe o różnych fenotypach mediatorów.

Poszukiwanie kombinacji czynników neurotroficznych wykazało, że FGF2 i IL-1 indukują powstawanie dopaminergicznych neuroblastów, które jednak nie są zdolne do produkcji neuronów dopaminergicznych. Różnicowanie komórek macierzystych hipokampa w pobudzające neurony glutaminergiczne i hamujące neurony GABA-ergiczne zachodzi pod wpływem neurotrofin, a EGF i IGF1 indukują powstawanie neuronów glutaminergicznych i GABA-ergicznych z komórek progenitorowych neuronów ludzkich zarodków. Sekwencyjne dodawanie kwasu retinowego i neurotrofiny 3 (NT3) do hodowli znacząco zwiększa różnicowanie dojrzałych komórek macierzystych hipokampa mózgu w neurony o różnej naturze mediatorowej, podczas gdy kombinacja czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BNDF), NT3 i GDNF może wytwarzać neurony piramidowe w hodowlach hipokampa i neokortykalnych.

Tak więc wyniki licznych badań wskazują, że po pierwsze, komórki macierzyste z różnych struktur mózgu pod wpływem lokalnych specyficznych czynników tkankowych są zdolne do różnicowania się in vivo w fenotypy neuronalne właściwe tym strukturom. Po drugie, ukierunkowane indukowane różnicowanie neuronalnych komórek macierzystych in vitro przy użyciu klonowania komórek progenitorowych umożliwia uzyskanie komórek nerwowych i glejowych o określonych cechach fenotypowych do przeszczepu śródmózgowego w różnych postaciach patologii mózgu.

Nie ma wątpliwości, że pluripotentne komórki macierzyste izolowane z zarodków lub dorosłego OUN można uznać za źródło nowych neuronów i wykorzystać w klinice do leczenia patologii neurologicznej. Jednak główną przeszkodą w rozwoju praktycznej neurotransplantacji komórkowej jest fakt, że większość nerwowych komórek macierzystych nie różnicuje się w neurony po wszczepieniu do nieneurogennych stref dojrzałego OUN. Aby ominąć tę przeszkodę, zaproponowano bardzo oryginalną innowacyjną metodę, która umożliwia uzyskanie in vitro czystej populacji neuronów z ludzkich płodowych komórek macierzystych nerwowych po przeszczepieniu do OUN dojrzałego szczura. Autorzy dowodzą, że różnicowanie komórek wszczepionych tą metodą kończy się powstaniem neuronów o fenotypie cholinergicznym, co jest spowodowane wpływem czynników otaczającego mikrośrodowiska. Proponowana technologia jest interesująca z punktu widzenia opracowywania nowych typów terapii opartej na komórkach macierzystych i zastępowania neuronów uszkodzonych w wyniku urazu lub choroby neurodegeneracyjnej, ponieważ neurony cholinergiczne odgrywają wiodącą rolę w rozwoju funkcji motorycznych, pamięciowych i uczenia się. W szczególności neurony cholinergiczne izolowane z ludzkich komórek macierzystych mogą być używane do zastępowania neuronów ruchowych utraconych w stwardnieniu zanikowym bocznym lub urazach rdzenia kręgowego. Obecnie nie ma informacji na temat metod wytwarzania znacznej liczby neuronów cholinergicznych z populacji komórek macierzystych utworzonych za pomocą mitogenów. Autorzy proponują dość prostą, ale skuteczną metodę stymulowania pierwotnych ludzkich zarodkowych komórek macierzystych utworzonych za pomocą mitogenów do rozwinięcia się w praktycznie czyste neurony po wszczepieniu do stref nieneurogennych i neurogennych OUN dojrzałego szczura. Najważniejszym rezultatem ich pracy jest przekształcenie wystarczająco dużej liczby przeszczepionych komórek w neurony cholinergiczne po wszczepieniu do błony środkowej i rdzenia kręgowego.

Ponadto, do preformacji komórek macierzystych układu nerwowego z 8-tygodniowej ludzkiej zarodkowej kory mózgowej do neuronów cholinergicznych in vitro, proponuje się zastosowanie różnych kombinacji następujących czynników troficznych i pierwiastków chemicznych: rekombinowanego podstawowego FGF, EGF, LIF, aminokońcowego peptydu dźwiękowego myszy (Shh-N), kwasu trans-retinowego, NGF, BDNF, NT3, NT4, naturalnej lamininy i mysiej heparyny. Oryginalna linia ludzkich komórek macierzystych układu nerwowego (K048) była utrzymywana in vitro przez dwa lata i przetrwała 85 pasaży bez zmian we właściwościach proliferacyjnych i różnicujących, zachowując jednocześnie normalny diploidalny kariotyp. Nierozproszone neurosfery pasaży 19–55 (tygodnie 38–52) zostały posiane na poli-d-lizynie i lamininie, a następnie poddane działaniu wyżej wymienionych czynników w różnych stężeniach, kombinacjach i sekwencjach. Połączenie podstawowego FGF, heparyny i lamininy (w skrócie FHL) dało wyjątkowy efekt. Po jednym dniu hodowli zarodkowych komórek macierzystych układu nerwowego w podłożu FHL z dodatkiem Shh-N lub bez niego (kombinacja Shh-N + FHL w skrócie SFHL) zaobserwowano szybką proliferację dużych komórek planarnych. Wszystkie inne jednodniowe protokoły (takie jak podstawowy FGF + laminina) doprowadziły do ograniczonego promienistego rozprzestrzeniania się komórek wrzecionowatych, a komórki te nie opuściły rdzenia neurosfer. Po 6 dniach aktywacji i kolejnych 10 dniach różnicowania w podłożu zawierającym B27, duże wielobiegunowe komórki neuronopodobne wykryto na krawędzi aktywowanych przez FHL sfer. W innych grupach protokołów większość komórek neuronopodobnych pozostała mała i dwubiegunowa lub jednobiegunowa. Analiza immunocytochemiczna wykazała, że małe (< 20 μm) komórki bipolarne lub unipolarne były albo GABAergiczne, albo glutaminergiczne, podczas gdy większość dużych komórek wielobiegunowych zlokalizowanych na krawędziach neurosfer aktywowanych przez FHL była cholinergiczna, wyrażając markery charakterystyczne dla neuronów cholinergicznych (Islet-1 i ChAT). Niektóre z tych neuronów jednocześnie wyrażały synapsynę 1. W wyniku pięciu serii niezależnych eksperymentów autorzy odkryli, że całkowita populacja komórek w strefach pojedynczej warstwy różnicowała się w neurony TuJ1+ w 45,5%, podczas gdy neurony cholinergiczne (ChAT^) stanowiły tylko 27,8% komórek tej samej populacji. Po 10 dniach dodatkowego różnicowania in vitro, oprócz neuronów cholinergicznych, w aktywowanych przez FHL neurosferach stwierdzono znaczną liczbę małych neuronów - glutaminergicznych (6,3%), GABA-ergicznych (11,3%), a także astrocytów (35,2%) i komórek nestyno-pozytywnych (18,9%). Przy stosowaniu innych kombinacji czynników wzrostu, neurony cholinergiczne były nieobecne, a komórki brzeżne neurosfer tworzyły albo astrocyty, albo małe neurony glutaminergiczne i GABA-ergiczne. Monitorowanie potencjałów rezerwowych i aktywnych przy użyciu techniki whole-cell patch clamp wykazało, że po siedmiu dniach aktywacji FHL większość dużych komórek polipolarnych miała potencjał spoczynkowy -29,0±2,0 mV przy braku potencjału czynnościowego. Po 2 tygodniach potencjał spoczynkowy wzrósł do -63.6±3,0 mV, a potencjały czynnościowe obserwowano w momencie indukcji prądów depolaryzujących i zostały one zablokowane przez 1 M tetrodotoksynę, co wskazuje na aktywność funkcjonalną niedojrzałych neuronów cholinergicznych.

Autorzy ustalili ponadto, że aktywacja FHL lub SFHL in vitro sama w sobie nie powoduje formowania dojrzałych neuronów i próbowali ustalić, czy komórki macierzyste FHL lub SFHL są zdolne do różnicowania się w neurony cholinergiczne po przeszczepieniu do OUN dojrzałych szczurów. W tym celu aktywowane komórki wstrzyknięto do strefy neurogennej (hipokamp) i do kilku stref nieneurogennych, w tym do kory przedczołowej, błony środkowej i rdzenia kręgowego dorosłych szczurów. Wszczepione komórki śledzono za pomocą wektora CAO-^^p. Wiadomo, że OCP znakuje zarówno ultrastrukturę komórkową, jak i procesy komórkowe (poziom molekularny) bez wycieku i można je bezpośrednio uwidocznić. Ponadto znakowane OCP komórki macierzyste neuronów utrzymują profil różnicowania neuronów i glejów identyczny z profilem niezmienionych komórek macierzystych mózgu embrionalnego.

Jeden do dwóch tygodni po wszczepieniu 5 x 104 ^aktywowanych i znakowanych komórek macierzystych neuronów, znaleziono je w rdzeniu kręgowym lub mózgu szczurów, przy czym komórki OCD+ znajdowały się głównie w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Procesy migracji i integracji obserwowano już miesiąc po przeszczepie. Granice migracji różniły się w zależności od miejsca wstrzyknięcia: po wstrzyknięciu do kory przedczołowej komórki OCD+ znajdowały się 0,4-2 mm od miejsca wstrzyknięcia, podczas gdy w przypadku wszczepienia do błony środkowej, hipokampa lub rdzenia kręgowego komórki migrowały na znacznie większe odległości - do 1-2 cm. Przeszczepione komórki były zlokalizowane w wysoce zorganizowanych strukturach OUN, w tym w korze czołowej, błonie środkowej, hipokampie i rdzeniu kręgowym. Elementy neuronalne znakowane OCD były widoczne już w pierwszym tygodniu po przeszczepie, a ich liczba znacznie wzrosła miesiąc po operacji. Analiza stereologiczna wykazała wyższy wskaźnik przeżywalności wszczepionych komórek w różnych strukturach mózgu, w porównaniu do rdzenia kręgowego.

Wiadomo, że w większości tkanek dorosłego organizmu ssaka zachowana jest populacja regionalnych komórek macierzystych, których transformacja w dojrzałe komórki regulowana jest przez specyficzne czynniki tkankowe. Proliferacja komórek macierzystych, różnicowanie komórek progenitorowych i kształtowanie się specyficznych dla danej struktury mózgu fenotypów neuronalnych in vivo wyrażane są w znacznie większym stopniu w mózgu embrionalnym, co jest uwarunkowane obecnością wysokich stężeń czynników morfogenetycznych lokalnego mikrośrodowiska - neurotrofin BDNF, NGF, NT3, NT4/5 i czynników wzrostu FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Gdzie znajdują się komórki macierzyste układu nerwowego?

Ustalono, że nerwowe komórki macierzyste ekspresują kwaśne białko fibrylarne glejowe, które wśród dojrzałych komórek linii nerwowej jest zatrzymywane tylko na astrocytach. Dlatego komórki astrocytowe mogą być rezerwą macierzystą w dojrzałym OUN. Rzeczywiście, neurony pochodzące z prekursorów GFAP-pozytywnych zostały zidentyfikowane w cebulkach węchowych i zakręcie zębatym, co przeczy tradycyjnym poglądom na temat roli progenitorowej gleju radialnego, który nie ekspresuje GFAP w zakręcie zębatym w wieku dorosłym. Możliwe jest, że w OUN występują dwie populacje komórek macierzystych.

Kwestia lokalizacji komórek macierzystych w strefie podkomorowej również pozostaje niejasna. Według niektórych autorów komórki wyściółki tworzą w hodowli kuliste klony, które nie są prawdziwymi neurosferami (jak klony komórek podwyściółkowych), ponieważ są zdolne do różnicowania się wyłącznie w astrocyty. Z drugiej strony, po znakowaniu fluorescencyjnym lub wirusowym komórek wyściółki, marker jest wykrywany w komórkach warstwy podwyściółkowej i cebulkach węchowych. Tak znakowane komórki in vitro tworzą neurosfery i różnicują się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Ponadto wykazano, że około 5% komórek w wyściółce wyraża markery macierzyste - nestynę, Notch-1 i Mussashi-1. Przyjmuje się, że mechanizm asymetrycznej mitozy jest związany z nierównomiernym rozmieszczeniem receptora błonowego Notch-1, w wyniku czego ten ostatni pozostaje na błonie komórki potomnej zlokalizowanej w strefie wyściółki, podczas gdy komórka macierzysta migrująca do warstwy podwyściółki jest pozbawiona tego receptora. Z tego punktu widzenia strefę podwyściółki można uważać za kolektor prekursorów progenitorowych neuronów i gleju powstających z komórek macierzystych warstwy wyściółki. Według innych autorów w częściach ogonowych strefy podkomorowej powstają tylko komórki glejowe, a źródłem neurogenezy są komórki części rostralno-bocznej. W trzecim wariancie przedniej i tylnej części strefy podkomorowej komór bocznych nadano równoważny potencjał neurogenny.

Czwarty wariant organizacji rezerwy macierzystej w ośrodkowym układzie nerwowym wydaje się korzystniejszy, zgodnie z którym w strefie podkomorowej wyróżnia się trzy główne typy komórek progenitorowych neuronów - A, B i C. Komórki A wyrażają wczesne markery neuronalne (PSA-NCAM, TuJl) i są otoczone przez komórki B, które są identyfikowane jako astrocyty przez ekspresję antygenów. Komórki C, niemające antygenowych cech neuronów ani gleju, mają wysoką aktywność proliferacyjną. Autor przekonująco udowodnił, że komórki B są prekursorami komórek A i de novo neuronów cebulek węchowych. Podczas migracji komórki A są otoczone pasmami komórek progenitorowych neuronów, co znacznie różni się od mechanizmu migracji postmitotycznych neuroblastów wzdłuż gleju radialnego w mózgu embrionalnym. Migracja kończy się w opuszkach węchowych podziałem mitotycznym komórek A i B, których pochodne zostają włączone do warstw komórek ziarnistych i do warstwy kłębuszkowej strefy węchowej mózgu.

Rozwijający się mózg embrionalny nie ma zróżnicowanych komórek wyściółki, a ściany komór zawierają proliferujące komórki macierzyste stref zarodkowej i podkomorowej, gdzie migrują pierwotne neuro- i glejaki. Na tej podstawie niektórzy autorzy uważają, że obszar podwyściółki dojrzałego mózgu zawiera zredukowaną tkankę nerwową zarodkową składającą się z astrocytów, neuroblastów i niezidentyfikowanych komórek. Prawdziwe komórki macierzyste nerwowe stanowią mniej niż 1% komórek w strefie zarodkowej bocznej ściany komory. Częściowo z tego powodu, a także w związku z danymi, że astrocyty strefy podwyściółki są prekursorami komórek macierzystych nerwowych, nie wyklucza się możliwości transdyferencjacji astrocytarnych elementów glejowych z nabyciem neuronalnych cech fenotypowych.

Główną przeszkodą w ostatecznym rozwiązaniu problemu lokalizacji nerwowych komórek macierzystych in vivo jest brak specyficznych markerów dla tych komórek. Niemniej jednak bardzo interesujące z praktycznego punktu widzenia są doniesienia, że nerwowe komórki macierzyste zostały wyizolowane z regionów OUN, które nie zawierają stref podwyściółkowych - trzeciej i czwartej komory przodomózgowia, kanału kręgowego piersiowego i lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego. Szczególnie istotny jest fakt, że uszkodzenie rdzenia kręgowego zwiększa proliferację komórek macierzystych wyściółkowych kanału centralnego z tworzeniem komórek progenitorowych migrujących i różnicujących się w astrocyty blizny glejodermalnej. Ponadto w nieuszkodzonym rdzeniu kręgowym dorosłych szczurów znaleziono również komórki prekursorowe astro- i oligodendrocytów.

Tak więc dane literaturowe przekonująco dowodzą obecności w OUN dorosłych ssaków, w tym człowieka, regionalnego rezerwuaru macierzystego, którego regeneracyjno-plastyczna pojemność, niestety, jest w stanie zapewnić jedynie procesy regeneracji fizjologicznej z tworzeniem nowych sieci neuronowych, ale nie zaspokaja potrzeb regeneracji reparacyjnej. Stawia to zadanie poszukiwania możliwości zwiększenia zasobów macierzystych OUN środkami egzogennymi, co jest nierozwiązywalne bez jasnego zrozumienia mechanizmów formowania OUN w okresie embrionalnym.

Dziś wiemy, że w trakcie rozwoju embrionalnego komórki macierzyste cewy nerwowej są źródłem trzech typów komórek - neuronów, astrocytów i oligodendrocytów, czyli neuronów i neuroglii, które powstają z pojedynczej komórki prekursorowej. Różnicowanie ektodermy w skupiska neuronalnych komórek progenitorowych rozpoczyna się pod wpływem produktów genów proneuralnych rodziny bHLH i jest blokowane przez ekspresję receptorowych pochodnych białek transbłonowych genów rodziny Notch, które ograniczają determinację i wczesne różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych. Z kolei ligandami receptorów Notch są transbłonowe białka Delta sąsiednich komórek, dzięki domenie zewnątrzkomórkowej, której przeprowadzane są bezpośrednie kontakty międzykomórkowe z oddziaływaniem indukcyjnym między komórkami macierzystymi.

Dalsza realizacja programu neurogenezy embrionalnej nie jest mniej złożona i, jak się wydaje, powinna być specyficzna dla gatunku. Jednak wyniki badań neuroksenotransplantacji wskazują, że komórki macierzyste mają wyraźny konserwatyzm ewolucyjny, dzięki któremu ludzkie nerwowe komórki macierzyste są w stanie migrować i rozwijać się po przeszczepieniu do mózgu szczura.

Wiadomo, że ośrodkowy układ nerwowy ssaków ma wyjątkowo niską zdolność do regeneracji reparacyjnej, która charakteryzuje się brakiem jakichkolwiek oznak pojawiania się nowych elementów komórkowych w dojrzałym mózgu w celu zastąpienia neuronów, które obumarły w wyniku urazu. Jednak w przypadku przeszczepu neuroblastów te ostatnie nie tylko wszczepiają się, proliferują i różnicują, ale są również zdolne do integracji ze strukturami mózgu i funkcjonalnie zastępują utracone neurony. Podczas przeszczepiania zaangażowanych komórek progenitorowych neuronów efekt terapeutyczny był znacznie słabszy. Wykazano, że takie komórki mają niską zdolność do migracji. Ponadto komórki progenitorowe neuronów nie odtwarzają architektury sieci neuronowych i nie są funkcjonalnie zintegrowane z mózgiem biorcy. W związku z tym aktywnie badane są kwestie regeneracji reparacyjno-plastycznej podczas przeszczepu nieuformowanych wielopotencjalnych komórek macierzystych neuronów.

W badaniu M. Aleksandrovej i in. (2001), w pierwszej wersji eksperymentów, biorcami były dojrzałe płciowo samice szczurów, a dawcami 15-dniowe zarodki. Od biorców pobrano fragment kory potylicznej mózgu, a do jamy przeszczepiono mechanicznie zawieszoną tkankę domniemanej kory embrionalnej, zawierającą wielopotencjalne komórki macierzyste z okolic komór i podkomorowych. W drugiej wersji eksperymentów do mózgu dojrzałych płciowo szczurów przeszczepiono nerwowe komórki macierzyste z 9-tygodniowego ludzkiego zarodka. Autorzy wyizolowali fragmenty tkanki z okolicy okołokomorowej mózgu zarodkowego, umieścili je w pożywce F-12 i uzyskali zawiesinę komórek przez wielokrotne pipetowanie, a następnie hodowali je w specjalnej pożywce NPBM z dodatkiem czynników wzrostu - FGF, EGF i NGF. Komórki hodowano w hodowli zawiesinowej do momentu utworzenia neurosfer, które rozproszono i ponownie zasadzono w hodowli. Po 4 pasażach z całkowitym okresem hodowli 12-16 dni, komórki wykorzystano do przeszczepu. Odbiorcami były dziesięciodniowe szczenięta szczurów i dojrzałe płciowo dwumiesięczne szczury Wistar, którym wstrzyknięto 4 μl zawiesiny ludzkich komórek macierzystych nerwowych do bocznej komory mózgu bez immunosupresji. Wyniki pracy wykazały, że zdysocjowane komórki strefy komorowej i podkomorowej zawiązku zarodkowego kory mózgowej szczura kontynuowały swój rozwój podczas allotransplantacji do dojrzałego mózgu, tj. czynniki mikrośrodowiska zróżnicowanego mózgu biorcy nie blokowały wzrostu i różnicowania komórek macierzystych nerwowych zarodka. Na wczesnych etapach po przeszczepie komórki multipotencjalne kontynuowały podział mitotyczny i aktywnie migrowały z obszaru przeszczepu do tkanki mózgowej biorcy. Przeszczepione komórki embrionalne o ogromnym potencjale migracyjnym znaleziono w niemal wszystkich warstwach kory mózgowej biorcy wzdłuż toru przeszczepu oraz w istocie białej. Długość szlaku migracji komórek nerwowych była zawsze istotnie krótsza (do 680 μm) niż elementów glejowych (do 3 mm). Naczynia krwionośne i struktury włókniste mózgu służyły jako wektory strukturalne dla migracji astrocytów, co odnotowano również w innych badaniach.

Wcześniej uważano, że gromadzenie się znakowanych astrocytów w obszarze uszkodzenia kory mózgowej biorcy może być związane z tworzeniem bariery glejowej pomiędzy tkankami przeszczepu i biorcy. Jednak badanie struktury zwarto zlokalizowanych przeszczepów komórkowych wykazało, że ich cytoarchitektura charakteryzuje się chaosem, bez żadnego warstwowego rozmieszczenia przeszczepionych komórek. Stopień uporządkowania przeszczepionych neuronów zbliżał się do stopnia normalnych komórek kory mózgowej tylko w przypadku braku bariery glejowej pomiędzy tkankami dawcy i biorcy. W przeciwnym razie struktura przeszczepionych komórek była nietypowa, a same neurony podlegały hipertrofii. Stosując typizację neuroimmunochemiczną przeszczepionych komórek, w przeszczepach znaleziono hamujące neurony GABA-ergiczne i wykryto ekspresję białek PARV, CALB i NPY. W konsekwencji dojrzały mózg zachowuje czynniki mikrośrodowiskowe zdolne do wspierania proliferacji, migracji i specyficznego różnicowania wielopotencjalnych komórek nerwowych.

W hodowli ludzkich komórek macierzystych wyizolowanych z okołokomorowego obszaru mózgu 9-tygodniowych zarodków M. Aleksandrova i in. (2001) znaleźli dużą liczbę nestyno-pozytywnych komórek multipotencjalnych w czwartym pasażu, z których część przeszła już różnicowanie in vitro i rozwijała się zgodnie z typem neuronalnym, co odpowiadało wynikom badań innych autorów. Po przeszczepie do mózgu dorosłych szczurów hodowane ludzkie komórki macierzyste podzieliły się mitotycznie i migrowały do tkanki ksenogenicznego mózgu biorcy. W przeszczepach komórkowych autorzy zaobserwowali dwie populacje komórek - małą i większą. Te ostatnie migrowały zarówno w miąższu, jak i wzdłuż struktur włóknistych mózgu biorcy na nieznaczne odległości - w granicach 300 μm. Największy zasięg ścieżki migracji (do 3 mm) był charakterystyczny dla małych komórek, z których część różnicowała się w astrocyty, co ustalono przy użyciu przeciwciał monoklonalnych do GFAP. Oba typy komórek znaleziono w ścianie komory bocznej, co wskazuje, że przeszczepione komórki dostały się do rostralnego szlaku migracji. Astrocytyczne pochodne komórek macierzystych układu nerwowego zarówno od ludzi, jak i szczurów migrowały głównie przez naczynia włosowate i struktury włókien mózgu biorcy, co pokrywa się z danymi innych autorów.

Analiza różnicowania ludzkich komórek macierzystych in vivo przy użyciu przeciwciał monoklonalnych do GFAP, CALB i VIM wykazała powstawanie zarówno astrocytów, jak i neuronów. W przeciwieństwie do komórek w przeszczepach szczurów, wiele ludzkich komórek macierzystych było wimentyno-pozytywnych. W konsekwencji, niektóre ludzkie komórki multipotencjalne nie uległy różnicowaniu. Ci sami autorzy wykazali następnie, że ludzkie nerwowe komórki macierzyste przeszczepione bez immunosupresji przeżywają w mózgu szczura przez 20 dni po przeszczepie, bez oznak agresji immunologicznej ze strony elementów glejowych dojrzałego mózgu.

Ustalono, że nawet nerwowe komórki macierzyste Drosophila ulegają przeszczepieniu i różnicowaniu w mózgu tak odległego od owadów tak jak szczur. Poprawność eksperymentu autorów nie budzi wątpliwości: transgeniczne linie Drosophila zawierały geny ludzkich czynników neurotroficznych NGF, GDNF, BDNF, wprowadzone do wektora CaSper pod promotorem szoku cieplnego Drosophila, tak że temperatura ciała ssaków automatycznie wywoływała ich ekspresję. Autorzy zidentyfikowali komórki Drosophila na podstawie produktu genu galaktozydazy bakteryjnej, stosując barwienie histochemiczne X-Gal. Ponadto okazało się, że nerwowe komórki macierzyste Drosophila reagują specyficznie na czynniki neurotroficzne kodowane przez ludzkie geny: gdy ksenotransplantowano komórki transgenicznej linii Drosophila zawierającej gen gdnf, synteza tyrozynowej hydroksylazy w różnicujących ją nerwowych komórkach macierzystych gwałtownie wzrosła, a komórki z genem ngf aktywnie wytwarzały acetylocholinoesterazę. Ksenotransplant wywołał podobne reakcje zależne od genów w allotransplantacji embrionalnej tkanki nerwowej przeszczepionej razem z nim.

Czy to oznacza, że specyficzne różnicowanie nerwowych komórek macierzystych jest indukowane przez gatunkowo niespecyficzne czynniki neurotroficzne? Zgodnie z wynikami autorów, ksenograft produkujący czynniki neurotroficzne miał specyficzny wpływ na los alloprzeszczepów, które w tym przypadku rozwijały się intensywniej i były 2-3 razy większe niż alloprzeszczepy wprowadzone do mózgu bez dodawania ksenograftów. W konsekwencji, komórki ksenograftu zawierające geny neurotrofin, w szczególności gen kodujący ludzki czynnik neurotroficzny pochodzący z komórek glejowych (GDNF), mają gatunkowo niespecyficzny wpływ na rozwój alloprzeszczepu podobny do działania odpowiadającej mu neurotrofiny. Wiadomo, że GDNF zwiększa przeżywalność neuronów dopaminergicznych w śródmózgowiu zarodkowym szczura i wzmacnia metabolizm dopaminy przez te komórki, a także indukuje różnicowanie komórek tyrozynowo-hydroksylazowych, wzmacniając wzrost aksonów i zwiększając rozmiar ciała komórki neuronowej. Podobne efekty zaobserwowano również w hodowanych neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczurów.

Aktywna migracja ludzkich nerwowych komórek macierzystych jest obserwowana po ksenotransplantacji do mózgu dojrzałych szczurów. Wiadomo, że proces migracji i różnicowania nerwowych komórek macierzystych jest kontrolowany przez zestaw specjalnych genów. Sygnał inicjujący migrację do komórki prekursorowej w celu rozpoczęcia różnicowania jest podawany przez produkt białkowy protoonkogenu c-ret wraz z GDNF. Kolejny sygnał pochodzi z genu mash-1, który kontroluje wybór ścieżki rozwoju komórki. Ponadto specyficzna reakcja różnicujących się komórek zależy również od receptora α rzęskowego czynnika neurotroficznego. Tak więc, biorąc pod uwagę całkowicie odmienną konstytucję genetyczną ksenogenicznych ludzkich nerwowych komórek macierzystych i komórek mózgowych szczura biorcy, konieczne jest rozpoznanie nie tylko gatunkowej niespecyficzności czynników neurotroficznych, ale także najwyższego ewolucyjnego konserwatyzmu genów odpowiedzialnych za specyficzne różnicowanie nerwowych elementów macierzystych.

Przyszłość pokaże, czy ksenotransplantacja embrionalnego neuromateriału będzie możliwa w praktyce neurochirurgicznej leczenia neurodegeneracyjnych procesów patologicznych wywołanych zaburzeniem syntezy mieliny przez oligodendrocyty. Tymczasem najintensywniej podejmowane zagadnienia neurotransplantacji to te związane z pozyskiwaniem allogenicznych komórek macierzystych układu nerwowego z embrionalnego lub dojrzałego mózgu w hodowli z ich późniejszym ukierunkowanym różnicowaniem w neuroblasty lub wyspecjalizowane neurony.

Transplantacja komórek macierzystych układu nerwowego

Aby pobudzić proliferację i różnicowanie komórek macierzystych układu nerwowego dorosłego organizmu, można przeszczepić tkankę nerwową zarodka. Możliwe jest, że komórki macierzyste tkanki nerwowej zarodka wprowadzone wraz z przeszczepem mogą same ulec proliferacji i różnicowaniu. Wiadomo, że po urazie kręgosłupa regeneracja przewodników nerwowych następuje poprzez wydłużanie uszkodzonych aksonów i poboczne kiełkowanie aksonów nieuszkodzonych wypustek neuronów ruchowych. Głównymi czynnikami uniemożliwiającymi regenerację rdzenia kręgowego są: tworzenie się blizny tkanki łącznej w miejscu uszkodzenia, zmiany dystroficzne i zwyrodnieniowe neuronów centralnych, niedobór NGF oraz obecność produktów rozpadu mieliny w miejscu uszkodzenia. Wykazano, że przeszczepienie różnych typów komórek do uszkodzonego rdzenia kręgowego - fragmentów nerwu kulszowego dorosłych zwierząt, zarodkowej kory potylicznej, hipokampa, rdzenia kręgowego, komórek Schwanna, astrocytów, mikrogleju, makrofagów, fibroblastów - sprzyja regeneracji uszkodzonych aksonów poprzez kiełkowanie i pozwala nowo powstałym aksonom rosnąć przez strefę uszkodzenia rdzenia kręgowego. Doświadczalnie udowodniono, że przeszczepienie zarodkowej tkanki nerwowej do obszaru uszkodzenia rdzenia kręgowego, poprzez działanie czynników neurotroficznych, przyspiesza wzrost uszkodzonych aksonów, zapobiega tworzeniu się blizny glejowej i rozwojowi procesów dystroficznych i degeneracyjnych w neuronach ośrodkowych, podczas gdy komórki przeszczepionej zarodkowej tkanki nerwowej przeżywają w rdzeniu kręgowym, integrują się z sąsiednimi tkankami i sprzyjają wzrostowi aksonów przez obszar uszkodzenia z tworzeniem synaps dendrytycznych na neuronach rdzeniowych.

Ta dziedzina medycyny regeneracyjno-plastycznej uzyskała największy rozwój na Ukrainie dzięki pracy zespołu naukowego pod kierownictwem VI Tsymbalyuka. Przede wszystkim są to badania eksperymentalne nad skutecznością przeszczepu tkanki nerwowej zarodka w urazach rdzenia kręgowego. Podczas autotransplantacji nerwu obwodowego autorzy zaobserwowali najbardziej wyraźne zmiany destrukcyjne w strefie szwu dystalnego, gdzie 30. dnia po operacji zostały połączone z procesami naprawczymi. Podczas allotransplantacji stan morfofunkcjonalny wszczepionego nerwu w 30. dniu charakteryzował się wyraźną destrukcją ze zwyrodnieniem tłuszczowym i amyloidozą na tle ogniskowego zapalnego nacieku komórek limfoidalnych z dominującą atrofią komórek Schwanna. Transplantacja tkanki nerwowej zarodka w większym stopniu przyczyniła się do przywrócenia przewodnictwa rdzenia kręgowego, zwłaszcza u zwierząt poddanych operacji w ciągu pierwszych 24 godzin po urazie: na tle zmniejszenia intensywności procesów zapalnych i destrukcyjnych, hipertrofii i hiperplazji syntetyzujących białka i wytwarzających energię elementów ultrastrukturalnych neuronów rdzeniowych obserwowano hipertrofię i hiperplazję oligodendrocytów, amplituda potencjału czynnościowego mięśni została przywrócona o 50%, a prędkość przewodzenia impulsów o 90%. Oceniając skuteczność transplantacji tkanki nerwowej zarodka w zależności od strefy transplantacji, stwierdzono, że najlepsze wyniki obserwowano, gdy przeszczep wprowadzano bezpośrednio do strefy urazu rdzenia kręgowego. Przy całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego transplantacja tkanki nerwowej zarodka była nieskuteczna. Badania dynamiczne wykazały, że optymalnym momentem do przeprowadzenia przeszczepu tkanki nerwowej zarodka jest pierwsze 24 godziny po uszkodzeniu rdzenia kręgowego, natomiast przeprowadzenie zabiegu w okresie nasilonych wtórnych zmian niedokrwienno-zapalnych, występujących w okresie od 2 do 9 dni po uszkodzeniu, należy uznać za nieodpowiednie.

Wiadomo, że ciężkie urazowe uszkodzenie mózgu wywołuje silną i długotrwałą aktywację peroksydacji lipidów na początkowym i pośrednim etapie okresu pourazowego zarówno w uszkodzonej tkance mózgowej, jak i w całym organizmie, a także zaburza procesy metabolizmu energetycznego w uszkodzonym mózgu. W tych warunkach przeszczepienie zarodkowej tkanki nerwowej w obszar urazu sprzyja stabilizacji procesów peroksydacji lipidów i zwiększa potencjał układu antyoksydacyjnego mózgu i organizmu jako całości, wzmacnia jego ochronę antyrodnikową w 35-60 dniu okresu pourazowego. W tym samym okresie po przeszczepieniu zarodkowej tkanki nerwowej normalizują się procesy metabolizmu energetycznego i fosforylacji oksydacyjnej w mózgu. Ponadto wykazano, że w pierwszym dniu po eksperymentalnym urazowym uszkodzeniu mózgu impedancja tkanki uszkodzonej półkuli zmniejsza się o 30-37%, przeciwległej - o 20%, co wskazuje na rozwój uogólnionego obrzęku mózgu. U zwierząt, którym przeszczepiono tkankę nerwową zarodka, inwolucja obrzęku następowała znacznie szybciej – już siódmego dnia średnia wartość impedancji tkanek uszkodzonej półkuli osiągnęła 97,8% poziomu kontrolnego. Co więcej, całkowite przywrócenie wartości impedancji w 30 dniu odnotowano tylko u zwierząt, którym przeszczepiono tkankę nerwową zarodka.

Śmierć niektórych neuronów w mózgu po ciężkim urazie czaszkowo-mózgowym jest jedną z głównych przyczyn powikłań pourazowych. Neurony integrujących się układów dopaminergicznych i noradrenergicznych śródmózgowia i rdzenia przedłużonego są szczególnie wrażliwe na urazy. Spadek poziomu dopaminy w kompleksie prążkowo-pallidalnym i korze mózgowej znacznie zwiększa ryzyko rozwoju zaburzeń motorycznych i psychicznych, stanów padaczkowych, a spadek produkcji dopaminy w podwzgórzu może być przyczyną licznych zaburzeń wegetatywnych i somatycznych obserwowanych w późnym okresie pourazowym. Wyniki badań przeprowadzonych w eksperymentalnym urazie czaszkowo-mózgowym wskazują, że przeszczep tkanki nerwowej zarodka pomaga przywrócić poziom dopaminy w uszkodzonej półkuli mózgowej, dopaminy i noradrenaliny w podwzgórzu oraz zwiększyć poziom noradrenaliny i dopaminy w śródmózgowiu i rdzeniu przedłużonym. Ponadto w wyniku przeszczepu tkanki nerwowej zarodka do uszkodzonej półkuli mózgu zwierząt doświadczalnych dochodzi do normalizacji stosunku procentowego fosfolipidów i zwiększenia zawartości kwasów tłuszczowych (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Dane te potwierdzają stymulację procesów regeneracyjno-plastycznych przez przeszczepioną tkankę nerwową zarodka i wskazują na reparacyjno-troficzny wpływ przeszczepu na mózg biorcy jako całość.

Na szczególną uwagę zasługuje doświadczenie kliniczne personelu Instytutu Neurochirurgii im. AP Romodanova Akademii Nauk Medycznych Ukrainy w zakresie przeszczepiania tkanki nerwowej zarodka w mózgowym porażeniu dziecięcym, niezwykle złożonej patologii z ciężką dysfunkcją ruchową. Formy kliniczne mózgowego porażenia dziecięcego zależą od stopnia uszkodzenia integralnych struktur odpowiedzialnych za regulację napięcia mięśniowego i kształtowanie stereotypów ruchowych. Obecnie istnieją wystarczające dowody potwierdzające fakt, że patologiczne zmiany w układzie sterowania motorycznego prążkowo-pallidalno-wzgórzowo-korowym odgrywają ważną rolę w zaburzeniach funkcji motorycznych i napięcia mięśniowego. Powiązanie prążkowo-pallidalno-wzgórzowo-korowe tego układu realizuje funkcję kontrolną poprzez produkcję dopaminy nigrostriatalnej. Bezpośrednia droga realizacji kontroli wzgórzowo-korowej rozpoczyna się od neuronów skorupy, jest pośredniczona przez kwas gamma-aminomasłowy (GABA) i substancję P i jest rzutowana bezpośrednio do strefy ruchowej wewnętrznego segmentu gałki bladej i istoty czarnej. Droga pośrednia, której działanie jest realizowane przy udziale GABA i enkefaliny, pochodzi z neuronów skorupy i oddziałuje na jądra jąder podstawy poprzez szereg połączeń obejmujących zewnętrzny segment gałki bladej i jądro podwzgórzowe. Zaburzenia przewodnictwa drogi bezpośredniej powodują hipokinezę, podczas gdy spadek przewodnictwa struktur drogi pośredniej prowadzi do hiperkinezji z odpowiednimi zmianami napięcia mięśniowego. Integralność dróg przewodzenia GABAergicznego na różnych poziomach układu sterowania motorycznego i integracja połączeń dopaminergicznych na poziomie skorupy są niezbędne do regulacji oddziaływań wzgórzowo-korowych. Najczęstszym objawem patologii ruchowej w różnych postaciach mózgowego porażenia dziecięcego jest zaburzenie napięcia mięśniowego i ściśle związana z tym zmiana odruchowej aktywności mięśniowej.

Transplantacja tkanki nerwowej zarodka w mózgowym porażeniu dziecięcym wymaga dokładnej analizy charakteru uszkodzeń struktur mózgowych. Na podstawie oznaczenia poziomu dopaminy i GABA w płynie podpajęczynówkowym mózgowo-rdzeniowym, autorzy szczegółowo określili poziom zaburzenia integracji funkcjonalnych struktur mózgowych, co pozwoliło na obiektywizację wyników interwencji chirurgicznej i korektę powtórnych neurotransplantacji. Tkankę nerwową zarodka (materiał poronny 9-tygodniowego zarodka) przeszczepiano do miąższu kory zakrętów przedśrodkowych półkul mózgowych w zależności od nasilenia zmian zanikowych. W okresie pooperacyjnym nie obserwowano powikłań ani pogorszenia stanu pacjentów. Pozytywną dynamikę odnotowano u 63% pacjentów z postaciami spastycznymi, u 82% dzieci z postacią atoniczno-estetyczną i tylko u 24% pacjentów z postacią mieszaną choroby. Stwierdzono negatywny wpływ wysokiego poziomu neurosensytyzacji z obecnością autoprzeciwciał przeciwko białkom neurospecyficznym na wyniki operacji. Stwierdzono, że przeszczep zarodkowej tkanki nerwowej jest nieskuteczny u pacjentów w wieku 8-10 lat i starszych, a także w przypadkach ciężkiego zespołu hiperkinetycznego i padaczki. Klinicznie skuteczność przeszczepu zarodkowej tkanki nerwowej u pacjentów ze spastycznymi postaciami mózgowego porażenia dziecięcego objawiała się kształtowaniem nowych umiejętności statomotorycznych i ruchów dowolnych z korekcją patologicznego stereotypu ruchowego i zmniejszeniem stopnia spastyczności, patologicznych postaw i nastawień. Autorzy uważają, że pozytywny efekt przeszczepu zarodkowej tkanki nerwowej jest wynikiem normalizującego wpływu na aktywność funkcjonalną struktur nadrdzeniowych biorących udział w regulacji napięcia posturalnego i ruchów dowolnych. Jednocześnie pozytywnym efektom klinicznym przeszczepu tkanki nerwowej zarodka towarzyszy spadek zawartości neuroprzekaźników w płynie podpajęczynówkowym, co wskazuje na przywrócenie integralnych oddziaływań między dotkniętymi chorobą strukturami mózgu.

Istnieje inna ciężka postać patologii neurologicznej - zespół apaliczny, którego problem leczenia, niestety, jest daleki od rozwiązania. Zespół apaliczny jest polietiologicznym stanem podostrym lub przewlekłym, który powstaje w wyniku poważnych organicznych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego (głównie kory mózgowej) i charakteryzuje się rozwojem panapraksji i panagnozji przy stosunkowo zachowanej funkcji odcinków segmentalno-pniowych i formacji kompleksu limbiczno-siatkowego mózgu. Badania kontrolne (od 1 roku do 3 lat) wykazały, że zespół apaliczny nie jest ostateczną diagnozą trwałego uszkodzenia układu nerwowego u dzieci, ale przekształca się albo w otępienie organiczne, albo w przewlekły stan wegetatywny. W Katedrze Neurochirurgii Odtwórczej Instytutu Neurochirurgii im. A. P. Romodanova Akademii Nauk Medycznych Ukrainy 21 pacjentów z następstwami zespołu apalicznego przeszło przeszczep tkanki nerwowej zarodka. W znieczuleniu ogólnym wiertłem koronowym wykonano otwór w obszarze najbardziej widocznych zmian zanikowych, ujawnionych przez tomografię komputerową lub rezonans magnetyczny, a w przypadku rozlanego zaniku istoty szarej lub białej przeszczep wprowadzono do zakrętów przedśrodkowych i centralnych mózgu. Po otwarciu opony twardej, fragmenty tkanki z kory czuciowo-ruchowej 8-9-tygodniowych zarodków wszczepiono śródkorowo za pomocą specjalnego urządzenia. Liczba wszczepionych próbek tkanki wahała się od 4 do 10, co zostało określone przez wielkość otworu i wielkość lokalnych zmian w materii mózgowej. W przeciwieństwie do innych typów patologii, w zespole apalicznym autorzy starali się wszczepić jak najwięcej tkanki zarodkowej w najbardziej dostępne obszary mózgu. Zszyto oponę twardą i wykonano operację plastyczną ubytku czaszki. Podczas operacji u wszystkich pacjentów zaobserwowano istotne zmiany zarówno w korze mózgowej (zanik, brak zakrętów, zmiana koloru i pulsowanie materii mózgowej), jak i oponach mózgowych (pogrubienie opony twardej, znaczne pogrubienie błony pajęczynówki z obecnością własnych naczyń krwionośnych, zrośnięcie się błon z leżącą pod nią materią mózgową). Zmiany te były bardziej widoczne u pacjentów z historią zapalnych zmian mózgu. U pacjentów, u których wystąpiło niedotlenienie ośrodkowego układu nerwowego, przeważały rozproszone zmiany zanikowe w materii mózgowej, szczególnie w korze mózgowej, ze zwiększeniem przestrzeni podpajęczynówkowej, bez istotnych zmian w oponach mózgowych. U połowy pacjentów wystąpiło zwiększone krwawienie tkanek miękkich, kości i materii mózgowej. Po operacjach, w ciągu sześciu miesięcy do trzech lat, stan poprawił się u 16 pacjentów, a u pięciu pacjentów pozostał niezmieniony. Zaobserwowano dodatnią dynamikę zarówno w sferze ruchowej, jak i psychicznej. Napięcie mięśni zmniejszyło się u dziesięciu pacjentów, U 11 pacjentów wzrosła aktywność ruchowa (zmniejszenie niedowładu,koordynacja ruchów poprawiła się), u pięciorga dzieci znacznie zwiększyła się zdolność manipulacyjna kończyn górnych. U czterech pacjentów zmniejszyła się częstotliwość i nasilenie napadów padaczkowych, a u jednego dziecka nie wystąpiły żadne napady w całym okresie obserwacji po operacji. Agresja zmniejszyła się u dwójki dzieci, u dwóch pacjentów z ciężkimi zaburzeniami opuszkowymi poprawił się akt połykania, dwoje dzieci było w stanie samodzielnie żuć już 2 tygodnie po operacji. Odnotowano zmniejszenie nasilenia zaburzeń psychicznych, dziewięcioro dzieci stało się spokojniejsze po operacji, sen i uwaga poprawiły się u siedmiu pacjentów. Trzech pacjentów z następstwami zespołu apalicznego zaczęło rozpoznawać rodziców, jeden - wykonywać polecenia, dwóch - wymawiać słowa, u trzech zmniejszył się stopień dyzartrii. Autorzy zauważają, że zauważalna poprawa stanu pacjentów zaczyna się 2 miesiące po operacji, osiąga maksimum po 5-6 miesiącach, następnie tempo poprawy zwalnia i do końca roku proces stabilizuje się u 50% pacjentów. Pozytywny efekt neurotransplantacji posłużył za podstawę do powtórnej operacji u sześciu pacjentów z następstwami zespołu apalicznego, ale na drugiej półkuli mózgu. Technika i metody drugiego przeszczepu były identyczne jak w przypadku pierwszego zabiegu, ale efekt kliniczny drugiego zabiegu był niższy, chociaż nie wystąpiły żadne poważne powikłania ani po pierwszej, ani po drugiej interwencji chirurgicznej. Według autorów mechanizm terapeutycznego efektu neurotransplantacji jest związany z efektem neurotroficznym przeszczepionej tkanki nerwowej zarodka, która zawiera dużą liczbę substancji wzrostowych, hormonalnych i innych biologicznie czynnych, które stymulują naprawę uszkodzonych neuronów i plastyczną reorganizację tkanki mózgowej biorcy. Możliwy jest również efekt aktywujący na aktywność komórek nerwowych, które były wcześniej morfologicznie zachowane, ale utraciły swoją aktywność funkcjonalną z powodu choroby. To właśnie szybki efekt neurotroficzny może tłumaczyć poprawę funkcji opuszkowych u niektórych dzieci już pod koniec pierwszego lub drugiego tygodnia po operacji. Zakłada się, że oprócz tego, w trzecim lub czwartym miesiącu, między przeszczepem a mózgiem gospodarza nawiązują się połączenia morfofunkcjonalne, przez które neuroprzeszczep zastępuje funkcje martwych komórek mózgowych, co jest podłożem do poprawy zarówno funkcji motorycznych, jak i umysłowych pacjentów. Dwoje dzieci było w stanie samodzielnie żuć już 2 tygodnie po operacji. Odnotowano zmniejszenie nasilenia zaburzeń psychicznych, dziewięcioro dzieci stało się spokojniejsze po operacji, sen i uwaga poprawiły się u siedmiu pacjentów. Trzech pacjentów z następstwami zespołu apalicznego zaczęło rozpoznawać swoich rodziców, jeden - wykonywać polecenia, dwóch - wymawiać słowa,u trzech stopień dyzartrii zmniejszył się. Autorzy zauważają, że zauważalna poprawa stanu pacjentów zaczyna się 2 miesiące po operacji, osiąga maksimum po 5-6 miesiącach, następnie tempo poprawy zwalnia i do końca roku proces stabilizuje się u 50% pacjentów. Pozytywny efekt neurotransplantacji posłużył za podstawę do powtórzenia operacji u sześciu pacjentów z następstwami zespołu apalicznego, ale na drugiej półkuli mózgu. Technika i sposób wykonania drugiego przeszczepu były identyczne jak w przypadku pierwszego zabiegu, ale efekt kliniczny drugiego zabiegu był niższy, chociaż nie było poważnych powikłań ani po pierwszej, ani po drugiej interwencji chirurgicznej. Według autorów mechanizm terapeutycznego efektu neurotransplantacji jest związany z efektem neurotroficznym przeszczepionej tkanki nerwowej zarodka, która zawiera dużą liczbę substancji wzrostowych, hormonalnych i innych biologicznie czynnych, które stymulują naprawę uszkodzonych neuronów i plastyczną reorganizację tkanki mózgowej biorcy. Możliwe jest również działanie aktywujące na aktywność komórek nerwowych, które wcześniej były morfologicznie zachowane, ale utraciły swoją aktywność funkcjonalną z powodu choroby. To właśnie szybki efekt neurotroficzny może wyjaśnić poprawę funkcji opuszkowych u niektórych dzieci już pod koniec pierwszego lub drugiego tygodnia po operacji. Zakłada się, że wraz z tym, w trzecim lub czwartym miesiącu, powstają połączenia morfofunkcjonalne między przeszczepem a mózgiem gospodarza, przez które neuroprzeszczep zastępuje funkcje martwych komórek mózgowych, co jest podłożem do poprawy zarówno funkcji motorycznych, jak i umysłowych pacjentów. Dwoje dzieci było w stanie samodzielnie żuć już 2 tygodnie po operacji. Odnotowano zmniejszenie nasilenia zaburzeń psychicznych, dziewięcioro dzieci stało się spokojniejsze po operacji, sen i uwaga poprawiły się u siedmiu pacjentów. Trzech pacjentów z następstwami zespołu apalicznego zaczęło rozpoznawać swoich rodziców, jeden - wykonywać polecenia, dwóch - wymawiać słowa, u trzech zmniejszył się stopień dyzartrii. Autorzy zauważają, że zauważalna poprawa stanu pacjentów zaczyna się 2 miesiące po operacji, osiąga maksimum po 5-6 miesiącach, następnie tempo poprawy zwalnia i pod koniec roku proces stabilizuje się u 50% pacjentów. Pozytywny efekt neurotransplantacji posłużył za podstawę do powtórnej operacji u sześciu pacjentów z następstwami zespołu apalicznego, ale na drugiej półkuli mózgu. Technika i sposób wykonania drugiego przeszczepu były identyczne jak w przypadku pierwszej operacji, ale efekt kliniczny drugiego zabiegu był niższy, chociaż nie było poważnych powikłań ani po pierwszej, ani po drugiej interwencji chirurgicznej. Według autorów,mechanizm terapeutycznego działania neurotransplantacji wiąże się z neurotroficznym działaniem przeszczepionej tkanki nerwowej zarodka, która zawiera dużą liczbę substancji wzrostowych, hormonalnych i innych biologicznie czynnych, które stymulują naprawę uszkodzonych neuronów i plastyczną reorganizację tkanki mózgowej biorcy. Możliwy jest również aktywujący wpływ na aktywność komórek nerwowych, które wcześniej były morfologicznie zachowane, ale utraciły swoją aktywność funkcjonalną z powodu choroby. To właśnie szybki efekt neurotroficzny może tłumaczyć poprawę funkcji opuszkowych u niektórych dzieci już pod koniec pierwszego lub drugiego tygodnia po operacji. Zakłada się, że wraz z tym, do trzeciego lub czwartego miesiąca, powstają połączenia morfofunkcjonalne między przeszczepem a mózgiem biorcy, przez które neurotransplant zastępuje funkcje martwych komórek mózgowych, co jest podłożem do poprawy zarówno funkcji motorycznych, jak i umysłowych pacjentów. chociaż nie wystąpiły żadne poważne powikłania ani po pierwszej, ani po drugiej interwencji chirurgicznej. Według autorów mechanizm terapeutycznego działania neurotransplantacji wiąże się z neurotroficznym działaniem przeszczepionej tkanki nerwowej zarodka, która zawiera dużą liczbę substancji wzrostowych, hormonalnych i innych biologicznie czynnych, które stymulują naprawę uszkodzonych neuronów i plastyczną reorganizację tkanki mózgowej biorcy. Możliwy jest również aktywujący wpływ na aktywność komórek nerwowych, które wcześniej były morfologicznie zachowane, ale utraciły swoją aktywność funkcjonalną z powodu choroby. To właśnie szybki efekt neurotroficzny może wyjaśniać poprawę funkcji opuszkowych u niektórych dzieci już pod koniec pierwszego lub drugiego tygodnia po operacji. Zakłada się, że wraz z tym, do trzeciego lub czwartego miesiąca, powstają połączenia morfofunkcjonalne między przeszczepem a mózgiem biorcy, przez które neurotransplant zastępuje funkcje martwych komórek mózgowych, co jest podłożem do poprawy zarówno funkcji motorycznych, jak i umysłowych pacjentów. chociaż nie wystąpiły żadne poważne powikłania ani po pierwszej, ani po drugiej interwencji chirurgicznej. Według autorów mechanizm terapeutycznego działania neurotransplantacji wiąże się z neurotroficznym działaniem przeszczepionej tkanki nerwowej zarodka, która zawiera dużą liczbę substancji wzrostowych, hormonalnych i innych biologicznie czynnych, które stymulują naprawę uszkodzonych neuronów i plastyczną reorganizację tkanki mózgowej biorcy. Możliwy jest również aktywujący wpływ na aktywność komórek nerwowych, które wcześniej były morfologicznie zachowane, ale utraciły swoją aktywność funkcjonalną z powodu choroby.To właśnie szybki efekt neurotroficzny może tłumaczyć poprawę funkcji bulbarnych u niektórych dzieci już pod koniec pierwszego lub drugiego tygodnia po operacji. Zakłada się, że wraz z tym, w trzecim lub czwartym miesiącu, powstają połączenia morfofunkcjonalne między przeszczepem a mózgiem gospodarza, poprzez które neuroprzeszczep zastępuje funkcje martwych komórek mózgowych, co jest podłożem do poprawy zarówno funkcji motorycznych, jak i umysłowych pacjentów.

Wpływ przeszczepu tkanki nerwowej zarodka na reorganizację połączeń międzyneuronalnych badano eksperymentalnie. Autorzy badali wzorce przywracania międzymodułowych połączeń aksonalnych w obszarze uszkodzeń mechanicznych kory mózgowej u białych szczurów z przeszczepem tkanki nerwowej zarodka i bez niego, stosując fluorescencyjny lipofilowy znacznik DIL (1,1-dioktadecylo-3,3,33'-tetrametyloindokarbocyjaniny nadchloran) i konfokalne skanowanie laserowe. Stwierdzono, że wprowadzenie tkanki nerwowej zarodka do obszaru uszkodzenia zapewnia wzrost aksonów, które po przejściu przez przeszczep łączą się z przyległą tkanką mózgową, natomiast bez przeszczepu tkanki nerwowej zarodka obszar uszkodzenia stanowi nie do pokonania przeszkodę dla wzrostu aksonów. W tej pracy wykonano przeszczep zarodkowej (15-17 dzień ciąży) nowej kory mózgowej. Wyniki uzyskane przez autorów są kolejnym dowodem na aktywny wpływ przeszczepu tkanki nerwowej zarodka na pourazową reorganizację relacji międzyneuronalnych sąsiadujących ze sobą modułów strukturalnych i funkcjonalnych kory mózgowej. Przeszczep tkanki nerwowej zarodka zapewnia częściową odbudowę połączeń między uszkodzonymi obszarami kory mózgowej poprzez stworzenie korzystnych warunków do wzrostu aksonów w strefie działania czynników neurotroficznych przeszczepu. Istnienie takiego efektu zostało udowodnione eksperymentalnie i jest omawiane w literaturze jako dowód wysokich zdolności plastycznych uszkodzonego mózgu zwierząt dojrzałych płciowo. W związku z tym przeszczep komórek jest obecnie uważany za optymalną strategię terapeutyczną przywracającą funkcję uszkodzonego ludzkiego OUN.

Dane uzyskane przez autorów na temat efektywności wykorzystania embrionalnej tkanki nerwowej mózgu jako egzogennego medium przeszczepu do wzrostu aksonów potwierdzają perspektywy ukierunkowanego tworzenia połączeń komunikacyjnych między nienaruszonymi, sąsiadującymi obszarami mózgu. Prace nad badaniem wpływu przeszczepu tkanki nerwowej na dynamikę parametrów czynnościowych ośrodkowego układu nerwowego wydają się istotne. Zadaniem pracy było zbadanie wpływu przeszczepu embrionalnego locus coeruleus (LC) na wskaźniki morfofunkcjonalne neuronów LC i aktywność lokomotoryczną biorców. Biorcami były samice szczurów Wistar, a dawcami 18-dniowe zarodki szczurów tej samej linii. Transplantację embrionalnej LC wykonano do jamy trzeciej komory mózgu. Histologicznie wszczepienie przeszczepu wykryto u 75% zwierząt biorców. W przypadkach wszczepienia przeszczep przylegał do ściany komory, wypełniając 1/5-2/5 jej światła i był żywy. Po 1 i 6 miesiącach od operacji przeszczepiona tkanka nerwowa, zgodnie ze swoimi cechami morfologicznymi, stanowiła struktury, które powstałyby w trakcie ich normalnego rozwoju ontogenetycznego, tj. struktury LC. Dane uzyskane przez autorów wskazują, że u zwierząt, którym przeszczepiono zarodkowy zawiązek LC, zmienia się aktywność dynamiczna i wzrasta aktywność macierzowa chromatyny jąder komórkowych LC. W konsekwencji nasila się aktywność neuronów ich własnych LC, ale wszczepiony przeszczep jest również aktywny funkcjonalnie. Wiadomo, że tzw. obszar lokomotoryczny śródmózgowia praktycznie pokrywa się z lokalizacją LC. Autorzy uważają, że podstawą zmiany aktywności ruchowej szczurów biorców jest aktywacja komórek LC, zarówno własnych, jak i przeszczepionych, z uwolnieniem dużej ilości noradrenaliny, w tym w segmentach rdzenia kręgowego. Przyjmuje się zatem, że wzrost aktywności ruchowej w warunkach przeszczepu LC do nieuszkodzonego mózgu zwierząt wynika z obecności funkcjonalnie aktywnego przeszczepu zintegrowanego z mózgiem biorcy i przyczyniającego się do aktywacji aktywności lokomotorycznej u szczurów.

Ponadto wykazano, że przeszczepione komórki neuroepitelialne zarodkowych zawiązków nowej kory mózgowej i rdzenia kręgowego przeżywają i różnicują się w neuroblasty, młode i dojrzałe neurony w ciągu 1-2 miesięcy od ich przeszczepienia do uszkodzonego nerwu kulszowego dojrzałych szczurów. Badając dynamikę rozwoju NADPH-dodatnich neuronów zarodkowych nowej kory mózgowej i rdzenia kręgowego szczurów w heterotopowych alloprzeszczepach (15-dniowy zarodek szczura), stwierdzono wszczepienie 70-80% neuroprzeszczepów na przekrojach podłużnych przez nerwy kulszowe szczurów biorców, co zależało od okresu obserwacji. Neuroblasty jedno- i dwubiegunowe z zaokrąglonymi jasnymi jądrami i jednym lub dwoma jąderkami zaczęły formować się w przeszczepach tydzień po zabiegu, czemu towarzyszyło tworzenie się skupisk. Autorzy nie wykryli komórek zawierających diaforazę NADPH (NADPH-d) wśród neuroblastów. Po 7 dniach NADPH-dodatnie były tylko elementy komórkowe naczyń krwionośnych - komórki śródbłonka naczyń włosowatych w grubości przeszczepu, a także komórki śródbłonka i mięśni gładkich naczyń nerwu kulszowego biorcy. Ponieważ w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych indukcja syntazy NO (NOS) zachodzi pod wpływem IL-1, autorzy wiążą pojawienie się NADPH-dodatnich komórek mięśni gładkich w naczyniach krwionośnych nerwu kulszowego z obecnością IL-1 syntetyzowanej w uszkodzonych pniach nerwowych. Wiadomo, że neurogeneza w warunkach przeszczepu zarodkowych zarodków mózgowych zachodzi synchronicznie z rozwojem neuronów in situ. Wyniki badań morfologicznych wskazują, że różnicowanie niektórych elementów nerwowych przeszczepów siedem dni po przeszczepie odpowiada różnicowaniu komórek w podobnych częściach mózgu nowonarodzonych szczurów. Tak więc w warunkach heterotopowego przeszczepu do nerwu obwodowego przeszczepione komórki nerwowe zarodka wykazują zdolność syntezy NADPH-d. W tym przypadku w przeszczepach rdzenia kręgowego znajduje się więcej neuronów zawierających NADPH-d niż w przeszczepach neokorteksu, ale synteza tlenku azotu rozpoczyna się w przeszczepionych neuronach później niż w trakcie rozwoju in situ. W ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców komórki NOS-dodatnie pojawiają się już w okresie prenatalnym. Uważa się, że NO promuje tworzenie połączeń synaptycznych w rozwijającym się mózgu, a obecność włókien nerwowych NOS-dodatnich, które zapewniają syntezę NO w neuroblastach móżdżku, stymuluje migrację i różnicowanie neuronów, dzięki czemu tworzy się normalna cytoarchitektura mózgu. Ważną rolę NO w synapsogenezie ustalono w pokrywie - tylko te neurony, które miały połączenia synaptyczne z komórkami siatkówki okazały się NOS-dodatnie.

Wiadomo, że tlenek azotu jest jednym z regulatorów aktywności mózgu, gdzie powstaje z argininy pod wpływem syntazy NO, która ma aktywność diaforazy. W ośrodkowym układzie nerwowym NO jest syntetyzowany w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, mikrogleju, astrocytach i neuronach różnych części mózgu. Po urazowym uszkodzeniu mózgu, a także podczas niedotlenienia i niedokrwienia, obserwuje się wzrost liczby neuronów zawierających NO, który jest jednym z regulatorów przepływu krwi przez mózg. Biorąc pod uwagę zdolność NO do indukowania synapsogenezy, badanie powstawania komórek zawierających NO w warunkach neurotransplantacji na tle urazowego uszkodzenia tkanki nerwowej biorcy jest szczególnie interesujące.

Nie mniej ważne jest badanie wpływu neurotransplantacji na stereotyp odruchu warunkowego zachowania. W eksperymentach nad badaniem wpływu wewnątrzmózgowego i odległego (między CII i CIII) przeszczepu tkanki miejsca sinawego zarodka (17-19 dzień ciąży) na procesy pamięciowe i zawartość katecholamin u szczurów z uszkodzeniem czołowej kory nowej, wykazano, że elektrolityczne uszkodzenie czołowej kory skroniowej mózgu zaburza stereotyp odruchu warunkowego reakcji emocjonalnej unikania (pamięci), osłabia aktywność fizjologiczną, zmniejsza zawartość noradrenaliny w strefie skrzepniętej nowej kory, ale zwiększa jej poziom w podwzgórzu, gdzie obserwuje się spadek stężenia adrenaliny, chociaż jej ilość we krwi i nadnerczach wzrasta.

W wyniku śródmózgowego przeszczepu tkanki miejsca sinawego zarodka u 81,4% zwierząt przywraca się stereotyp warunkowej reakcji unikania emocjonalnego, zaburzony przez elektrolityczne uszkodzenie czołowo-skroniowych okolic kory mózgowej, normalizuje się zawartość adrenaliny w tworze siatkowatym śródmózgowia, podwzgórzu i korze nowej, a jej poziom w hipokampie nawet wzrasta, czemu towarzyszy spadek stężenia adrenaliny we krwi.

Zdalny przeszczep tkanki miejsca sinawego zarodka nie tylko przywraca zaburzony stereotyp warunkowej reakcji unikania emocjonalnego u szczurów z elektrolitycznym uszkodzeniem kory czołowo-skroniowej, ale także zwiększa zawartość noradrenaliny i adrenaliny, głównie w podwzgórzu, krwi, nadnerczach i sercu. Przypuszcza się, że jest to spowodowane unaczynieniem przeszczepu, przenikaniem neuroprzekaźników do krwiobiegu, ich przejściem przez barierę krew-mózg i aktywacją mechanizmów wychwytu zwrotnego adrenaliny i noradrenaliny przez typy wychwytu 1, 2, 3. Autorzy uważają, że długotrwałą stabilizację poziomu noradrenaliny w warunkach wszczepienia i funkcjonowania przeszczepu można rozpatrywać jako zjawisko jej stopniowego uwalniania w minimalnych dawkach przez neurony miejsca sinawego.

Pozytywne efekty kliniczne przeszczepu tkanki nerwowej zarodka mogą być również spowodowane zdolnością tej ostatniej do wpływania na procesy nowotworów naczyń, w regulacji których bezpośrednio uczestniczą czynniki wzrostu i cytokiny. Waskulogenezę aktywują angiogenne czynniki wzrostu - czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), FGF, PDGF i TGF, które są syntetyzowane podczas niedokrwienia, które działa jako moment inicjujący angiogenezę. Udowodniono, że wyczerpywanie się potencjału wzrostu naczyń występuje podczas procesu starzenia się organizmu, co odgrywa znaczącą rolę w patogenezie takich chorób, jak choroba wieńcowa i zacierająca miażdżyca kończyn dolnych. Niedokrwienie tkanek rozwija się również w wielu innych chorobach. Wprowadzenie czynników angiogennych do stref niedokrwienia (terapeutyczna angiogeneza) stymuluje wzrost naczyń krwionośnych w niedokrwionych tkankach i poprawia mikrokrążenie dzięki rozwojowi krążenia obocznego, co z kolei zwiększa aktywność funkcjonalną dotkniętego narządu.

VEGF i FGF są uważane za najbardziej obiecujące do zastosowań klinicznych. Wyniki pierwszych badań randomizowanych były zachęcające, zwłaszcza jeśli optymalne dawki i metody podawania czynników angiogennych zostały dobrane prawidłowo. W tym zakresie przeprowadzono eksperymentalną ocenę aktywności angiogennej ekstraktu wyizolowanego z tkanki mózgu ludzkiego zarodka. W pracy wykorzystano materiał poroniony pobrany w dwudziestym tygodniu ciąży i przetworzony zgodnie z metodą I. Maciog i in. (1979) zmodyfikowaną przez IC ANRF. Lek ten jest analogiem „Suplementu wzrostu komórek śródbłonka” („Sigma”) i jest naturalną mieszaniną ludzkich czynników angiogennych, która zawiera VEGF i FGF. Eksperymenty przeprowadzono na szczurach z modelami niedokrwienia kończyn tylnych i tkanki mięśnia sercowego. Na podstawie badania aktywności fosfatazy alkalicznej u zwierząt doświadczalnych, którym podano ekstrakt z tkanki nerwowej zarodka, stwierdzono wzrost liczby naczyń włosowatych na jednostkę powierzchni mięśnia sercowego – zarówno w przekroju podłużnym, jak i poprzecznym serca. Aktywność angiogenna preparatu przejawiała się przy bezpośrednim podaniu do strefy niedokrwienia, jak również w przypadku podania systemowego (domięśniowego), co prowadziło do zmniejszenia średniej powierzchni blizny pozawałowej.

W każdym wariancie przeszczepu tkanki nerwowej zarodka niezwykle istotne jest prawidłowe dobranie wieku ciążowego przeszczepianego materiału zarodkowego. Analiza porównawcza skuteczności preparatów komórkowych z brzusznego śródmózgowia zarodków 8-, 14- i 16-17-dniowych szczurów trzy miesiące po śródprążkowiowej transplantacji nerwów u dojrzałych szczurów z parkinsonizmem w automatycznym teście asymetrii ruchowej wywołanej apomorfiną wykazała istotnie wyższą skuteczność preparatów komórkowych OUN z zarodków 8-dniowych i najniższą skuteczność z tkanki nerwowej zarodka 16-17-dniowej. Uzyskane dane korelowały z wynikami analizy histomorfologicznej, w szczególności z rozmiarem przeszczepów, nasileniem reakcji glejowej i liczbą neuronów dopaminergicznych w nich zawartych.

Różnice w działaniu terapeutycznym komórek tkanki nerwowej zarodka mogą być związane zarówno ze stopniem niedojrzałości i zaangażowania samych komórek, jak i ich różnymi reakcjami na czynniki wzrostu uwalniane w obszarze indukowanego uszkodzenia neuronów dopaminergicznych. W szczególności wpływ EGF i FGF2 na rozwój komórek macierzystych neuronów telencephalicznych in vivo występuje na różnych etapach embriogenezy. Komórki neuroepitelialne 8,5-dniowych zarodków myszy, hodowane in vitro w podłożu bez surowicy, proliferują w obecności FGF2, ale nie EGF, na który reagują tylko populacje komórek macierzystych izolowanych z mózgu zarodków na późniejszych etapach rozwoju. Jednocześnie komórki macierzyste neuronów proliferują w odpowiedzi na każdy z tych mitogenów i addytywnie zwiększają wzrost w przypadku dodania EGF i FGF2 do hodowli o niskiej gęstości zaszczepiania komórek. Reaktywne na EGF nerwowe komórki macierzyste ze stref germinalnych 14,5-dniowych zarodków myszy są uważane za liniowych potomków reaktywnych na FGF nerwowych komórek macierzystych, które pojawiają się po raz pierwszy po 8,5 dniach ciąży. Potencjalny fenotyp nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych zależy od złożonego wpływu ich mikrośrodowiska. Immunofenotypowanie komórek nerwowych ze stref okołokomorowych i hipokampa 8-12- i 17-20-tygodniowych ludzkich zarodków metodą cytofluorometrii przepływowej wykazało znaczną zmienność związaną zarówno z wiekiem ciążowym, jak i indywidualnymi cechami konstytucyjnymi biomateriału dawcy. Gdy te nerwowe komórki progenitorowe są hodowane w selektywnym podłożu bez surowicy z EGF, FGF2 i NGF, neurosfery są formowane w tempie, które znacząco zależy od wieku ciążowego. Komórki z różnych części mózgu 5-13-tygodniowych ludzkich zarodków, krótko hodowane z FGF2 w hodowli monowarstwowej na podłożu lamininowym w obecności śladowych ilości czynników wzrostu, zachowują proliferację przez 6 tygodni z wysokim odsetkiem komórek nestin-pozytywnych na tle spontanicznego tworzenia się komórek z markerami wszystkich trzech linii różnicowania nerwowego. Komórki wyizolowane z śródmózgowia ludzkiego zarodka w okresie ciąży przekraczającym 13 tygodni, proliferują pod wpływem EGF i również tworzą neurosfery. Efekt synergistyczny uzyskano stosując kombinację EGF i FGF2. Najbardziej intensywną proliferację nerwowych komórek macierzystych z tworzeniem neurosfer obserwuje się podczas hodowli tkanki kory mózgowej 6-8-tygodniowych ludzkich zarodków w obecności EGF2, IGF1 i 5% surowicy końskiej na podłożu z fibroniektyną.

Należy zauważyć, że pytania dotyczące wieku ciążowego i odcinka embrionalnego OUN, którego tkanka jest preferowana do wykorzystania w celu neurotransplantacji, pozostają otwarte. Odpowiedzi na nie należy szukać w neurogenezie rozwijającego się mózgu, która trwa przez cały okres prenatalny - w czasie, gdy nabłonek cewy nerwowej tworzy strukturę wielowarstwową. Uważa się, że źródłem komórek macierzystych i nowych neuronów jest glej promienisty, składający się z wydłużonych komórek z długimi wypustkami skierowanymi promieniowo względem ściany pęcherzyków mózgowych i stykającymi się z wewnętrzną powierzchnią komór i zewnętrzną powierzchnią opony miękkiej ściany mózgu. Wcześniej glej promienisty był obdarzony jedynie funkcją szlaku neuronalnego, wzdłuż którego neuroblasty migrują z regionu brzusznego do odcinków powierzchniowych, a także przypisywano mu rolę szkieletową w procesie formowania prawidłowej organizacji warstwowej kory. Obecnie ustalono, że w miarę rozwoju glej radialny transdyferencjalizuje się w astrocyty. Znaczna jego część u ssaków ulega redukcji bezpośrednio po urodzeniu, jednak u gatunków zwierząt, u których glej radialny jest zachowany do wieku dorosłego, neurogeneza aktywnie zachodzi w okresie postnatalnym.

W hodowli komórki glejowe promieniste z embrionalnej kory mózgowej gryzoni tworzyły neurony i komórki glejowe, przy czym neurony były tworzone głównie w 14-16-dniowym wieku ciążowym rozwoju zarodka (okres maksymalnej intensywności neurogenezy w korze mózgowej myszy i szczurów). W 18. dniu embriogenezy różnicowanie przesunęło się w kierunku tworzenia astrocytów ze znacznym spadkiem liczby nowo powstałych neuronów. Znakowanie in situ komórek glejowych promienistych za pomocą GFP pozwoliło na wykrycie asymetrycznego podziału znakowanych komórek w jamie pęcherzyków mózgowych 15-16-dniowych zarodków szczurów z pojawieniem się komórek potomnych o immunologicznych i elektrofizjologicznych cechach neuroblastów. Warto zauważyć, że zgodnie z wynikami obserwacji dynamicznych powstające neuroblasty wykorzystują komórkę macierzystą komórek glejowych promienistych do migracji na powierzchnię opony miękkiej.

Endogennym markerem gleju radialnego jest białko filamentu pośredniego nestyna. Wykorzystując metodę sortowania przepływowego fluorescencyjnego komórek znakowanych retrowirusem związanym z GFP i ekspresjonowanych pod kontrolą nestyny, wykazano, że komórki macierzyste zakrętu zębatego i wnęki hipokampa ludzkiego (materiał uzyskano podczas operacji padaczki) ekspresują nestynę. Należą więc do gleju radialnego, który u człowieka, podobnie jak u innych ssaków, jest zachowany wyłącznie w zakręcie zębatym.

Jednocześnie efektywność przeszczepu komórek jest determinowana nie tylko przez wysoką żywotność komórek dawcy, ich potencjał różnicowania i zdolność do zastępowania komórek wadliwych, ale przede wszystkim przez ich ukierunkowaną migrację. Pełna integracja funkcjonalna przeszczepionych komórek zależy od ich zdolności do migracji - bez zakłócania cytoarchitektury mózgu biorcy. Ponieważ glej radialny ulega niemal całkowitej redukcji w okresie postnatalnym, konieczne było ustalenie, w jaki sposób komórki dawcy mogą przemieszczać się ze strefy przeszczepu do miejsca uszkodzenia mózgu u dorosłych biorców. Istnieją dwa warianty migracji komórek do OUN, które nie zależą od glej radialny: zjawisko migracji stycznej lub przemieszczania się neuroblastów podczas rozwoju kory mózgowej prostopadle do sieci glejowej radialnej, a także migracja „w szeregu” lub „wzdłuż łańcucha”. W szczególności migracja komórek progenitorowych neuronów ze strefy rostralnej podkomorowej do opuszki węchowej zachodzi jako sekwencja ściśle przylegających komórek otoczonych komórkami glejowymi. Uważa się, że komórki te wykorzystują komórki partnerskie jako substrat migracyjny, a głównym regulatorem takich międzykomórkowych oddziaływań jest PSA-NCAM (polisializowana cząsteczka adhezji komórek nerwowych). Dlatego migracja neuronów nie wymaga koniecznie udziału gleju radialnego lub istniejących wcześniej połączeń aksonowych. Pozaradialna forma ruchu komórek w „sznurku” wzdłuż rostralnego szlaku migracji jest utrzymywana przez całe życie, co wskazuje na realną możliwość ukierunkowanego dostarczania przeszczepionych komórek progenitorowych neuronów do dojrzałego układu nerwowego.

Istnieje hipoteza o obecności linii komórek macierzystych w ontogenezie mózgu, zgodnie z którą we wczesnych stadiach rozwoju mózgu komórka macierzysta jest komórką neuroepitelialną, która w miarę dojrzewania transdyferencjuje się w glej promienisty. W wieku dorosłym rolę komórek macierzystych pełnią komórki o cechach astrocytów. Pomimo szeregu kontrowersyjnych punktów (sprzeczności dotyczące komórek macierzystych hipokampa, a także głębokich części mózgu, które nie mają warstwowej kory i rozwijają się z guzków wzgórzowych, gdzie glej promienisty jest nieobecny), jasna i prosta koncepcja stałej zmiany fenotypu komórek macierzystych w trakcie ontogenezy wydaje się bardzo atrakcyjna.

Wpływ czynników mikrośrodowiskowych na determinację i późniejsze różnicowanie komórek różnicujących się nerwowo został wyraźnie wykazany przez przeszczepienie dojrzałych komórek macierzystych rdzenia kręgowego szczura do różnych regionów dojrzałego układu nerwowego. Kiedy komórki macierzyste przeszczepiono do zakrętu zębatego lub do regionu migracji neuronów w cebulkach węchowych, zaobserwowano aktywną migrację przeszczepionych komórek z utworzeniem licznych neuronów. Przeszczepienie komórek macierzystych do rdzenia kręgowego i regionu rogu Ammona spowodowało utworzenie astrocytów i oligodendrocytów, podczas gdy przeszczepienie do zakrętu zębatego spowodowało utworzenie nie tylko komórek glejowych, ale także neuronów.

U dojrzałego szczura liczba dzielących się komórek w zakręcie zębatym może sięgać kilku tysięcy na dobę - mniej niż 1% całkowitej liczby komórek ziarnistych. Neurony stanowią 50-90% komórek, astocyty i inne elementy glejowe - około 15%. Pozostałe komórki nie mają cech antygenowych neuronów i gleju, ale zawierają antygeny komórek śródbłonka, co wskazuje na ścisły związek neurogenezy i angiogenezy w zakręcie zębatym. Zwolennicy możliwości różnicowania komórek śródbłonka w komórki prekursorowe neuronów powołują się na zdolność komórek śródbłonka in vitro do syntezy BDNF.

Szybkość samoorganizacji obwodów neuronowych jest imponująca: podczas różnicowania komórki prekursorowe komórek ziarnistych migrują do zakrętu zębatego i tworzą wypustki rosnące w kierunku strefy SAZ rogu Ammona i tworząc synapsy z piramidalnymi neuronami glutaminergicznymi i interkalacyjnymi neuronami hamującymi. Nowo utworzone komórki ziarniste są integrowane z istniejącymi obwodami neuronowymi w ciągu 2 tygodni, a pierwsze synapsy pojawiają się już po 4-6 dniach od pojawienia się nowych komórek. Częste podawanie BrdU lub 3H-tymidyny (jednej z metod identyfikacji dorosłych komórek macierzystych) dojrzałym zwierzętom pozwoliło na znalezienie dużej liczby znakowanych neuronów i astrocytów w rogu Ammona, co wskazuje na możliwość tworzenia nowych neuronów nie tylko w zakręcie zębatym, ale także w innych częściach hipokampa. Zainteresowanie procesami podziału, różnicowania i obumierania komórek w zakręcie zębatym hipokampa dojrzałego mózgu wynika również z faktu, że neurony tam powstające są zlokalizowane w jednym z kluczowych obszarów hipokampa, odpowiedzialnym za procesy uczenia się i zapamiętywania.

W ten sposób ustalono dzisiaj, że komórki progenitorowe neuronów pochodzą z komórek strefy podwyściółkowej komory bocznej dojrzałych gryzoni. Migrują one wzdłuż rostralnego szlaku migracji utworzonego przez zorientowane wzdłużnie komórki astroglejowe do opuszki węchowej, gdzie są osadzane w warstwie komórek ziarnistych i różnicują się w neurony tej struktury. Migrację komórek progenitorowych neuronów wykryto w rostralnym szlaku migracji dorosłych małp, co wskazuje na możliwość tworzenia nowych neuronów w opuszce węchowej naczelnych. Neuronalne komórki macierzyste wyizolowano z opuszki węchowej dorosłego człowieka i przeniesiono do linii, których sklonowane komórki różnicują się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Komórki macierzyste znaleziono w hipokampie dojrzałego mózgu szczurów, myszy, małp i ludzi. Neuronalne komórki macierzyste strefy podziarnistej powięzi zębatej są źródłem komórek progenitorowych migrujących do przyśrodkowych i bocznych kończyn hipokampa, gdzie różnicują się w dojrzałe komórki ziarniste i elementy glejowe. Aksony de novo utworzonych neuronów powięzi zębatej są śledzone do pola CA3, co wskazuje na udział nowo powstałych neuronów w realizacji funkcji hipokampa. W obszarach asocjacyjnych neokorteksu dorosłych małp stwierdzono neuronalne komórki progenitorowe migrujące ze strefy podkomorowej. W warstwie VI neokorteksu mózgu myszy nowe neurony piramidalne są wykrywane 2-28 tygodni po indukowanym uszkodzeniu i śmierci natywnych neuronów tej warstwy z powodu migracji wcześniej uśpionych komórek progenitorowych strefy podkomorowej. Wreszcie, rzeczywistość postnatalnej neurogenezy w mózgu człowieka jest potwierdzona dwukrotnym wzrostem liczby neuronów korowych, który trwa przez pierwsze 6 lat po urodzeniu.

Niemałe znaczenie dla praktycznej transplantologii komórek ma kwestia regulacji procesów reprodukcji i różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych. Najważniejszymi czynnikami hamującymi proliferację nerwowych komórek progenitorowych są glikokortykoidy, które gwałtownie zmniejszają liczbę podziałów, podczas gdy usunięcie nadnerczy, wręcz przeciwnie, znacznie zwiększa liczbę mitoz (Gould, 1996). Warto zauważyć, że morfogeneza zakrętu zębatego u gryzoni jest najbardziej intensywna w ciągu pierwszych dwóch tygodni rozwoju postnatalnego w okresie braku reakcji na stres na tle gwałtownego spadku produkcji i wydzielania hormonów steroidowych kory nadnerczy. Kortykosteroidy hamują migrację komórek ziarnistych - nowe neurony nie są osadzane w warstwie ziarnistej zakrętu zębatego, lecz pozostają we wnęce. Zakłada się, że jednocześnie zaburzone są procesy powstawania połączeń synaptycznych. Ochrona komórek przed taką „agresją steroidową” odbywa się poprzez minimalną ekspresję receptorów mineralokortykoidowych i glukokortykoidowych na proliferujących komórkach ziarnistych nie tylko podczas rozwoju zakrętu zębatego, ale także u zwierząt dojrzałych. Jednak ze wszystkich neuronów mózgu to neurony hipokampa charakteryzują się najwyższą zawartością receptorów glukokortykoidowych, co powoduje efekt stresu na hipokamp. Stres psychoemocjonalny i sytuacje stresowe hamują neurogenezę, a stres przewlekły gwałtownie zmniejsza zdolność zwierząt do nabywania nowych umiejętności i uczenia się. Bardziej wyraźny negatywny wpływ stresu przewlekłego na neurogenezę jest całkiem zrozumiały, jeśli weźmiemy pod uwagę przeważnie uśpiony stan komórek macierzystych neuronów. Podczas unieruchomienia ciężarnych szczurów (dla gryzoni - niezwykle silny czynnik stresowy) stwierdzono, że stres prenatalny powoduje również spadek liczby komórek w zakręcie zębatym i znacznie hamuje neurogenezę. Wiadomo, że glikokortykosteroidy uczestniczą w patogenezie stanów depresyjnych, czego morfologicznym odpowiednikiem jest hamowanie neurogenezy, patologiczna reorganizacja neuronów i połączeń międzyneuronalnych oraz obumieranie komórek nerwowych. Z drugiej strony, środki chemioterapii przeciwdepresyjnej aktywują powstawanie neuronów de novo, co potwierdza związek między procesami powstawania nowych neuronów w hipokampie a rozwojem depresji. Istotny wpływ na neurogenezę mają estrogeny, których działanie jest odwrotne do działania glikokortykosteroidów i polega na wspomaganiu proliferacji i żywotności komórek progenitorowych neuronów. Należy zauważyć, że estrogeny znacząco zwiększają zdolność uczenia się zwierząt. Niektórzy autorzy wiążą cykliczne zmiany liczby komórek ziarnistych i ich nadmiar u samic z wpływem estrogenów.

Wiadomo, że neurogeneza jest kontrolowana przez EGF, FGF i BDNF, jednak mechanizmy wpływu sygnałów zewnętrznych na komórki macierzyste z mitogenów i czynników wzrostu nie zostały wystarczająco zbadane. Ustalono, że PDGF in vitro utrzymuje neuronalny kierunek różnicowania komórek progenitorowych, a rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF), podobnie jak trójjodotyronina, stymuluje powstawanie głównie elementów glejowych - astrocytów i oligodendrocytów. Białko aktywujące przysadkową cyklazę adenylanową (PACAP) i wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP) aktywują proliferację neuronalnych komórek progenitorowych, ale jednocześnie hamują procesy różnicowania komórek potomnych. Opioidy, zwłaszcza w przypadku ich długotrwałego narażenia, znacząco hamują neurogenezę. Jednakże receptorów opioidowych nie zidentyfikowano w komórkach macierzystych i komórkach progenitorowych zakrętu zębatego (są one obecne w różnicujących się neuronach okresu embrionalnego), co nie pozwala nam ocenić bezpośredniego wpływu opioidów.

Potrzeby praktycznej medycyny regeneracyjno-plastycznej zmusiły badaczy do zwrócenia szczególnej uwagi na badanie pluri- i multipotencji komórek macierzystych. Wdrożenie tych właściwości na poziomie regionalnych komórek macierzystych dorosłego organizmu mogłoby w przyszłości zapewnić produkcję niezbędnego materiału przeszczepowego. Wykazano powyżej, że epigenetyczna stymulacja nerwowych komórek macierzystych pozwala na uzyskanie proliferujących komórek już uformowanych zgodnie z fenotypami nerwowymi, co ogranicza ich liczbę. W przypadku wykorzystania totipotencjalnych właściwości embrionalnej komórki macierzystej proliferacja do momentu uzyskania wystarczającej liczby komórek następuje wcześniej niż różnicowanie nerwowe, a namnożone komórki łatwo przekształcają się w fenotyp nerwowy. Aby uzyskać nerwowe komórki macierzyste, ESBC są izolowane z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty i hodowane w obowiązkowej obecności LIF, co zachowuje ich totipotencję i zdolność do nieograniczonego podziału. Następnie różnicowanie nerwowe ESC jest indukowane za pomocą kwasu retinowego. Transplantacja powstałych komórek macierzystych nerwowych do prążkowia uszkodzonego przez chinolinę i 6-hydroksydopaminę wiąże się z ich różnicowaniem w neurony dopaminergiczne i serotoninergiczne. Po wstrzyknięciu do komór mózgu zarodkowego szczura, komórki progenitorowe nerwowe pochodzące z ESC migrują do różnych obszarów mózgu biorcy, w tym do kory mózgowej, prążkowia, przegrody, wzgórza, podwzgórza i móżdżku. Komórki pozostające w jamie komorowej tworzą struktury nabłonkowe przypominające cewę nerwową, a także pojedyncze wyspy tkanki nieneuronalnej. W miąższu mózgu zarodka biorcy przeszczepione komórki wytwarzają trzy główne typy komórek układu nerwowego. Niektóre z nich mają wydłużone dendryty wierzchołkowe, ciała komórek piramidalnych i aksony podstawne wystające do ciała modzelowatego. Astrocyty pochodzenia dawcy rozszerzają procesy na pobliskie naczynia włosowate, a oligodendrocyty ściśle kontaktują się z mufkami mielinowymi, uczestnicząc w formowaniu mieliny. W ten sposób komórki progenitorowe neuronów uzyskane z ESC in vitro są zdolne do ukierunkowanej migracji i regionalnego różnicowania odpowiedniego do sygnałów mikrośrodowiska, dostarczając wielu obszarom rozwijającego się mózgu neurony i gleje.

Niektórzy autorzy rozważają możliwość de- i transdyferencjacji regionalnych komórek macierzystych dorosłego organizmu. Pośredniego potwierdzenia dedyferencjacji komórek w hodowli z ekspansją ich potencjałów dostarczają dane dotyczące wszczepienia mysich komórek macierzystych nerwowych do czerwonego szpiku kostnego z późniejszym rozwojem z nich linii komórkowych, dających funkcjonalnie aktywne komórki krwi obwodowej. Ponadto przeszczepienie genetycznie znakowanych (LacZ) komórek neurosfery pobranych z dojrzałego lub embrionalnego mózgu do mózgu napromieniowanych myszy z zahamowaną hematopoezą doprowadziło do powstania nie tylko pochodnych nerwowych z komórek macierzystych, ale również spowodowało generację komórek krwi, co wskazuje na pluripotencję komórek macierzystych nerwowych, realizowaną poza mózgiem. Tak więc komórka macierzysta nerwowa jest zdolna do różnicowania się w komórki krwi pod wpływem sygnałów z mikrośrodowiska szpiku kostnego z wstępną transformacją w komórkę macierzystą hematopoetyczną. Z drugiej strony, podczas przeszczepiania komórek macierzystych szpiku kostnego do mózgu, ustalono ich różnicowanie pod wpływem mikrośrodowiska tkanki mózgowej w komórki glejowe i nerwowe. W konsekwencji potencjał różnicowania komórek macierzystych nerwowych i hematopoetycznych nie jest ograniczony przez specyficzność tkankową. Innymi słowy, czynniki lokalnego mikrośrodowiska, inne niż te charakterystyczne dla tkanek mózgu i szpiku kostnego, są w stanie zmienić kierunek różnicowania tych komórek. Wykazano, że komórki macierzyste nerwowe wprowadzone do układu żylnego napromieniowanych myszy tworzą populacje komórek mieloidalnych, limfoidalnych i niedojrzałych komórek hematopoetycznych w śledzionie i szpiku kostnym. In vitro ustalono wpływ białek morfogenetycznych szpiku kostnego (BMP) na przeżycie i różnicowanie komórek macierzystych nerwowych, determinując, podobnie jak we wczesnych stadiach embriogenezy, ich rozwój w kierunku nerwowym lub glejowym. W hodowlach komórek macierzystych neuronów z 16-dniowych zarodków szczurów, BMP indukują powstawanie neuronów i astroglejów, podczas gdy w hodowlach komórek macierzystych pochodzących z mózgu okołoporodowego, powstają tylko astrocyty. Ponadto, BMP hamują powstawanie oligodendrocytów, które pojawiają się in vitro tylko po dodaniu antagonisty BMP, noggin.

Procesy transdyferencjacji są niespecyficzne dla gatunku: ludzkie komórki macierzyste hematopoezy szpiku kostnego przeszczepione do prążkowia dojrzałych szczurów migrują do istoty białej zewnętrznej torebki, ipsi- i kontralateralnej nowej kory, gdzie tworzą elementy komórkowe przypominające astrocyty (Azizi i in., 1998). Kiedy komórki macierzyste szpiku kostnego są allotransplantowane do komory bocznej nowonarodzonych myszy, migrację komórek macierzystych hematopoezy można prześledzić do struktur przedniego mózgu i móżdżku. W prążkowiu i warstwie molekularnej hipokampa migrujące komórki przekształcają się w astrocyty, a w opuszce węchowej, wewnętrznej warstwie komórek ziarnistych móżdżku i siateczkowatej formacji pnia mózgu tworzą komórki przypominające neurony z pozytywną reakcją na neurofilamenty. Po dożylnym podaniu dorosłym myszom komórek hematopoetycznych, w korze nowej, wzgórzu, pniu mózgu i móżdżku wykryto mikro- i astrocyty znakowane GFP.

Ponadto komórki macierzyste szpiku kostnego, które dają początek wszystkim typom komórek tkanki łącznej, mogą również podlegać transdyferencjacji nerwowej w określonych warunkach (należy pamiętać, że embrionalnym źródłem mezenchymy są komórki grzebienia nerwowego). Wykazano, że ludzkie i mysie komórki macierzyste szpiku kostnego hodowane in vitro w obecności EGF lub BDNF wyrażają marker komórek progenitorowych neuronów nestin, a dodanie różnych kombinacji czynników wzrostu prowadzi do powstawania komórek z markerami gleju (GFAP) i neuronów (białko jądrowe, NeuN). Oznakowane syngeniczne komórki macierzyste mezenchymalne przeszczepione do komory bocznej mózgu nowonarodzonych myszy migrują i lokalizują się w przednim mózgu i móżdżku bez zakłócania cytoarchitektury mózgu biorcy. Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego różnicują się w dojrzałe astrocyty w prążkowiu i warstwie molekularnej hipokampa, a następnie zasiedlają opuszkę węchową, warstwy ziarniste móżdżku i formację siateczkowatą, gdzie przekształcają się w neurony. Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego są zdolne do różnicowania się w makrogleje in vitro i integrowania się ze strukturami mózgu szczura po przeszczepie. Bezpośredni przeszczep mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do hipokampa dorosłych szczurów wiąże się również z ich migracją do miąższu mózgu i różnicowaniem neuroglejowym.

Zakłada się, że przeszczepienie komórek macierzystych szpiku kostnego może rozszerzyć możliwości terapii komórkowej chorób ośrodkowego układu nerwowego charakteryzujących się nadmierną patologiczną śmiercią neuronów. Należy jednak zauważyć, że nie wszyscy badacze dostrzegają fakt wzajemnej transformacji komórek macierzystych układu nerwowego i krwiotwórczego, zwłaszcza in vivo, co znów wynika z braku wiarygodnego markera do oceny ich transdyferencjacji i dalszego rozwoju.

Transplantacja komórek macierzystych otwiera nowe horyzonty dla komórkowej terapii genowej dziedzicznej patologii neurologicznej. Modyfikacja genetyczna nerwowych komórek macierzystych obejmuje wprowadzenie genetycznych konstruktów regulacyjnych, których produkty oddziałują z białkami cyklu komórkowego w trybie automatycznej regulacji. Transdukcja takich genów do embrionalnych komórek progenitorowych jest wykorzystywana do namnażania nerwowych komórek macierzystych. Większość genetycznie zmodyfikowanych klonów komórkowych zachowuje się jak stabilne linie komórkowe, nie wykazując oznak transformacji in vivo ani in vitro, ale mają wyraźną zdolność do kontaktowego hamowania proliferacji. Po przeszczepieniu, namnożone transfekowane komórki są integrowane z tkanką biorcy bez zakłócania cytoarchitektury i bez przechodzenia transformacji nowotworowej. Nerwowe komórki macierzyste dawcy nie deformują strefy integracji i konkurują o przestrzeń na równi z komórkami progenitorowymi gospodarza. Jednak w 2-3 dniu intensywność podziału komórek transfekowanych gwałtownie spada, co odpowiada kontaktowemu hamowaniu ich proliferacji in vitro. Zarodki-biorcy transfektantów neuronalnych nie mają nieprawidłowości w rozwoju ośrodkowego układu nerwowego, wszystkie obszary mózgu mające kontakt z przeszczepem rozwijają się prawidłowo. Po przeszczepie klony neuronalnych komórek macierzystych szybko migrują ze strefy wstrzyknięcia i często wykraczają poza odpowiadające im strefy embrionalne wzdłuż drogi rostralnej, odpowiednio integrując się z innymi obszarami mózgu. Integracja genetycznie zmodyfikowanych klonów i transfekowanych linii komórkowych neuronalnych komórek macierzystych do mózgu organizmu gospodarza jest charakterystyczna nie tylko dla okresu embrionalnego: komórki te są wszczepiane do licznych obszarów ośrodkowego układu nerwowego płodu, noworodka, dorosłego, a nawet starzejącego się organizmu biorcy i wykazują zdolność do odpowiedniej integracji i różnicowania. W szczególności po przeszczepie do jamy komorowej mózgu transfekowane komórki migrują bez uszkadzania bariery krew-mózg i stają się integralnymi funkcjonalnymi składnikami komórkowymi tkanki mózgowej. Neurony dawcy tworzą odpowiednie synapsy i ekspresują specyficzne kanały jonowe. Dzięki zachowaniu integralności bariery krew-mózg, astrogleje, pochodne transfekowanych komórek macierzystych układu nerwowego, rozszerzają wypustki na naczynia mózgowe, a oligodendrocyty pochodzące od dawcy ekspresują podstawowe białko mieliny i mielinizują wypustki neuronalne.

Ponadto komórki macierzyste układu nerwowego są transfekowane w celu wykorzystania jako wektory komórkowe. Takie konstrukcje genetyczno-wektorowe zapewniają in vivo stabilną ekspresję obcych genów zaangażowanych w rozwój układu nerwowego lub są wykorzystywane do korygowania istniejących defektów genetycznych, ponieważ produkty tych genów są zdolne do kompensowania różnych nieprawidłowości biochemicznych ośrodkowego układu nerwowego. Wysoka aktywność migracyjna transfekowanych komórek macierzystych i odpowiednia implantacja do stref germinalnych różnych obszarów rozwijającego się mózgu pozwalają mieć nadzieję na całkowite przywrócenie dziedzicznego niedoboru enzymów komórkowych. W modelowaniu zespołu ataksji-teleangiektazjologii (mutowane linie myszy pg i pcd) komórki Purkinjego znikają z móżdżku zwierząt doświadczalnych w pierwszych tygodniach rozwoju postnatalnego. Wykazano, że wprowadzaniu komórek macierzystych układu nerwowego do mózgu takich zwierząt towarzyszy ich różnicowanie w komórki Purkinjego i neurony ziarniste. U mutantów pcd zaburzenia koordynacji ruchowej są częściowo korygowane, a intensywność drżenia jest zmniejszona. Podobne wyniki uzyskano poprzez przeszczepienie sklonowanych ludzkich komórek macierzystych układu nerwowego do naczelnych, u których zwyrodnienie komórek Purkinjego wywołano za pomocą onkonazy. Po przeszczepie komórki macierzyste układu nerwowego dawcy znaleziono w warstwach ziarnistych, molekularnych i komórkach Purkinjego miąższu móżdżku. Dlatego modyfikacja genetyczna komórek progenitorowych układu nerwowego może zapewnić stabilną, zaangażowaną modyfikację fenotypu, która jest odporna na wpływy zewnętrzne. Jest to szczególnie ważne w procesach patologicznych związanych z rozwojem czynników u biorcy, które uniemożliwiają przeżycie i różnicowanie komórek dawcy (np. podczas agresji immunologicznej).

Mukopolisacharydoza typu VII u ludzi charakteryzuje się neurodegeneracją i postępującą niepełnosprawnością intelektualną, która jest modelowana u myszy przez mutację delecyjną w genie beta-glukuronidazy. Po przeszczepieniu transfekowanych komórek macierzystych nerwowych wydzielających beta-glukuronidazę do komór mózgowych nowonarodzonych myszy biorców z defektem, komórki dawcy znajdują się najpierw w strefie końcowej, a następnie rozprzestrzeniają się w miąższu mózgu, trwale korygując integralność lizosomów w mózgu myszy z mutacją. W modelu choroby Taya-Sachsa, retrowirusowo transdukowane komórki macierzyste nerwowe, gdy są podawane in utero płodom myszy i przeszczepiane nowonarodzonym myszom, zapewniają skuteczną ekspresję podjednostki beta beta-heksozoaminidazy u biorców z mutacją prowadzącą do patologicznej akumulacji beta2-gangliozydu.

Innym kierunkiem medycyny regeneracyjnej jest stymulacja potencjału proliferacyjnego i różnicującego własnych komórek macierzystych nerwowych pacjenta. W szczególności komórki macierzyste nerwowe wydzielają NT-3 podczas hemisekcji rdzenia kręgowego i niedotlenienia mózgu u szczurów, ekspresują NGF i BDNF w przegrodzie i zwojach podstawy, hydroksylazy tyrozynowe w prążkowiu, a także reelin w móżdżku i zasadowe białko mieliny w mózgu.

Jednakże zagadnieniom stymulacji neurogenezy wyraźnie nie poświęca się wystarczającej uwagi. Kilka badań sugeruje, że obciążenie funkcjonalne ośrodków nerwowych odpowiedzialnych za rozróżnianie zapachów znajduje odzwierciedlenie w tworzeniu nowych neuronów. U myszy transgenicznych z niedoborem cząsteczek adhezji neuronalnej, spadek intensywności neurogenezy i spadek liczby neuronów migrujących do cebulek węchowych łączył się z upośledzeniem zdolności rozróżniania zapachów, chociaż próg percepcji zapachu i krótkotrwała pamięć węchowa nie były upośledzone. Stan funkcjonalny komórek zakrętu zębatego odgrywa ważną rolę w regulacji neurogenezy: osłabienie wpływu glutaminianu na komórki ziarniste po zniszczeniu kory entorhinalnej sprzyja proliferacji i różnicowaniu neuronów, a stymulacja włókien szlaku przeszywającego (głównego wejścia aferentnego do hipokampa) powoduje zahamowanie neurogenezy. Antagoniści receptora NMDA aktywują procesy powstawania nowych neuronów, podczas gdy agoniści przeciwnie, zmniejszają intensywność neurogenezy, co w efekcie przypomina działanie glikokortykosteroidów. W literaturze można znaleźć sprzeczne wyniki badań: informacje o eksperymentalnie udowodnionym hamującym działaniu pobudzającego neuroprzekaźnika glutaminianu na neurogenezę są sprzeczne z danymi o stymulacji proliferacji komórek progenitorowych i pojawianiu się nowych neuronów ze wzrostem aktywności napadowej w hipokampie zwierząt z eksperymentalnymi kainowymi i pilokarpinowymi modelami padaczki. Jednocześnie w tradycyjnym modelu padaczki wywołanej wielokrotną podprogową stymulacją pewnego obszaru mózgu (kindling) i charakteryzującej się mniej wyraźną śmiercią neuronów, intensywność neurogenezy wzrasta dopiero w późnej fazie kindlingu, kiedy obserwuje się uszkodzenie i śmierć neuronów w hipokampie. Wykazano, że w padaczce aktywność napadowa stymuluje neurogenezę z nieprawidłową lokalizacją nowych neuronów ziarnistych, z których wiele pojawia się nie tylko w zakręcie zębatym, ale także we wnęce. Takie neurony mają ogromne znaczenie w rozwoju kiełkowania włókien mchu, ponieważ ich aksony tworzą normalnie nieobecne odwrotne połączenia poboczne, które tworzą liczne synapsy z sąsiadującymi komórkami ziarnistymi.

Zastosowanie regionalnych komórek macierzystych układu nerwowego otwiera nowe perspektywy zastosowania transplantacji komórek w leczeniu metabolicznych i genetycznych chorób neurodegeneracyjnych, chorób demielinizacyjnych i zaburzeń pourazowych ośrodkowego układu nerwowego. Przed wykonaniem transplantacji komórek zastępczych zgodnie z jedną z metod przeprowadza się selekcję i ekspansję wymaganego typu komórek progenitorowych układu nerwowego ex vivo w celu ich późniejszego wprowadzenia bezpośrednio do uszkodzonego obszaru mózgu. Efekt terapeutyczny w tym przypadku wynika z wymiany uszkodzonych komórek lub lokalnego uwalniania czynników wzrostu i cytokin. Ta metoda terapii regeneracyjno-plastycznej wymaga transplantacji wystarczająco dużej liczby komórek o ustalonych cechach funkcjonalnych.

Dalsze badania nad charakterystyką molekularną i potencjałem regeneracyjno-plastycznym dojrzałych komórek macierzystych mózgu, a także zdolnością regionalnych komórek macierzystych różnego pochodzenia tkankowego do transdyferencjacji, również należy uznać za właściwe. Obecnie przeprowadzono już badanie przesiewowe antygenów komórek macierzystych hematopoetycznych szpiku kostnego, z określeniem kombinacji markerów komórek zdolnych do transdyferencjacji w progenitorowe komórki macierzyste układu nerwowego (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Uzyskano komórki, które tworzą neurosfery in vitro i tworzą neurony po przeszczepieniu do mózgu nowonarodzonych myszy z niedoborem odporności. Interesujące dla ksenotransplantologii komórkowej są wyniki badań nad możliwością krzyżowej transplantacji komórek macierzystych u osobników ewolucyjnie odległych taksonów. Wyniki wszczepienia komórek macierzystych neuronów do obszaru guza mózgu pozostają bez właściwej interpretacji: przeszczepione komórki aktywnie migrują w całej objętości guza, nie przekraczając jej granic, a gdy komórki są wprowadzane do nienaruszonej części mózgu, obserwuje się ich aktywną migrację w kierunku guza. Kwestia biologicznego znaczenia takiej migracji pozostaje otwarta.

Należy zauważyć, że udana transplantacja nerwowych komórek macierzystych, jak również innych nerwowych komórek progenitorowych uzyskanych z ESC, jest możliwa tylko przy użyciu wysoce oczyszczonych nerwowych komórek progenitorowych, ponieważ niezróżnicowane embrionalne komórki macierzyste nieuchronnie przekształcają się w potworniaki i potworniakorak po przeszczepieniu dorosłemu immunokompetentnemu biorcy. Nawet minimalna ilość słabo zróżnicowanych komórek w zawiesinie komórek dawcy gwałtownie zwiększa nowotwórczość przeszczepu i niedopuszczalnie zwiększa ryzyko rozwoju nowotworu lub powstania tkanki nieneuronalnej. Uzyskanie jednorodnych populacji nerwowych komórek progenitorowych jest możliwe przy użyciu komórek, które powstają na pewnych etapach normalnej embriogenezy jako alternatywnego źródła tkanki dawcy. Inne podejście obejmuje ostrożną eliminację niepożądanych populacji komórek poprzez selekcję specyficzną dla linii. Wykorzystanie ESC do neurotransplantacji po ich niewystarczającej ekspozycji in vitro na czynniki wzrostu jest również niebezpieczne. W tym przypadku nie można wykluczyć niepowodzenia programu różnicowania neuronalnego i ukształtowania struktur inherentnych dla cewy nerwowej.

Dzisiaj jest całkiem oczywiste, że nerwowe komórki macierzyste wykazują tropizm do patologicznie zmienionych obszarów ośrodkowego układu nerwowego i mają wyraźny efekt regeneracyjno-plastyczny. Mikrośrodowisko w miejscu śmierci komórek tkanki nerwowej modeluje kierunek różnicowania przeszczepionych komórek, uzupełniając w ten sposób niedobór określonych elementów nerwowych w strefie uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego. W niektórych procesach neurodegeneracyjnych powstają sygnały neurogenne w celu powtórzenia neurogenezy, a nerwowe komórki macierzyste dojrzałego mózgu są w stanie odpowiedzieć na tę pouczającą informację. Liczne dane eksperymentalne służą jako jasna ilustracja terapeutycznego potencjału nerwowych komórek macierzystych. Dożylne podanie klonu nerwowych komórek macierzystych zwierzętom z podwiązaniem środkowej tętnicy mózgowej (model udaru niedokrwiennego) pomaga zmniejszyć powierzchnię i objętość destrukcyjnie zmienionego obszaru mózgu, szczególnie w przypadku przeszczepu nerwowych komórek macierzystych wraz z FGF2. Immunocytochemicznie obserwuje się migrację komórek dawcy do strefy niedokrwienia z ich późniejszą integracją z nienaruszonymi komórkami mózgowymi biorcy. Przeszczepienie niedojrzałych komórek linii neuroepitelialnej myszy MHP36 do mózgu szczurów z udarem doświadczalnym poprawia funkcję sensomotoryczną, a wprowadzenie tych komórek do komór mózgowych wzmacnia funkcje poznawcze. Przeszczepienie neuronalnie uformowanych komórek hematopoetycznych ludzkiego szpiku kostnego szczurom eliminuje dysfunkcję kory mózgowej spowodowaną uszkodzeniem niedokrwiennym. W tym przypadku ksenogeniczne komórki progenitorowe migrują z miejsca wstrzyknięcia do strefy destrukcyjnych zmian w tkance mózgowej. Wewnątrzczaszkowy przeszczep homologicznych komórek szpiku kostnego w urazowym uszkodzeniu kory mózgowej u szczurów prowadzi do częściowego przywrócenia funkcji motorycznej. Komórki dawcy wszczepiają się, proliferują, ulegają różnicowaniu nerwowemu w neurony i astrocyty i migrują w kierunku uszkodzenia. Po wstrzyknięciu do prążkowia dorosłych szczurów z udarem doświadczalnym, sklonowane ludzkie komórki macierzyste układu nerwowego zastępują uszkodzone komórki ośrodkowego układu nerwowego i częściowo przywracają zaburzone funkcje mózgu.

Ludzkie komórki macierzyste nerwowe są głównie izolowane z zarodkowego telencephalonu, który rozwija się znacznie później niż bardziej ogonowo położone części pnia nerwowego. Wykazano możliwość wyizolowania komórek macierzystych nerwowych z rdzenia kręgowego 43-137-dniowego płodu ludzkiego, ponieważ w obecności EGF i FGF2 komórki te tworzą neurosfery i wykazują multipotencję we wczesnych pasażach, różnicując się w neurony i astrocyty. Jednak długotrwała hodowla komórek progenitorowych nerwowych (ponad 1 rok) pozbawia je multipotencji - takie komórki są zdolne do różnicowania się tylko w astrocyty, czyli stają się unipotentne. Regionalne komórki macierzyste nerwowe można uzyskać w wyniku częściowej bulbektomii i po rozmnożeniu w hodowli w obecności LIF przeszczepić temu samemu pacjentowi ze zmianami neurodegeneracyjnymi w innych częściach ośrodkowego układu nerwowego. W klinice terapia zastępcza komórkami macierzystymi z wykorzystaniem komórek macierzystych neuronów została po raz pierwszy przeprowadzona u pacjentów z udarem mózgu, któremu towarzyszyło uszkodzenie jąder podstawy mózgu. W wyniku przeszczepu komórek dawcy zauważono poprawę stanu klinicznego większości pacjentów.

Niektórzy autorzy uważają, że zdolność komórek macierzystych układu nerwowego do wszczepiania się, migracji i integracji w różnych obszarach tkanki nerwowej w przypadku uszkodzenia OUN otwiera nieograniczone możliwości terapii komórkowej nie tylko lokalnych, ale także rozległych (udar lub uduszenie), wieloogniskowych (stwardnienie rozsiane), a nawet globalnych (większość dziedzicznych zaburzeń metabolicznych lub demencji neurodegeneracyjnych) procesów patologicznych. Rzeczywiście, gdy sklonowane komórki macierzyste myszy i człowieka są przeszczepiane zwierzętom biorcom (odpowiednio myszom i naczelnym) ze zwyrodnieniem neuronów dopaminergicznych w układzie mezostriatalnym wywołanym wprowadzeniem metylo-fenylotetrapirydyny (model choroby Parkinsona) 8 miesięcy przed przeszczepem, komórki macierzyste dawcy integrują się z OUN biorcy. Miesiąc później przeszczepione komórki są zlokalizowane obustronnie wzdłuż śródmózgowia. Niektóre z powstałych neuronów pochodzenia dawcy wyrażają hydrolazę tyrozynową przy braku oznak reakcji immunologicznej na przeszczep. U szczurów, którym podano 6-hydroksydopaminę (inny eksperymentalny model choroby Parkinsona), adaptacja przeszczepionych komórek do mikrośrodowiska w mózgu gospodarza została określona przez warunki hodowli komórek macierzystych neuronów przed ich przeszczepieniem. Komórki macierzyste neuronów, szybko proliferujące in vitro pod wpływem EGF, kompensowały niedobór neuronów dopaminergicznych w uszkodzonym prążkowiu skuteczniej niż komórki z 28-dniowych hodowli. Autorzy uważają, że jest to spowodowane utratą zdolności do odbierania odpowiednich sygnałów różnicowania podczas procesu podziału komórkowego komórek progenitorowych neuronów in vitro.

W niektórych badaniach próbowano zwiększyć skuteczność oddziaływania na procesy reinerwacji uszkodzonego prążkowia poprzez przeszczepienie do tego obszaru komórek prążkowia zarodkowego jako źródła czynników neurotroficznych z równoczesnym przeszczepieniem neuronów dopaminergicznych śródmózgowia brzusznego. Jak się okazało, skuteczność neurotransplantacji w dużej mierze zależy od sposobu wprowadzania tkanki nerwowej zarodka. W wyniku badań nad przeszczepianiem preparatów tkanki nerwowej zarodka do układu komorowego mózgu (w celu uniknięcia uszkodzenia miąższu prążkowia) uzyskano informacje o ich pozytywnym wpływie na defekt motoryczny w chorobie Parkinsona.

Jednakże w innych badaniach obserwacje eksperymentalne wykazały, że przeszczepienie preparatów tkanki nerwowej zarodka brzusznego śródmózgowia zawierających neurony dopaminergiczne do komory mózgowej, a także przeszczepienie GABA-ergicznych elementów nerwowych zarodka do prążkowia szczurów z hemiparkinsonizmem, nie sprzyja przywróceniu zaburzonych funkcji układu dopaminergicznego. Przeciwnie, analiza immunocytochemiczna potwierdziła dane o niskim wskaźniku przeżywalności neuronów dopaminergicznych brzusznego śródmózgowia przeszczepionych do prążkowia szczurów. Efekt terapeutyczny wewnątrzkomorowego przeszczepienia tkanki nerwowej zarodka brzusznego śródmózgowia został zrealizowany tylko pod warunkiem równoczesnego wszczepienia preparatu komórek prążkowia zarodkowego do odnerwionego prążkowia. Autorzy uważają, że mechanizm tego efektu jest związany z pozytywnym efektem troficznym elementów GABA-ergicznych prążkowia zarodkowego na specyficzną aktywność dopaminergiczną przeszczepów śródkomorowych brzusznego śródmózgowia. Wyraźnej reakcji glejowej w przeszczepach towarzyszyła niewielka regresja parametrów testu apomorfinowego. Te ostatnie z kolei korelowały z zawartością GFAP w surowicy krwi, co bezpośrednio wskazywało na naruszenie przepuszczalności bariery krew-mózg. Na podstawie tych danych autorzy doszli do wniosku, że poziom GFAP w surowicy krwi może być stosowany jako odpowiednie kryterium oceny stanu funkcjonalnego przeszczepu, a zwiększona przepuszczalność bariery krew-mózg dla antygenów neurospecyficznych, takich jak GFAP, jest ogniwem patogenetycznym w rozwoju niepowodzenia przeszczepu z powodu autoimmunologicznego uszkodzenia tkanki nerwowej biorcy.

Z punktu widzenia innych badaczy, wszczepienie i integracja nerwowych komórek macierzystych po przeszczepie są stabilne i dożywotnie, ponieważ komórki dawcy znajdują się u biorców przez co najmniej dwa lata po przeszczepie i bez znaczącego zmniejszenia ich liczby. Próby wyjaśnienia tego faktem, że w stanie niezróżnicowanym nerwowe komórki macierzyste nie wyrażają cząsteczek MHC klasy I i II na poziomie wystarczającym do wywołania reakcji odrzucenia immunologicznego, można uznać za prawdziwe tylko w odniesieniu do nisko zróżnicowanych prekursorów nerwowych. Jednak nie wszystkie nerwowe komórki macierzyste w mózgu biorcy są zachowywane w niedojrzałym stanie uśpienia. Większość z nich ulega różnicowaniu, podczas którego cząsteczki MHC są wyrażane w pełni.

W szczególności niewystarczająca skuteczność stosowania wewnątrzprążkowiowego przeszczepu preparatów brzusznego śródmózgowia zarodkowego zawierających neurony dopaminergiczne w leczeniu doświadczalnego parkinsonizmu wiąże się z niską przeżywalnością przeszczepionych neuronów dopaminergicznych (tylko 5-20%), co jest spowodowane reaktywną gliozą towarzyszącą miejscowemu urazowi miąższu mózgu podczas przeszczepu. Wiadomo, że miejscowy uraz miąższu mózgu i towarzysząca glioza prowadzą do zaburzenia integralności bariery krew-mózg z uwolnieniem antygenów tkanki nerwowej, w szczególności OCAR i antygenu swoistego dla neuronu, do krwi obwodowej. Obecność tych antygenów we krwi może powodować produkcję swoistych przeciwciał cytotoksycznych przeciwko nim i rozwój agresji autoimmunologicznej.

V. Tsymbalyuk i współautorzy (2001) donoszą, że nadal obowiązuje tradycyjny punkt widzenia, zgodnie z którym ośrodkowy układ nerwowy jest immunologicznie uprzywilejowaną strefą odizolowaną od układu odpornościowego barierą krew-mózg. W swoim przeglądzie literatury autorzy cytują szereg prac wskazujących, że ten punkt widzenia nie w pełni odpowiada istocie procesów odpornościowych w mózgu ssaków. Ustalono, że znakowane substancje wprowadzone do miąższu mózgu mogą dotrzeć do głębokich węzłów chłonnych szyjnych, a po śródmózgowym wstrzyknięciu antygenów w organizmie powstają specyficzne przeciwciała. Komórki węzłów chłonnych szyjnych reagują na takie antygeny proliferacją, rozpoczynającą się 5. dnia po wstrzyknięciu. Tworzenie specyficznych przeciwciał ujawniono również podczas przeszczepu skóry do miąższu mózgu. Autorzy przeglądu podają kilka hipotetycznych ścieżek transportu antygenów z mózgu do układu limfatycznego. Jednym z nich jest przejście antygenów z przestrzeni okołonaczyniowych do przestrzeni podpajęczynówkowej. Przyjmuje się, że przestrzenie okołonaczyniowe zlokalizowane wzdłuż dużych naczyń mózgu są odpowiednikiem układu limfatycznego w mózgu. Druga ścieżka przebiega wzdłuż włókien białych - przez kość sitową do naczyń limfatycznych błony śluzowej nosa. Ponadto w oponie twardej występuje rozległa sieć naczyń limfatycznych. Nieprzepuszczalność bariery krew-mózg dla limfocytów jest również dość względna. Udowodniono, że aktywowane limfocyty są zdolne do produkcji enzymów, które wpływają na przepuszczalność struktur „filtra immunologicznego” mózgu. Na poziomie żyłek pozakapilarnych aktywowane limfocyty pomocnicze T przenikają przez nienaruszoną barierę krew-mózg. Teza o braku komórek w mózgu, które reprezentują antygeny, nie wytrzymuje krytyki. Obecnie przekonująco udowodniono możliwość reprezentowania antygenów w OUN przez co najmniej trzy rodzaje komórek. Po pierwsze, są to komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego, które są zlokalizowane w mózgu wzdłuż dużych naczyń krwionośnych i w istocie białej. Po drugie, antygeny są zdolne do prezentacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych mózgu i w powiązaniu z antygenami MHC, co wspiera klonalny wzrost komórek T specyficznych dla tych antygenów. Po trzecie, komórki mikro- i astroglejowe działają jako czynniki prezentujące antygeny. Uczestnicząc w tworzeniu odpowiedzi immunologicznej w ośrodkowym układzie nerwowym, astrocyty nabywają właściwości komórek efektorowych układu odpornościowego i wyrażają szereg antygenów, cytokin i immunomodulatorów. Po inkubacji z interferonem y (y-INF), komórki astroglejowe in vitro wyrażają antygeny MHC klasy I i II, a stymulowane astrocyty są zdolne do prezentacji antygenu i utrzymania klonalnej proliferacji limfocytów.

Uraz tkanki mózgowej, stan zapalny pooperacyjny, obrzęk i złogi fibryny towarzyszące przeszczepowi tkanki nerwowej zarodka stwarzają warunki do zwiększonej przepuszczalności bariery krew-mózg z upośledzoną autotolerancją, uwrażliwieniem i aktywacją limfocytów CD3+CD4+. Prezentacja auto- i alloantygenów jest przeprowadzana przez astrocyty i komórki mikroglejowe, które reagują na y-INF poprzez ekspresję cząsteczek MHC, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, cząsteczek kostymulujących B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86), a także wydzielanie IL-la, IL-ip i y-INF.

W konsekwencji fakt dłuższego przeżycia embrionalnej tkanki nerwowej po przeszczepie śródmózgowym niż po jej obwodowym podaniu trudno powiązać z brakiem inicjacji odporności przeszczepu. Ponadto, monocyty, aktywowane limfocyty (cytotoksyczne komórki CD3+CD8+ i pomocnicze T) i produkowane przez nie cytokiny, a także przeciwciała przeciwko antygenom obwodowego przeszczepu embrionalnej tkanki nerwowej odgrywają główną rolę w procesie jego odrzucenia. Niski poziom ekspresji cząsteczek MHC w embrionalnej tkance nerwowej ma pewne znaczenie w tworzeniu warunków do dłuższej odporności neuroprzeszczepów na procesy immunologiczne komórek T. Dlatego w eksperymencie zapalenie immunologiczne po przeszczepie embrionalnej tkanki nerwowej do mózgu rozwija się wolniej niż po przeszczepie skóry. Niemniej jednak całkowite zniszczenie poszczególnych przeszczepów tkanki nerwowej obserwuje się po 6 miesiącach. W tym przypadku limfocyty T ograniczone antygenami MHC klasy II są zlokalizowane głównie w strefie przeszczepu (Nicholas i in., 1988). Doświadczalnie ustalono, że podczas ksenologicznej neurotransplantacji, wyczerpanie limfocytów pomocniczych T (L3T4+), ale nie cytotoksycznych limfocytów T (Lyt-2), wydłuża przeżycie tkanki nerwowej szczura w mózgu myszy biorcy. Odrzuceniu neurotransplantatu towarzyszy jego infiltracja przez makrofagi gospodarza i limfocyty T. W konsekwencji makrofagi gospodarza i aktywowane komórki mikroglejowe działają in situ jako prezentujące antygen komórki immunostymulujące, a zwiększona ekspresja antygenów dawcy MHC klasy I wzmacnia aktywność zabójczą cytotoksycznych limfocytów T biorcy.

Nie ma sensu analizować licznych spekulacyjnych prób wyjaśnienia faktu odrzucenia neuroprzeszczepu reakcją układu odpornościowego biorcy na komórki śródbłonka lub elementy glejowe dawcy, ponieważ nawet czyste linie komórek progenitorowych neuronów podlegają atakowi immunologicznemu. Warto zauważyć, że ekspresja ligandów Fas przez komórki mózgowe, które wiążą receptory apoptozy (cząsteczki Fas) na limfocytach T infiltrujących mózg i indukują ich apoptozę, odgrywa ważną rolę w mechanizmach dłuższego przeżycia przeszczepu w obrębie OUN, co jest typowym mechanizmem ochronnym tkanek autoimmunogennych trans-barierowych.

Jak słusznie zauważają V. Tsymbalyuk i współautorzy (2001), przeszczep zarodkowej tkanki nerwowej charakteryzuje się rozwojem stanu zapalnego z udziałem komórek uwrażliwionych na antygeny mózgowe i aktywowanych komórek, przeciwciał, a także w wyniku lokalnej produkcji cytokin. Ważną rolę odgrywa w tym wcześniejsza uwrażliwienie organizmu na antygeny mózgowe, które występuje podczas rozwoju chorób ośrodkowego układu nerwowego i może być skierowane na antygeny przeszczepu. Dlatego naprawdę długotrwałe przeżycie histoniezgodnych neuroprzeszczepów uzyskuje się jedynie poprzez tłumienie układu odpornościowego cyklosporyną A lub wprowadzenie przeciwciał monoklonalnych do limfocytów CD4+ biorcy.

W związku z tym wiele problemów związanych z neurotransplantacją pozostaje nierozwiązanych, w tym kwestie związane ze zgodnością immunologiczną tkanek, które można rozwiązać wyłącznie po przeprowadzeniu ukierunkowanych badań podstawowych i klinicznych.