Hematopoetyczne komórki macierzyste z krwi pępowinowej

Krew pępowinowa jest dobrym źródłem komórek macierzystych układu krwiotwórczego pod względem potencjału proliferacyjnego i zdolności repopulacyjnych komórek hematopoetycznych. Wielokrotnie wykazano, że w momencie narodzin krew pępowinowa zawiera wystarczająco dużą liczbę słabo zaangażowanych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego. Niektórzy autorzy uważają, że zaletą przeszczepu komórek macierzystych układu krwiotwórczego z krwi pępowinowej jest brak konieczności poszukiwania dawcy zgodnego z antygenami HLA. Ich zdaniem niedojrzałość układu odpornościowego noworodka powoduje zmniejszoną aktywność funkcjonalną komórek immunokompetentnych i w związku z tym mniejszą częstość występowania ciężkiej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi niż w przypadku przeszczepu szpiku kostnego. Jednocześnie wskaźnik przeżywalności przeszczepu komórek krwi pępowinowej nie jest niższy niż komórek szpiku kostnego, nawet w przypadku zastosowania mniejszej liczby komórek HSC podawanych na 1 kg masy ciała pacjenta. Naszym zdaniem jednak kwestie optymalnej liczby przeszczepianych komórek krwi pępowinowej, niezbędnych do skutecznego przyjęcia się ich w organizmie biorcy, ich zgodności immunologicznej, a także szeregu innych aspektów związanych z przeszczepianiem komórek macierzystych krwiotwórczych wymagają poważniejszej analizy.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Pozyskiwanie komórek macierzystych układu krwiotwórczego z krwi pępowinowej

Procedura pozyskiwania komórek macierzystych układu krwiotwórczego z krwi pępowinowej wymaga jej pobrania bezpośrednio po urodzeniu dziecka i oddzielenia od łożyska, gdy łożysko znajduje się w macicy lub poza łonem matki, a także podczas cięcia cesarskiego, ale także poza łonem matki. Wykazano, że jeśli czas od momentu urodzenia do oddzielenia się noworodka od łożyska skróci się do 30 sekund, objętość uzyskanej krwi pępowinowej zwiększa się średnio o 25-40 ml. Jeśli procedura ta zostanie wykonana później, traci się taką samą ilość krwi. Ustalono, że wczesne oddzielenie dziecka od łożyska nie pociąga za sobą żadnych negatywnych konsekwencji dla noworodka.

Rosyjski Instytut Badawczy Hematologii i Transfuzjologii opracował skuteczne i tanie technologie pozyskiwania krwi pępowinowej zarówno podczas porodu naturalnego ((70,2+25,8) ml), jak i cięcia cesarskiego ((73,4+25,1) ml). Zaproponowano metodę oddzielania krwi pępowinowej z wystarczająco wysoką wydajnością komórek jądrzastych i jednojądrowych - odpowiednio (83,1+9,6) i (83,4+14,1)%. Udoskonalono metodę kriokonserwacji krwi pępowinowej, która zapewnia wysoką konserwację komórek jednojądrowych i CFU-GM - odpowiednio (96,8+5,7) i (89,6+22,6)%. Określono skuteczność metody drenażu do pobierania krwi pępowinowej przy użyciu pojemnika Kompoplast-300 (Rosja). Autorzy pobrali krew pępowinową bezpośrednio po urodzeniu dziecka i jego oddzieleniu od łożyska, w warunkach ułożenia łożyska in utero lub ex utero. Przed nakłuciem żyły pępowinowej pępowinę traktowano raz 5% nalewką jodową, a następnie dwukrotnie 70% alkoholem etylowym. Krew spontanicznie spłynęła przez przewody łączące do pojemnika. Procedura pobierania nie trwała dłużej niż 10 minut. Średnia objętość 66 próbek krwi pępowinowej pobranych przez drenaż wynosiła (72+28) ml, a liczba leukocytów w średniej całkowitej objętości próbki wynosiła (1,1+0,6) x 107. Podczas analizy krwi pępowinowej pod kątem jałowości (skażenie bakteryjne, zakażenie wirusem HIV-1, wirusem zapalenia wątroby typu B i C, kiłą i cytomegalowirusem) przeciwciała IgG przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C wykryto tylko w jednej próbce. W innym badaniu łożysko umieszczono powierzchnią płodową w dół na specjalnej ramie bezpośrednio po urodzeniu, pępowinę potraktowano 5% roztworem jodu i 75% alkoholem etylowym. Żyłę pępowinową odwodniono za pomocą igły z systemu transfuzyjnego (G16). Krew spłynęła do pojemnika samoistnie. Średnia objętość krwi pobranej w ten sposób wyniosła (55+25) ml. W pracy G. Koglera i in. (1996) krew pępowinową pobrano metodą zamkniętą i uzyskano duże objętości krwi - średnio (79+26) ml. Autorzy zauważają, że wśród 574 próbek krwi pępowinowej około 7% zawierało mniej niż 40 ml krwi, co nie pozwala na ich wykorzystanie do przeszczepu. K. Isoyama i in. (1996), pobierając krew pępowinową metodą aktywnej eksfuzji za pomocą strzykawek, uzyskali średnio 69,1 ml krwi (objętość krwi pępowinowej wahała się od 15 do 135 ml). Ostatecznie A. Abdel-Mageed PI i in. (1997) zdołali uzyskać średnio 94 ml krwi pępowinowej (od 56 do 143 ml) poprzez cewnikowanie żyły pępowinowej.

Aby zmniejszyć ryzyko zakażenia jatrogennego i skażenia wydzielinami matczynymi, opracowano zamknięty system pobierania krwi oparty na szeroko stosowanym systemie transfuzji firmy Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), zawierającym 62,5 ml CPDA (cytrynian-fosforan-dekstroza z adeniną) jako antykoagulant. Technologia pozyskiwania materiału ma pierwszorzędne znaczenie dla przygotowania wysokiej jakości próbki pod względem objętości, zawartości i czystości zawiesiny komórek. Spośród istniejących metod pobierania krwi pępowinowej, które są konwencjonalnie klasyfikowane jako systemy zamknięte, półotwarte i otwarte, należy dać pierwszeństwo pierwszemu, ponieważ system zamknięty znacznie zmniejsza ryzyko skażenia mikrobiologicznego materiału, a także skażenia zawiesiny komórek komórkami matczynymi.

A. Nagler i in. (1998) przeprowadzili analizę porównawczą efektywności wszystkich trzech systemów pobierania krwi pępowinowej. W pierwszym wariancie procedurę przeprowadzono w systemie zamkniętym, złuszczając krew bezpośrednio do pojemnika. W drugim wariancie krew pępowinową uzyskano poprzez aktywną eksfuzję krwi strzykawką MP1, a następnie przepłukanie żył łożyskowych i równoczesny drenaż krwi do pojemnika (metoda otwarta). W trzecim wariancie krew pobrano w systemie półotwartym, aktywnie ją pobierając strzykawkami i przepłukując tętnicę pępowinową z równoczesnym wylaniem do pojemnika. W pierwszym wariancie autorzy uzyskali krew pępowinową w objętości (76,4+32,1) ml z zawartością leukocytów (10,5+3,6) x 10 ⁶ w 1 ml krwi. W drugim wariancie odpowiednimi wskaźnikami były (174,4+42,8) ml i (8,8+3,4) x 10 ⁶ /ml; w trzecim - (173,7+41,3) ml i (9,3+3,8) x 10 ⁶ /ml. Najczęstsze zakażenie próbek krwi pępowinowej obserwowano przy użyciu systemu otwartego. Stwierdzono bezpośrednią korelację między masą łożyska a objętością pobranej krwi - wraz ze wzrostem masy łożyska zwiększa się ilość pobranej krwi.

Po pobraniu krwi pępowinowej następuje etap separacji - izolacja komórek jednojądrowych i oczyszczenie zawiesiny komórkowej z erytrocytów. W warunkach eksperymentalnych komórki jądrzaste są izolowane przez sedymentację z metylocelulozą podczas lizy erytrocytów chlorkiem amonu. Jednak metylocelulozy nie należy stosować w celach klinicznych, ponieważ straty komórek macierzystych hematopoetycznych na niej sięgają 50-90%. Lizy erytrocytów również prawie nigdy nie wykonuje się w klinice ze względu na duże objętości roztworu roboczego, chociaż odsetek izolacji komórek jądrzastych o fenotypie CD34+, a także komórek progenitorowych o funkcjach CFU-GM i CFU-GEMM w ten sposób jest znacznie wyższy. Donoszono o pojawieniu się nowego sposobu izolowania komórek jednojądrowych w gradiencie gęstości, roztworze o gęstości kupującego (BDS72). Substancja ta ma następujące parametry fizjologiczne: pH - 7,4, osmolalność - 280 mOsm/kg, gęstość - 1,0720 g/ml. Według autorów można za jej pomocą wyizolować do 100% komórek CD34-pozytywnych i usunąć 98% erytrocytów. Jednak BDS72 nie jest jeszcze stosowany w klinice.

W zatwierdzonych metodach izolowania komórek jądrzastych z krwi pępowinowej zwykle stosuje się 10% roztwór hydroksyetyloskrobi lub 3% roztwór żelatyny. Wydajność sedymentacji erytrocytów i izolacji komórek jądrzastych w obu przypadkach jest mniej więcej taka sama. Jednak gdy żelatyna jest stosowana jako środek sedymentacyjny, możliwe jest uzyskanie nieco większej ilości CFU-GM niż w przypadku stosowania hydroksyetyloskrobi. Zakłada się, że różnice w wydajności izolacji CFU-GM wynikają z różnych szybkości sedymentacji poszczególnych frakcji komórek jądrzastych lub zdolności cząsteczek hydroksyetyloskrobi do absorpcji na powierzchni receptorów komórek hematopoetycznych i tym samym blokowania ich wrażliwości na czynniki stymulujące kolonie stosowane w hodowli CFU-GM in vitro. Niemniej jednak oba sedymentatory mogą być odpowiednie do izolowania komórek jądrzastych podczas tworzenia banków krwi pępowinowej na dużą skalę.

Metody separacji krwi pępowinowej i kriokonserwacji zasadniczo nie różnią się od tych stosowanych w pracy z hematopoetycznymi komórkami macierzystymi krwi obwodowej i szpiku kostnego dorosłych dawców. Jednak podczas przygotowywania dużej liczby próbek krwi pępowinowej do jej banków, metody separacji muszą być przede wszystkim tanie. Dlatego niestety obecnie, dla potrzeb klinicznych, stosuje się już sprawdzone rutynowe metody izolowania i kriokonserwacji komórek krwi pępowinowej, a bardziej skuteczne, ale kosztowne metody pozostają udziałem eksperymentatorów.

Ogólnie rzecz biorąc, kryteria oceny liczby komórek hematopoetycznych i wymagania dotyczące badania próbek krwi pępowinowej w celu identyfikacji czynników zakaźnych zostały zatwierdzone. Aby zapewnić bezpieczeństwo przeszczepu komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej, wszystkie próbki krwi muszą zostać zbadane przede wszystkim pod kątem zakażeń przenoszonych drogą krwiopochodną i chorób genetycznych. Wielu autorów zaleca dodatkowe specjalne metody badania krwi pępowinowej w celu diagnozowania chorób genetycznych, takich jak a-talasemia, niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, niedobór deaminazy adenozyny, agammaglobulinemia Brutona, choroby Hurlera i Pontera.

Zgodnie z zaleceniami L. Ticheli i współautorów (1998) każda próbka krwi pępowinowej musi zostać przebadana pod kątem komórek jądrzastych, komórek CD34-pozytywnych i CFU-GM, należy wykonać typowanie HLA, a grupę krwi należy określić zgodnie z układem ABO i jego czynnikiem Rh. Ponadto należy wykonać hodowlę bakteriologiczną, badania serologiczne w kierunku zakażenia HIV i cytomegalowirusem, HBsAg, wirusowego zapalenia wątroby typu C, HTLY-I i HTLV-II (białaczka komórek T u ludzi), kiły i toksoplazmozy. Reakcja łańcuchowa polimerazy w kierunku zakażenia cytomegalowirusem i HIV jest obowiązkowa.

Procedura pobierania krwi pępowinowej musi być przeprowadzona w ścisłej zgodności z zasadami bioetyki medycznej. Przed pobraniem krwi konieczne jest uzyskanie zgody kobiety ciężarnej na jej przeprowadzenie. Wstępna rozmowa z kobietą ciężarną w celu uzyskania świadomej zgody na wszelkie manipulacje, od upuszczenia krwi po wypełnienie dokumentacji, jest przeprowadzana wyłącznie przez pracowników medycznych. W żadnym wypadku nie jest dopuszczalne, aby którykolwiek z tych zabiegów był wykonywany przez personel z wykształceniem biologicznym, chemicznym, farmaceutycznym lub innym niemedycznym, ze względu na naruszenie ustalonych norm bioetyki i praw człowieka. W przypadku pozytywnych wyników testów na nosicielstwo HBsAg, obecności przeciwciał przeciwko patogenom zapalenia wątroby typu C, zakażenia HIV i kiły, krew pępowinowa nie jest pobierana, a próbki już pobranej krwi są odrzucane i niszczone. Należy zaznaczyć, że nosicielstwo utajonych zakażeń u noworodków jest znacznie rzadsze niż u dorosłych, w związku z czym prawdopodobieństwo przeniesienia drogą krwi i rozwoju powikłań infekcyjnych podczas przetoczeń komórek hematopoetycznych z krwi pępowinowej jest znacząco niższe niż w przypadku wykorzystania do przeszczepu szpiku kostnego od dawcy dorosłego.

Ważnym aspektem klinicznego wykorzystania krwi pępowinowej jest ocena przeszczepu, która opiera się na określeniu ilości komórek macierzystych układu krwiotwórczego w próbce krwi pępowinowej i dawek komórek wymaganych do przeszczepu. Obecnie nie opracowano jeszcze standardów optymalnej ilości komórek krwi pępowinowej wymaganych do przeszczepu. Nie ma powszechnie akceptowanego punktu widzenia nawet w odniesieniu do takich rutynowych parametrów, jak liczba komórek CD34-dodatnich i CFU-GM. Niektórzy autorzy oceniają potencjał komórek układu krwiotwórczego, analizując długoterminowe hodowle z określeniem zawartości jednostek tworzących kolonie wspólnych dla granulocytów, erytrocytów, monocytów i megakariocytów - CFU-GEMM.

Jednak w warunkach klinicznych standardowa ocena przeszczepu krwi pępowinowej zwykle obejmuje jedynie określenie liczby komórek jądrzastych lub jednojądrowych.

Przechowywanie komórek macierzystych krwi pępowinowej

Istnieją również pewne problemy w technologii przechowywania komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej. Podczas kriokonserwacji komórek macierzystych krwiotwórczych, aby osiągnąć optymalny tryb zamrażania, konieczne jest maksymalne zmniejszenie objętości krwi pępowinowej, a także wcześniejsze usunięcie erytrocytów, aby uniknąć hemolizy i ryzyka wystąpienia reakcji niezgodności dla antygenów erytrocytów (ABO, Rh). Do tych celów nadają się różne metody izolowania komórek jądrzastych. Na początku lat 90. ubiegłego wieku najpowszechniej stosowaną metodą była izolacja komórek jądrzastych w gradiencie gęstości na bazie Ficollu o gęstości 1,077 g/ml lub Percollu o gęstości 1,080 g/ml. Separacja krwi pępowinowej w gradiencie gęstości pozwala na izolację przeważnie komórek jednojądrowych, ale prowadzi do znacznych strat komórek progenitorowych krwiotwórczych - do 30-50%.

Skuteczność sedymentacji hydroksyetyloskrobi w procesie izolowania komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej jest oceniana różnie. Niektórzy autorzy wskazują na niską jakość separacji tą metodą, podczas gdy inni badacze wręcz przeciwnie, spośród wszystkich możliwych metod preferują izolowanie HSC krwi pępowinowej przy użyciu 6% roztworu hydroksyetyloskrobi. Jednocześnie podkreśla się wysoką skuteczność sedymentacji komórek hematopoetycznych, która według niektórych danych sięga od 84% do 90%.

Zwolennicy innego punktu widzenia uważają, że praktycznie wszystkie metody frakcjonowania wiążą się z dużymi stratami komórek jądrzastych i proponują przeprowadzenie separacji przez wirowanie, dzieląc krew pępowinową na 3 frakcje: erytrocyty, pierścień leukocytarny i osocze. Izolując komórki w ten sposób, autorzy stwierdzili, że zawartość komórek jednojądrowych, wczesnych komórek progenitorowych hematopoezy i komórek z immunofenotypem CD34+ ostatecznie wyniosła odpowiednio 90, 88 i 100% poziomu początkowego. Podobne wartości wzrostu komórek krwi pępowinowej oczyszczonych tą metodą uzyskali również inni badacze: po sedymentacji wyizolowano 92% komórek jądrzastych, 98% komórek jednojądrowych, 96% komórek CD34-dodatnich i 106% jednostek tworzących kolonie.

Pod koniec lat 90. żelatyna była szeroko stosowana jako środek sedymentacyjny. W praktyce klinicznej żelatyna jest stosowana do izolowania komórek macierzystych układu krwiotwórczego z krwi pępowinowej od 1994 r. Przy użyciu 3% roztworu żelatyny wydajność izolacji komórek jądrzastych sięga 88-94%. Zastosowanie żelatyny na szeroką skalę w tworzeniu banku krwi pępowinowej potwierdziło jej zalety w porównaniu z innymi środkami sedymentacyjnymi. Analiza porównawcza wydajności wszystkich powyższych metod izolacji komórek jądrzastych w warunkach ich sekwencyjnego stosowania na każdej z badanych próbek krwi pępowinowej wykazała, że 3% roztwór żelatyny jest optymalnym środkiem sedymentacyjnym pod względem wydajności komórek jednojądrowych o fenotypie CD34+/CD45+, a także pod względem liczby CFU-GM i CFU-GEMM. Znacznie mniej skuteczne okazały się metody wykorzystujące gradient gęstości Ficollu, a także wykorzystanie skrobi hydroksyetylowej i metylocelulozy, przy czym straty komórek hematopoetycznych sięgały 60%.

Wzrost wolumenów przeszczepów komórek macierzystych krwi pępowinowej wiąże się nie tylko z rozwojem metod ich pozyskiwania, ale także przechowywania. Istnieje wiele problemów bezpośrednio związanych z przygotowaniem krwi pępowinowej do długoterminowego przechowywania i wyborem optymalnej technologii kriokonserwacji jej próbek. Wśród nich znajdują się kwestie wykonalności wykonywania procedur separacyjnych, stosowania różnych mediów kriokonserwacyjnych i stosowania metod przygotowania rozmrożonych komórek do przeszczepu. Transport rodzimych próbek krwi pępowinowej odbywa się często z regionów oddalonych od ośrodków hematologicznych. W związku z tym pojawia się problem dopuszczalnych okresów przechowywania krwi pępowinowej od momentu jej pozyskania do rozpoczęcia kriokonserwacji, co ma szczególne znaczenie przy tworzeniu banków krwi pępowinowej.

Badanie aktywności funkcjonalnej komórek hematopoetycznych we krwi pępowinowej po długotrwałym przechowywaniu (do 12 lat) w ciekłym azocie wykazało, że około 95% komórek hematopoetycznych nie traci w tym okresie swojej wysokiej zdolności proliferacyjnej. W pracy S. Yurasova i współpracowników (1997) udowodniono, że przechowywanie krwi pępowinowej w temperaturze pokojowej (22°C) lub w temperaturze 4°C przez 24 i 48 godzin nie zmniejsza znacząco żywotności komórek hematopoetycznych, która wynosi odpowiednio 92 i 88% poziomu początkowego. Jednak jeśli okres przechowywania zostanie wydłużony do trzech dni, liczba żywych komórek jądrzastych we krwi pępowinowej znacznie spada. Jednocześnie inne badania wykazały, że przy przechowywaniu przez 2-3 dni w temperaturze 22 lub 4°C, cierpi przede wszystkim żywotność dojrzałych granulocytów, a nie komórek hematopoetycznych.

Żywotność komórek macierzystych krwi pępowinowej może być negatywnie dotknięta przez składniki systemów pobierania krwi pępowinowej. Analiza wpływu różnych leków przeciwzakrzepowych, których mechanizm działania wynika z wiązania jonów wapnia (ACD, EDTA, XAPD-1) na komórki progenitorowe układu krwiotwórczego w warunkach przechowywania krwi pępowinowej przez 24 do 72 godzin, ujawniła ich negatywny wpływ na żywotność komórek jądrzastych. W związku z tym autorzy zalecają stosowanie PBS (roztworu buforu fosforanowego) z dodatkiem natywnej heparyny bez konserwantu w stężeniu 20 U/ml, co ich zdaniem pozwala na wydłużenie okresu przechowywania niefrakcjonowanej krwi pępowinowej do 72 godzin i zachowuje aktywność funkcjonalną jednostek tworzących kolonie. Jednak badanie bezpieczeństwa CFU-GM i CFU-G wykazało, że czas przechowywania krwi pępowinowej przed kriokonserwacją nie powinien przekraczać dziewięciu godzin. Oczywiste jest, że w tym przypadku należy stosować zasadę, że w przypadku sprzecznych danych należy zastosować minimalny zalecany okres przechowywania krwi pępowinowej i jak najszybciej rozpocząć programowane mrożenie wyizolowanych komórek.

Podczas zamrażania komórek macierzystych krwi pępowinowej, jako krioochronny środek stosuje się zwykle 10% roztwór DMSO. Jednak oprócz wyraźnego efektu krioochronnego, dimetylosulfotlenek w takim stężeniu ma również bezpośredni efekt cytotoksyczny, nawet przy minimalnej ekspozycji na komórki hematopoetyczne krwi pępowinowej. Aby zmniejszyć cytotoksyczny efekt DMSO, stosuje się temperaturę ekspozycji zerowej, zwiększa się szybkość wszystkich manipulacji, a po rozmrożeniu próbek krwi pępowinowej wykonuje się wielokrotne płukania.

Od 1995 roku Instytut Hematologii i Transfuzjologii Akademii Nauk Medycznych Ukrainy rozwija kierunek naukowy ukierunkowany na kompleksowe badanie krwi pępowinowej jako alternatywnego źródła komórek macierzystych układu krwiotwórczego. W szczególności opracowano nowe technologie niskotemperaturowej kriokonserwacji komórek hematopoetycznych niefrakcjonowanej i frakcjonowanej krwi pępowinowej. Jako krioochronny środek stosuje się niskocząsteczkowy medyczny poliwinylopirolidon. Metoda kriokonserwacji niefrakcjonowanej krwi pępowinowej opiera się na oryginalnej technologii wstępnego przygotowania komórek do zamrożenia oraz metodzie specjalnego przetwarzania zawiesiny komórek bezpośrednio przed przeszczepem.

Jednym z najważniejszych czynników wpływających na poziom aktywności funkcjonalnej kriokonserwowanych komórek macierzystych krwi jest szybkość chłodzenia zawiesiny komórek, zwłaszcza w fazie krystalizacji. Podejście programowe do rozwiązania problemu szybkości i czasu zamrażania zapewnia duże możliwości tworzenia prostych i wysoce skutecznych metod kriokonserwacji, bez wypłukiwania zawiesiny komórek z krioprotektorów przed przeszczepem.

Najbardziej niebezpiecznymi etapami dla żywotności komórek podczas ich przygotowywania są etapy bezpośredniego zamrażania i rozmrażania. Podczas zamrażania komórek krwiotwórczych znaczna ich część może zostać zniszczona w momencie przejścia medium międzykomórkowego z fazy ciekłej do stałej – krystalizacji. Aby zmniejszyć odsetek obumierania komórek, stosuje się krioprotektory, których mechanizmy działania i skuteczność krioochronna są dostatecznie opisane w literaturze naukowej.

Obiecującym kierunkiem optymalizacji metod krioprezerwacji szpiku kostnego i komórek krwi pępowinowej jest łączenie w jednym roztworze niskich stężeń kilku krioprotektantów o różnych mechanizmach działania, na przykład DMSO działającego na poziomie wewnątrzkomórkowym i hydroksyetyloskrobiozy lub albuminy, które mają działanie ochronne pozakomórkowe.

Do kriokonserwacji komórek krwi pępowinowej tradycyjnie stosuje się 20% roztwór DMSO, który powoli wlewa się do zawiesiny komórek przy ciągłym mieszaniu mechanicznym w kąpieli lodowej, aż do uzyskania równego stosunku (1:1) objętości krioochronnej i zawiesiny komórek. Końcowe stężenie dimetylosulfotlenku wynosi 10%. Zawiesinę komórek schładza się następnie w zaprogramowanej jednostce kriogenicznej z szybkością GS/min do -40°C, po czym szybkość schładzania zwiększa się do 10°C/min. Po osiągnięciu temperatury -100°C pojemnik z zawiesiną komórek umieszcza się w ciekłym azocie (-196°C). Dzięki tej technice kriokonserwacji, konserwacja funkcjonalnie aktywnych komórek jednojądrowych po rozmrożeniu osiąga 85% pierwotnego poziomu.

Modyfikacje metod krioprezerwacji mają na celu zmniejszenie stężenia DMSO poprzez dodanie hydroksyetyloskrobi (końcowe stężenia dimetylosulfotlenku i hydroksyetyloskrobi wynoszą odpowiednio 5 i 6%). Wysoką skuteczność takiego połączenia krioprotektorów obserwuje się przy zamrażaniu zawiesiny komórek mieloidalnych, przy czym nie ma mniejszej cytoprotekcji niż przy użyciu tylko 10% roztworu dimetylosulfotlenku. Liczba żywych komórek jądrzastych osiągnęła 96,7% poziomu początkowego, a ich aktywność funkcjonalna, szacowana liczbą CFU-GM, wyniosła 81,8%.

Przy stosowaniu roztworu dimetylosulfotlenku w stężeniach od 5 do 10% w połączeniu z 4% hydroksyetyloskrobią (stężenie końcowe) stwierdzono, że bezpieczeństwo komórek CD34-pozytywnych w takich zakresach dimetylosulfotlenku pozostaje praktycznie niezmienione. Jednocześnie przy zmniejszeniu stężenia dimetylosulfotlenku z 5 do 2,5% obserwuje się masową śmierć komórek krwi pępowinowej - liczba żywych jednostek komórkowych zmniejsza się z 85,4 do 12,2%. Inni autorzy również doszli do wniosku, że to właśnie 5 i 10% roztwory dimetylosulfotlenku (w wersji autora - w połączeniu z autologiczną surowicą) zapewniają cytoprotekcję z maksymalną skutecznością podczas kriokonserwacji komórek macierzystych krwi pępowinowej. Ponadto, wysokie zachowanie kolejno zamrażanych i rozmrażanych komórek odnotowano w przypadku połączenia 5 lub 10% dimetylosulfotlenku z 4% roztworem hydroksyetyloskrobi, zwłaszcza przy kontrolowanej szybkości chłodzenia GS/min. W innym badaniu zastosowano roztwór krioochronny składający się z trzech składników - DMSO, oczyszczonej albuminy ludzkiej i pożywki RPMI w stosunku 1:4:5, który dodano do zawiesiny komórek w równym stosunku objętościowym (końcowe stężenie dimetylosulfotlenku wynosiło 5%). Po rozmrożeniu w łaźni wodnej w temperaturze +4 GS, zachowanie CFU-GM przekroczyło 94%.

Niektórzy autorzy sugerują wykorzystanie niefrakcjonowanej krwi pępowinowej do kriokonserwacji, ponieważ znaczna ilość komórek hematopoetycznych jest tracona podczas procesu usuwania czerwonych krwinek. W tym wariancie 10% roztwór dimetylosulfotlenku jest używany do ochrony komórek jednojądrowych przed szkodliwymi skutkami kriokrystalizacji. Zamrażanie odbywa się przy stałej szybkości chłodzenia GS/min do -80°C, po czym zawiesinę komórek krwi pępowinowej obniża się do ciekłego azotu. Ta metoda zamrażania powoduje częściową lizę czerwonych krwinek, więc próbki krwi nie wymagają frakcjonowania. Po rozmrożeniu zawiesinę komórek wypłukuje się z wolnej hemoglobiny i dimetylosulfotlenku w roztworze albuminy ludzkiej lub w autologicznej surowicy krwi pacjenta i wykorzystuje do przeszczepu.

Zachowanie komórek macierzystych układu krwiotwórczego po rozmrożeniu niefrakcjonowanej krwi pępowinowej jest rzeczywiście wyższe niż w przypadku frakcjonowanej krwi pępowinowej, jednak ze względu na kriostabilność niektórych erytrocytów mogą wystąpić poważne problemy po transfuzji z powodu transfuzji erytrocytów niezgodnych z układem ABO. Ponadto objętość przechowywanej niefrakcjonowanej krwi znacznie wzrasta. Z klinicznego punktu widzenia kriokonserwacja wcześniej wyizolowanych i oczyszczonych z innych frakcji komórek komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej jest nadal preferowana.

W szczególności opracowano metodę kriokonserwacji frakcjonowanych komórek krwi pępowinowej, umożliwiającą pobranie erytrocytów na etapie przygotowania do zamrożenia, w której jako część roztworu osoczozastępczego „Stabizol” stosuje się 6% roztwór hydroksyetyloskrobi. Po rozmrożeniu uzyskana w ten sposób zawiesina komórek jest gotowa do wykorzystania klinicznego bez dodatkowych manipulacji.

Tak więc obecnie istnieje wiele dość skutecznych metod kriokonserwacji krwi pępowinowej. Ich zasadnicza różnica polega na tym, że próbki krwi są zamrażane w postaci niefrakcjonowanej lub poddawane rozdzieleniu na frakcje komórkowe na etapie przygotowania i przygotowywane są komórki jądrzaste bez domieszki erytrocytów.

Transplantacja komórek macierzystych krwi pępowinowej

Pod koniec lat 80. i na początku lat 90. ustalono, że krew pępowinowa, która zapewnia płódowi podtrzymanie życia w czasie ciąży, ma wysoką zawartość komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Względna prostota pozyskiwania komórek krwi pępowinowej i brak oczywistych problemów etycznych przyczyniły się do wykorzystania komórek macierzystych krwi pępowinowej w medycynie praktycznej. Pierwszy udany przeszczep krwi pępowinowej u dziecka z niedokrwistością Fanconiego posłużył jako punkt wyjścia do zwiększenia liczby przeszczepów komórek macierzystych krwi pępowinowej i stworzenia systemu ich bankowania. W światowym systemie banków krwi pępowinowej największym jest New York Placental Blood Center, które znajduje się w bilansie amerykańskiego Narodowego Instytutu Zdrowia. Liczba przechowywanych próbek krwi pępowinowej w tym banku zbliża się do 20 000. Liczba biorców (głównie dzieci), u których przeprowadzono udany przeszczep, również rośnie. Według Departamentu Zdrowia USA okres życia bez nawrotów choroby u biorców przeszczepu krwi pępowinowej przekracza już 10 lat.

Nie jest to zaskakujące, ponieważ liczne badania nad potencjałem hematopoetycznym krwi pępowinowej wykazały, że pod względem ilości i jakości najwcześniejszych komórek macierzystych nie tylko nie ustępuje ona szpikowi kostnemu osoby dorosłej, ale pod pewnymi względami ją przewyższa. Wyższy potencjał proliferacyjny komórek macierzystych krwi pępowinowej wynika z ontogenetycznych cech sygnalizacji komórkowej, obecności receptorów specyficznych czynników wzrostu na komórkach macierzystych krwi pępowinowej, zdolności komórek krwi pępowinowej do autokrynnej produkcji czynników wzrostu oraz dużego rozmiaru i długości telomerów.

Zatem cechy genomiczne i fenotypowe komórek macierzystych układu krwiotwórczego krwi pępowinowej z góry decydują o wysokiej jakości wszczepienia przeszczepu i dużym potencjale przywrócenia hematopoezy dawcy w organizmie biorcy.

Korzyści z komórek macierzystych układu krwiotwórczego pochodzących z krwi pępowinowej

Wśród rzeczywistych zalet wykorzystania komórek macierzystych krwi pępowinowej do przeszczepu w porównaniu z innymi źródłami komórek hematopoetycznych warto zwrócić uwagę na praktycznie zerowe ryzyko dla zdrowia dawcy (jeśli nie weźmiemy pod uwagę łożyska jako takiego) i brak konieczności znieczulenia ogólnego. Wykorzystanie krwi pępowinowej rozszerza możliwości przeszczepu komórek ze względu na częściowo zgodne przeszczepy HLA (niezgodność od jednego do trzech antygenów). Opracowano metodę długoterminowego przechowywania komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej w stanie zamrożonym, co zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania rzadkich typów HLA i skraca czas poszukiwania zgodnego z HLA przeszczepu do przeszczepu allogenicznego. Jednocześnie ryzyko rozwoju niektórych utajonych infekcji przenoszonych drogą zakaźną jest znacznie zmniejszone. Ponadto, dzięki możliwości wykorzystania komórek krwi pępowinowej do przeszczepu autologicznego, powstaje niedroga forma biologicznego ubezpieczenia na życie.

Jednak ze względu na niewielką objętość krwi, jaką można pobrać z łożyska (średnio nie więcej niż 100 ml), na pierwszy plan wysuwa się problem uzyskania jak największej ilości krwi z żyły pępowinowej, przy jednoczesnym ścisłym przestrzeganiu warunku minimalnego ryzyka zanieczyszczenia bakteryjnego pobranych próbek krwi pępowinowej.

Pierwotne komórki hematopoetyczne krwi pępowinowej są zazwyczaj identyfikowane na podstawie obecności glikofosfoproteiny CD34 na ich powierzchni, a także na podstawie ich właściwości funkcjonalnych poprzez badanie klonogenności lub tworzenia kolonii in vitro. Analiza porównawcza wykazała, że w krwi pępowinowej i szpiku kostnym maksymalna zawartość komórek CD34-dodatnich we frakcji jednojądrowej wynosi odpowiednio 1,6 i 5,0%, maksymalny poziom jednostek tworzących kolonie w subpopulacji komórek CD34+ wynosi 80 i 25%, całkowita wydajność klonowania komórek CD34+ wynosi 88 i 58%, maksymalna zawartość komórek tworzących kolonie o wysokim potencjale proliferacji (HPP-CFC w populacji CD34+) wynosi 50 i 6,5%. Należy dodać, że wydajność klonowania komórek CD34+CD38 i zdolność do reagowania na stymulację cytokinami są również wyższe w hematopoetycznych komórkach macierzystych krwi pępowinowej.

Połączenie antygenów fenotypowych Thy-1, CD34 i CD45RA potwierdza wysoki potencjał proliferacyjny komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej, a ekspresja tych trzech antygenów na powierzchni komórek krwi pępowinowej wskazuje na ich przynależność do komórek macierzystych. Ponadto stwierdzono, że krew pępowinowa zawiera komórki o fenotypie CD34+, które nie mają markerów różnicowania liniowego. Poziom subpopulacji komórkowych o profilu fenotypowym CD34+/Lin we krwi pępowinowej stanowi około 1% całkowitej liczby komórek CD34-dodatnich. Komórki progenitorowe krwi pępowinowej dają początek zarówno linii komórek limfoidalnych, jak i pluripotentnej serii mieloidalnej różnicowania liniowego komórek, co również wskazuje na ich przynależność do komórek macierzystych.

Jak już wspomniano, istotne różnice między szpikiem kostnym a krwią pępowinową dotyczą ilości komórek hematopoetycznych użytych do przeszczepu, uzyskanych podczas jednej procedury pobrania. Jeśli podczas przeszczepu szpiku kostnego utrata masy komórkowej podczas separacji, kriokonserwacji, rozmrażania i badania jest akceptowalna w granicach 40-50%, to w przypadku krwi pępowinowej takie straty komórek są bardzo znaczące, ponieważ jeśli zostanie użyta niewystarczająca ilość komórek HSC, przeszczep może okazać się nieskuteczny. Według G. Koglera i in. (1998), w przypadku przeszczepu komórek przy masie ciała biorcy 10 kg, wszystkie próbki krwi pępowinowej mogą być potencjalnymi przeszczepami (łączna liczba pobranych próbek krwi pępowinowej wynosi 2098), przy masie ciała 35 kg - 67%, a tylko 25% próbek może zapewnić skuteczną transplantację u pacjentów o masie ciała 50-70 kg. Ta sytuacja kliniczna wskazuje na potrzebę optymalizacji i poprawy efektywności istniejących metod pobierania, reprodukcji i przechowywania komórek krwi pępowinowej. W związku z tym w literaturze przedmiotu szeroko dyskutowane są obecnie zagadnienia standaryzacji metod pobierania, badania, separacji i kriokonserwacji krwi pępowinowej w celu tworzenia banków krwi, jej wykorzystania w klinice, a także określane są warunki i zasady przechowywania komórek macierzystych krwi pępowinowej.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Wykorzystanie komórek macierzystych krwi pępowinowej w medycynie

^{Zwykle z krwi pępowinowej można wyizolować do 10 6} komórek macierzystych hematopoezy, rzadko więcej. W związku z tym pytanie, czy taka ilość komórek hematopoezy z krwi pępowinowej jest wystarczająca do przywrócenia hematopoezy u dorosłego biorcy, pozostaje otwarte do dziś. Opinie w tej sprawie są podzielone. Niektórzy badacze uważają, że taka ilość jest w zupełności wystarczająca do przeszczepu u dzieci, ale zbyt mała do przeszczepu u osoby dorosłej, dla której optymalną ilością jest wprowadzenie (7-10) x 10 ⁶ komórek CD34-dodatnich na 1 kg masy ciała - średnio 7 x 10 ⁸ na przeszczep. Z tych obliczeń wynika, że jedna próbka krwi pępowinowej zawiera 700 razy mniej komórek macierzystych hematopoezy niż jest to wymagane do jednego przeszczepu u pacjenta dorosłego. Jednakże taka ilościowa ocena przeprowadzana jest przez analogię do liczby przetoczonych komórek szpiku kostnego i w ogóle nie uwzględnia cech ontogenetycznych hematopoezy.

W szczególności pomija się fakt wyższego potencjału proliferacyjnego komórek macierzystych krwi pępowinowej w porównaniu z komórkami progenitorowymi krwi szpiku kostnego. Wyniki badań potencjału tworzenia kolonii in vitro sugerują, że jedna dawka krwi pępowinowej jest w stanie zapewnić odtworzenie hematopoezy u dorosłego biorcy. Z drugiej strony nie należy zapominać, że liczba komórek macierzystych krwi pępowinowej zmniejsza się nawet w trakcie rozwoju embrionalnego: zawartość komórek CD34-dodatnich we krwi pępowinowej zmniejsza się liniowo 5-krotnie w okresie od 20 tygodnia (krew do badania została pobrana w trakcie przedwczesnego zakończenia ciąży) do 40 tygodnia ciąży (okres porodu fizjologicznego), czemu towarzyszy równoległa, trwale zwiększająca się ekspresja liniowych markerów cytodyferencjacji.

Z powodu braku znormalizowanego podejścia do ilościowego oznaczania komórek progenitorowych w próbkach krwi pępowinowej, trwają debaty na temat optymalnej dawki komórek macierzystych krwi pępowinowej. Niektórzy badacze uważają, że liczba komórek jądrzastych i komórek jednojądrowych przeliczona na masę ciała biorcy, czyli ich dawka, może być wykorzystana jako kryterium doboru próbek krwi pępowinowej. Niektórzy autorzy uważają, że minimalny próg ilościowy komórek CD34+ nawet w przypadku autotransplantacji komórek macierzystych krwi wynosi 2 x 10 ⁶ /kg. Jednocześnie zwiększenie dawki komórek krwiotwórczych do 5 x 10 ⁶ komórek/kg (tylko 2,5-krotnie) zapewnia już korzystniejszy przebieg wczesnego okresu po przeszczepie, zmniejsza częstość występowania powikłań infekcyjnych i skraca czas trwania profilaktycznej terapii antybiotykowej.

Według E. Gluckmana i in. (1998) w onkohematologii warunkiem udanego przeszczepu komórek krwi pępowinowej jest wprowadzenie co najmniej 3,7 x 10 ⁷ komórek jądrzastych na 1 kg masy ciała biorcy. Gdy dawka komórek macierzystych układu krwiotwórczego zostanie zmniejszona do 1 x 10 ⁷ lub mniej komórek jądrzastych na 1 kg masy ciała pacjenta, ryzyko niepowodzenia przeszczepu i nawrotu raka krwi gwałtownie wzrasta. Należy pamiętać, że minimalna liczba komórek progenitorowych niezbędna do szybkiego przywrócenia hematopoezy po allotransplantacji komórek macierzystych krwi (HSC) jest nadal nieznana. Teoretycznie można to osiągnąć przy użyciu jednej komórki, ale w praktyce klinicznej przeszczepu szpiku kostnego szybkie i stabilne wszczepienie jest gwarantowane przez transfuzję co najmniej (1-3) x 10 ⁸ komórek jądrzastych na 1 kg masy ciała pacjenta.

Ostatnie szczegółowe badanie mające na celu określenie optymalnej liczby komórek macierzystych krwi (HSC) w onkohematologii obejmowało obserwację pacjentów w trzech grupach, przydzielonych w zależności od zawartości komórek CD34-dodatnich w przeszczepionym materiale. Pacjentom z pierwszej grupy podano (3-5) x 10 ⁶ komórek/kg. Dawka komórek HSC u pacjentów z drugiej grupy wynosiła (5-10) x 10 ⁶ komórek/kg, a pacjentom z trzeciej grupy przeszczepiono ponad 10 x 10 ⁶ komórek CD34+/kg. Najlepsze wyniki zaobserwowano w grupie biorców, którzy otrzymali przeszczep z liczbą komórek CD34-dodatnich równą (3-5) x 10 ⁶ /kg. Wraz ze wzrostem dawki przeszczepionych komórek powyżej 5 x 10 ⁶ /kg nie ujawniono statystycznie istotnych korzyści. W tym przypadku bardzo wysoka zawartość HSC w przeszczepie (> 10 x 10 ⁶ /kg) wiąże się z reinfuzją znacznej liczby resztkowych komórek nowotworowych, co prowadzi do nawrotu choroby. Nie ustalono bezpośredniego związku między liczbą przeszczepionych allogenicznych komórek progenitorowych a rozwojem reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi.

Zgromadzone na świecie doświadczenia w zakresie przeszczepów krwi pępowinowej potwierdzają ich wysoki potencjał repopulacyjny. Szybkość wszczepiania się przeszczepu krwi pępowinowej koreluje z liczbą wprowadzonych komórek jądrzastych. Najlepsze wyniki obserwuje się przy przeszczepie 3 x 10 ⁷ /kg, podczas gdy w przypadku szpiku kostnego dawka ta wynosi 2 x 10 ⁸ /kg. Według danych ośrodków koordynujących, pod koniec 2000 r. na świecie wykonano 1200 przeszczepów komórek krwi pępowinowej, głównie od dawców spokrewnionych (83%). Oczywiste jest, że krew pępowinowa powinna być rozważana jako alternatywa dla szpiku kostnego w przypadku przeszczepu u pacjentów z hemoblastozami.

Jednocześnie noworodkowy charakter źródła tkanki krwiotwórczej w pępowinie budzi optymizm ze względu na obecność cech funkcjonalnych jej HSC. Jednocześnie tylko doświadczenie kliniczne może odpowiedzieć na pytanie o wystarczalność jednej próbki krwi pępowinowej do przywrócenia hematopoezy u dorosłego biorcy z aplazją hematopoetyczną. Przeszczep komórek krwi pępowinowej jest stosowany w programach leczenia wielu chorób nowotworowych i nienowotworowych: białaczki i zespoły mielodysplastyczne, chłoniaki nieziarnicze i neuroblastoma, niedokrwistość aplastyczna, wrodzona niedokrwistość Fanconiego i Diamonda-Blackfana, niedobór adhezji leukocytów, zespół Barra, choroba Gunthera, zespół Hurlera, talasemia.

Immunologiczne aspekty przeszczepu komórek hematopoetycznych z krwi pępowinowej zasługują na szczególną uwagę i osobne badanie. Wykazano, że w przypadku przeszczepu komórek macierzystych z krwi pępowinowej od dawców z niepełną zgodnością HLA wyniki przeszczepu są dość zadowalające, co według autorów wskazuje na niższą immunoreaktywność komórek krwi pępowinowej niż szpiku kostnego.

Szczegółowe badanie składu komórkowego krwi pępowinowej ujawniło cechy zarówno spektrum fenotypowego komórek efektorowych układu odpornościowego, jak i ich aktywności funkcjonalnej, co pozwoliło uznać krew pępowinową za źródło komórek macierzystych krwi (HSC) o stosunkowo niskim ryzyku wystąpienia reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi”. Wśród oznak niedojrzałości funkcjonalnej komórek immunokompetentnych krwi pępowinowej należy zwrócić uwagę na brak równowagi w produkcji cytokin i zmniejszenie wrażliwości na regulację odpowiedzi immunologicznej przez cytokiny. Wynikające z tego zahamowanie aktywności limfocytów cytotoksycznych jest uważane za czynnik przyczyniający się do powstawania tolerancji immunologicznej na przeszczepioną tkankę hematopoetyczną. W populacji limfocytów krwi pępowinowej, w przeciwieństwie do krwi obwodowej i szpiku kostnego dorosłych dawców, dominują nieaktywne, niedojrzałe limfocyty i komórki supresorowe. Wskazuje to na zmniejszoną gotowość limfocytów T krwi pępowinowej do odpowiedzi immunologicznej. Ważną cechą populacji monocytów krwi pępowinowej jest niska zawartość w pełni funkcjonalnych i aktywnych komórek prezentujących antygen.

Z jednej strony, niska dojrzałość komórek efektorowych układu odpornościowego we krwi pępowinowej rozszerza wskazania do jej stosowania w klinice, ponieważ cechy te zapewniają zmniejszenie intensywności konfliktu immunologicznego między komórkami dawcy i biorcy. Ale z drugiej strony wiadomo o istnieniu korelacji między stopniem rozwoju reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi” a efektem przeciwnowotworowym przeszczepu, czyli rozwojem efektu „przeszczep przeciwko białaczce”. W związku z tym przeprowadzono badanie nad cytotoksycznością przeciwnowotworową komórek krwi pępowinowej. Uzyskane wyniki wskazują, że pomimo rzeczywiście osłabionej odpowiedzi immunokompetentnych komórek krwi pępowinowej na stymulację antygenową, limfocyty, które są przede wszystkim aktywowane, są komórkami NK i komórkami podobnymi do NK, które biorą czynny udział w mechanizmach realizacji cytotoksyczności przeciwnowotworowej. Ponadto w krwi pępowinowej stwierdzono subpopulacje limfocytów o fenotypie CD16+CD56+ i CD16"TCRa/p+. Przypuszcza się, że komórki te w swojej aktywowanej formie realizują reakcję „przeszczep przeciwko białaczce”.

W Instytucie Onkologii Akademii Nauk Medycznych Ukrainy kriokonserwowane komórki hematopoetyczne krwi pępowinowej podawano pacjentom onkologicznym z utrzymującą się hipoplazją hematopoetyczną spowodowaną chemio- i radioterapią. U takich pacjentów przeszczepienie komórek macierzystych krwi pępowinowej dość skutecznie przywracało obniżoną hematopoezę, o czym świadczył stały wzrost zawartości dojrzałych elementów uformowanych we krwi obwodowej, a także wzrost wskaźników charakteryzujących stan odporności komórkowej i humoralnej. Stabilność efektu repopulacyjnego po przeszczepieniu komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej pozwala na kontynuowanie radioterapii i chemioterapii bez przerywania przebiegu leczenia. Istnieją informacje o wyższej skuteczności allotransplantacji komórek macierzystych krwi pępowinowej pacjentom onkohematologicznym: roczne ryzyko nawrotu choroby nowotworowej przy ich zastosowaniu wynosiło 25% w porównaniu z 40% u pacjentów z przeszczepionym allogenicznym szpikiem kostnym.

Mechanizm działania kriokonserwowanych komórek macierzystych krwi pępowinowej należy rozpatrywać jako wynik humoralnej stymulacji hematopoezy biorcy spowodowanej unikalną zdolnością komórek noworodkowych do autokrynnej produkcji hematopoetycznych czynników wzrostu, a także jako konsekwencję czasowego wszczepienia komórek dawcy (o czym świadczy wiarygodny wzrost zawartości hemoglobiny płodowej we krwi obwodowej biorców w 7-15 dniu po transfuzji w porównaniu z danymi początkowymi). Brak reakcji potransfuzyjnych u biorców krwi pępowinowej jest wynikiem względnej tolerancji jej immunokompetentnych komórek, a także kryterium pewności co do biologicznej adekwatności kriokonserwowanego materiału.

Komórki progenitorowe limfocytów T krwi pępowinowej są zdolne do aktywacji pod wpływem stymulacji egzogenną cytokiną, co jest wykorzystywane do opracowywania nowych metod ex vivo i in vivo do indukowania cytotoksyczności przeciwnowotworowej przeszczepionych elementów limfoidalnych w celu późniejszej immunoterapii. Ponadto „niedojrzałość” genomu immunokompetentnych komórek krwi pępowinowej pozwala na ich wykorzystanie do zwiększenia aktywności przeciwnowotworowej za pomocą metod modelowania molekularnego.

Obecnie krew pępowinowa znalazła szerokie zastosowanie przede wszystkim w hematologii dziecięcej. U dzieci z ostrą białaczką allotransplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej, w porównaniu z allotransplantacją szpiku kostnego, znacznie zmniejsza częstość występowania choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Jednak wiąże się to z dłuższym okresem neutro- i trombocytopenii oraz, niestety, wyższą śmiertelnością 100 dni po przeszczepie. Dłuższy okres odzyskiwania poziomu granulocytów i płytek krwi we krwi obwodowej może być spowodowany niewystarczającym różnicowaniem poszczególnych subpopulacji komórek krwi pępowinowej CD34-dodatnich, o czym świadczy niski poziom absorpcji radioaktywnej rodaminy i niska ekspresja antygenów CD38 na ich powierzchni.

Jednocześnie przeszczepienie komórek macierzystych krwi pępowinowej pacjentom dorosłym, wykonane z powodu braku zarówno zgodnego niespokrewnionego dawcy szpiku kostnego, jak i możliwości mobilizacji autologicznych komórek macierzystych krwi (HSC), wykazało wysoki roczny wskaźnik przeżycia bez nawrotu w grupie pacjentów poniżej 30. roku życia (73%). Rozszerzenie przedziału wiekowego biorców (18-46 lat) doprowadziło do spadku wskaźnika przeżycia do 53%.

Analiza ilościowa komórek o fenotypie CD34+ w szpiku kostnym i krwi pępowinowej wykazała ich wyższą (3,5-krotnie) zawartość w szpiku kostnym, ale znaczną przewagę komórek o profilu fenotypowym CD34+HLA-DR odnotowano we krwi pępowinowej. Wiadomo, że komórki krwi o markerach immunologicznych CD34+HLA-DR proliferują aktywniej niż komórki o immunofenotypie CD34+HLA-DR+, co zostało potwierdzone w badaniach eksperymentalnych wzrostu długotrwałej hodowli komórek hematopoetycznych in vitro. Pierwotne prekursory komórek o fenotypie CD34+CD38 są zawarte zarówno we krwi pępowinowej, jak i w szpiku kostnym, ale komórki krwi pępowinowej z zestawem markerów CD34+CD38 mają wyższą aktywność klonogenną niż komórki hematopoetyczne o tym samym fenotypie izolowane ze szpiku kostnego dorosłych dawców. Ponadto komórki krwi pępowinowej o immunofenotypie CD34+CD38 proliferują szybciej w odpowiedzi na stymulację cytokinami (IL-3, IL-6, G-CSF) i wytwarzają 7 razy więcej kolonii w długoterminowych hodowlach niż komórki szpiku kostnego.

Banki komórek macierzystych krwi pępowinowej

Do prawidłowego rozwoju nowej dziedziny medycyny praktycznej - przeszczepów komórek macierzystych krwi pępowinowej, a także do realizacji przeszczepów komórek macierzystych hematopoezy szpiku kostnego, konieczne jest posiadanie rozległej sieci banków krwi, które powstały już w USA i Europie. Krajowe sieci banków krwi pępowinowej są zjednoczone przez Netcord Bank Association. Celowość utworzenia międzynarodowego stowarzyszenia banków krwi pępowinowej jest uwarunkowana faktem, że do wykonania niespokrewnionych przeszczepów potrzebna jest duża liczba typowanych próbek krwi pępowinowej, co pozwala na wybór dawcy identycznego z HLA. Tylko utworzenie systemu banków z przechowywaniem próbek krwi różnych typów HLA może naprawdę rozwiązać problem znalezienia niezbędnego dawcy. Organizacja takiego systemu banków krwi pępowinowej wymaga wstępnego opracowania norm etycznych i prawnych, które są obecnie omawiane na szczeblu międzynarodowym.

Aby utworzyć banki krwi pępowinowej na Ukrainie konieczne jest opracowanie całego szeregu przepisów i dokumentów.

Przede wszystkim są to kwestie standaryzacji metod pobierania, frakcjonowania i mrożenia krwi pępowinowej. Konieczne jest uregulowanie zasad pobierania krwi pępowinowej w szpitalach położniczych zgodnie z wymogami etyki lekarskiej, określenie minimalnej objętości krwi pępowinowej zapewniającej powodzenie przeszczepu. Konieczne jest porównanie i standaryzacja różnych kryteriów oceny jakości i ilości komórek macierzystych układu krwiotwórczego, a także metod typizacji HLA i metod diagnostycznych chorób genetycznych i zakaźnych, które mogą być przenoszone podczas infuzji komórek krwi pępowinowej, aby ustalić wspólne kryteria doboru zdrowych dawców. Warto również omówić kwestie tworzenia odrębnych pomieszczeń do przechowywania surowicy, komórek i DNA uzyskanych z krwi pępowinowej.

Konieczne jest zorganizowanie sieci komputerowej danych krwi pępowinowej w celu połączenia z rejestrami dawców szpiku kostnego. W celu dalszego rozwoju transplantologii komórek konieczne jest opracowanie specjalnych protokołów porównywania wyników przeszczepu krwi pępowinowej i szpiku kostnego od krewnych o identycznym HLA i dawców niespokrewnionych. Standaryzacja dokumentacji, w tym świadomej zgody rodziców, a także powiadomienia matki lub krewnych o chorobach genetycznych i/lub zakaźnych wykrytych u dziecka, może pomóc rozwiązać problemy etyczne i prawne klinicznego wykorzystania komórek krwi pępowinowej.

Podstawowym warunkiem rozwoju transplantologii komórkowej na Ukrainie będzie przyjęcie Narodowego Programu Donacji Komórek Macierzystych i rozwój współpracy międzynarodowej z innymi krajami za pośrednictwem Światowego Stowarzyszenia Dawców Szpiku (WMDA), Narodowego Programu Dawców Szpiku USA (NMDP) i innych rejestrów.

Podsumowując wciąż krótką historię rozwoju przeszczepu komórek macierzystych krwi pępowinowej, zauważamy, że pierwsze założenia o możliwości wykorzystania krwi pępowinowej w klinice, wyrażone jeszcze na początku lat 70., zostały potwierdzone w latach 80. wynikami badań eksperymentalnych na zwierzętach, a w 1988 r. przeprowadzono pierwszą na świecie transplantację komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej człowiekowi, po czym zaczęto tworzyć globalną sieć banków krwi pępowinowej. W ciągu 10 lat liczba pacjentów z przeszczepionymi komórkami hematopoetycznymi krwi pępowinowej zbliżyła się do 800. Byli wśród nich pacjenci z różnymi chorobami o charakterze nowotworowym (białaczka, chłoniak, guzy lite) i nienowotworowym (wrodzone niedobory odporności, anemia, choroby związane z zaburzeniami metabolicznymi).

Zawartość wczesnych i zaangażowanych prekursorów komórek we krwi pępowinowej jest wyższa niż we krwi obwodowej osoby dorosłej. Pod względem liczby jednostek tworzących kolonie granulocytów i makrofagów oraz ich potencjału proliferacyjnego krew pępowinowa znacznie przewyższa krew obwodową osoby dorosłej nawet po wprowadzeniu czynników wzrostu. W długoterminowych hodowlach komórkowych in vitro odnotowano większą aktywność proliferacyjną i żywotność komórek krwi pępowinowej niż komórek szpiku kostnego. Krytycznymi momentami w przeszczepianiu komórek macierzystych z krwi pępowinowej są liczba i potencjał hematopoetyczny komórek jądrzastych, obecność zakażenia cytomegalowirusem, zgodność HLA dawcy i biorcy, masa ciała i wiek pacjenta.

Jednak przeszczep komórek macierzystych z krwi pępowinowej należy rozważyć jako alternatywę dla przeszczepu szpiku kostnego w leczeniu ciężkich chorób krwi, przede wszystkim u dzieci. Problemy kliniczne przeszczepu komórek z krwi pępowinowej są stopniowo rozwiązywane - istnieją już dość skuteczne metody pobierania, oddzielania i kriokonserwowania komórek krwi pępowinowej, zapewniane są warunki do tworzenia banków krwi pępowinowej, a metody testowania komórek jądrzastych są udoskonalane. 3% roztwór żelatyny i 6% roztwór hydroksyetyloskrobi należy uznać za optymalne do separacji podczas pozyskiwania na dużą skalę hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej podczas tworzenia banków.

P. Perekhrestenko i współautorzy (2001) słusznie zauważają, że przeszczep komórek macierzystych z krwi pępowinowej powinien zająć należne mu miejsce w kompleksie środków terapeutycznych mających na celu przezwyciężenie depresji hematopoetycznych o różnej genezie, ponieważ komórki macierzyste z krwi pępowinowej mają szereg istotnych zalet, wśród których najważniejsze to względna prostota ich pozyskiwania, brak ryzyka dla dawcy, niskie zanieczyszczenie komórek noworodkowych wirusami i stosunkowo niski koszt przeszczepu. Niektórzy autorzy wskazują, że przeszczep komórek z krwi pępowinowej rzadziej wiąże się z powikłaniami związanymi z reakcją przeszczep przeciwko gospodarzowi niż przeszczep komórek szpiku kostnego, co ich zdaniem wynika ze słabej ekspresji antygenów HLA-DR na komórkach krwi pępowinowej i ich niedojrzałości. Jednakże główną populację komórek jądrzastych we krwi pępowinowej stanowią limfocyty T (komórki CD3-dodatnie), których zawartość wynosi ok. 50%, czyli o 20% mniej niż we krwi obwodowej osoby dorosłej, lecz różnice fenotypowe w subpopulacjach limfocytów T z tych źródeł są nieistotne statystycznie.

Wśród czynników bezpośrednio wpływających na przeżywalność w przeszczepie komórek macierzystych krwi pępowinowej warto zwrócić uwagę na wiek pacjentów (najlepsze wyniki obserwuje się u biorców w wieku od jednego do pięciu lat), wczesną diagnozę choroby i postać białaczki (skuteczność jest znacznie wyższa w przypadku ostrej białaczki). Duże znaczenie ma dawka jądrzastych komórek krwi pępowinowej, a także ich zgodność HLA z biorcą. Nieprzypadkowo analiza skuteczności klinicznej przeszczepu komórek macierzystych krwi pępowinowej w onkohematologii pokazuje najlepsze wyniki leczenia przy zastosowaniu przeszczepów spokrewnionych: roczne przeżycie bez nawrotu choroby w tym przypadku sięga 63%, podczas gdy przy przeszczepie niespokrewnionym - tylko 29%.

Tak więc obecność dużej liczby komórek macierzystych we krwi pępowinowej i wysoka zdolność repopulacji komórek macierzystych hematopoezy noworodków pozwalają na ich wykorzystanie do przeszczepu allogenicznego u pacjentów onkohematologicznych. Należy jednak zauważyć, że rekapitulacja hematopoezy po przeszczepie komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej jest „rozciągnięta w czasie”: przywrócenie zawartości neutrofili we krwi obwodowej obserwuje się zwykle pod koniec 6. tygodnia, a trombocytopenia zwykle zanika po 6 miesiącach. Ponadto niedojrzałość komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej nie wyklucza konfliktów immunologicznych: ciężką ostrą i przewlekłą chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi obserwuje się odpowiednio u 23 i 25% biorców. Nawroty ostrej białaczki do końca pierwszego roku po przeszczepie komórek krwi pępowinowej odnotowuje się w 26% przypadków.

[ 10 ], [ 11 ]