Hemopoetyczne komórki macierzyste krwi pępowinowej

Krew pępowinowa działa jako źródło hematopoetycznych komórek macierzystych na potencjał proliferacyjny i zdolności repopulacji komórek hematopoetycznych. Wielokrotnie wykazano, że w chwili porodu krew pępowinowa zawiera dostatecznie dużo niedobrych hematopoetycznych komórek progenitorowych. Niektórzy autorzy uważają, że zaletą przeszczepiania hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej jest to, że nie ma potrzeby poszukiwania dawcy zgodnego z antygenami HLA. Zgodnie z nimi, niedojrzałość układu odpornościowego przyczyn noworodka zmniejszenie aktywności funkcjonalnej komórek immunokompetentnych i, odpowiednio, mniejsze niż w szpiku kostnego, częstość występowania ciężkich „przeszczep przeciwko gospodarzowi” reakcji. W tym przeżycia przeszczepu komórek krwi pępowinowej nie jest niższa niż w komórkach szpiku kostnego, nawet w przypadku stosowania mniejszej liczby GSK podawany na 1 kg masy ciała pacjenta. Jednak naszym zdaniem optymalna liczba pytań przeszczepione komórki krwi pępowinowej niezbędne do skutecznego wszczepienia w organizmie biorcy, ich zgodności immunologicznej, a także szereg innych aspektów transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych krwi pępowinowej wymaga bardziej poważną analizę.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]

Uzyskanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej

Procedura uzyskania krwiotwórcze komórki macierzyste krwi pępowinowej wymaga jego spożycia bezpośrednio po urodzeniu i jej oddzieleniu od łożyska, gdy łożysko jest w macicy lub ex macicy, a także z cesarskiego cięcia, ale także np utero. Wykazano, że w przypadku zmniejszenia czasu od urodzenia do rozdzielenia noworodka od łożyska do 30 sekund, objętość krwi pępowinowej wzrasta średnio o 25-40 ml. W późniejszym postępowaniu utracona zostaje ta sama ilość krwi. Ustalono, że wczesne oddzielenie dziecka od zgonu nie pociąga za sobą żadnych negatywnych konsekwencji dla noworodka.

Rosyjski Instytut Hematology and Blood Transfusion opracowane zostaną skuteczne i tanie techniki zarówno w krwi pępowinowej liniach fizjologicznych ((70.2 + 25.8) ml) i cesarskiego cięcia ((73,4) + 25,1 ml). Sposób rozdzielania krwi pępowinowej z wystarczająco wysoką wydajnością komórek jednojądrzastych i jądrowych - 83,1 (+ 9,6) i (83,4) + 14,1%, odpowiednio. Ulepszony sposób kriokonserwacji krwi pępowinowej, co zapewnia wysokie bezpieczeństwo komórek jednojądrzastych i CFU-GM - (96,8 + 5,7) i (89.6 + 22.6)%, odpowiednio. Skuteczność metody pobierania próbek krwi pępowinowej drenaż przy użyciu pojemnika „Kompoplast-300” (Rosja). Ogrodzeniowe autorzy krwi pępowinowej wykonywane natychmiast po urodzeniu i jego oddzielenia od łożyska, jeśli chodzi o umieszczenie łożyska w macicy lub ex utero. Przed nakłucie żyły pępowinowej pępowiny raz potraktowano 5% nalewki jodu, a potem dwukrotnie - 70% alkoholu etylowego. Krew przepływa przez rurę łączącą do pojemnika spontanicznie. Procedura pobierania próbek Czas nie trwa dłużej niż 10 minut. 66 gromadzone metoda odwodnienia objętość próbki krwi pępowinowej średnio (72 + 28 ml), a liczba leukocytów w próbce pełnej średnio - (1,1 + 0,6) x x 107. Analiza krwi pępowinowej jałowości (skażenie bakteryjne, HIV-1 wirusa zapalenia wątroby typu B i C, kiły, i zakażenia wirusem cytomegalii) tylko w jednej próbce stwierdzono IgG przeciwciał wirusowego zapalenia wątroby typu C, w innym badaniu raz łożysko po urodzeniu płodu powierzchnia została umieszczona na specjalnej ramie dołu, przewód potraktowano 5% soli sodowej jodu i 75% etilo th alkohol. żyły pępowinowej igłą odprowadzanych z układu transfuzji (G16). Krew płynęły do kontenera spontanicznie. Objętość pobranej krwi sposób średnio (55 + 25 ml). W artykule G. Kogler i inni (1996), przewód krwi pobranej zamkniętym sposobem i otrzymuje się duże ilości krwi - średnio (79 + 26 ml). Autorzy zauważają, że wśród 574 kręgowego próbki krwi zawierają około 7% mniej niż 40 ml krwi, która nie pozwala wykorzystać je do transplantacji. Isoyama K. I inni (1996), z krwi pępowinowej aktywnym exfusion za pomocą strzykawek, które wpłynęło średnio 69,1 ml krwi (objętość krwi pępowinowej wahała się od 15 do 135 ml). Wreszcie współpracownicy A. Abdel-Mageed PI (1997) przez punovinnoy żyły cewnik otrzymano w średnio 94 ml krwi pępowinowej (od 56 do 143 ml).

Aby zmniejszyć ryzyko jatrogennego zakażenia i zanieczyszczenia wydzieliny matki rozwiniętych zamknięty system zbierania krwi oparte na powszechnie stosowanych systemach transfuzioinoy Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), zawierającej 62,5 ml CPDA (cytrynianu-fosforanu-dekstrozy adeniną), a antykoagulant. Technologia otrzymywania materiału ma podstawowe znaczenie dla przygotowania próbki jakościowej pod względem objętości, zawartości i czystości zawiesiny komórek. Istniejących metod pobierania krwi pępowinowej, kotoryeuslovno dzieli się zamknięty, częściowo otwartym i otwarty korzystnie układ sleduetotdavat najpierw, podobnie jak w systemie zamkniętym, znacznie zmniejsza ryzyko skażenia mikrobiologicznego materiału, jak również zanieczyszczenia w zawiesinie komórkowej komórki macierzystej.

A. Nagler i współautorzy (1998) przeprowadzili analizę porównawczą skuteczności wszystkich trzech systemów pobierania krwi pępowinowej. W pierwszym wariancie procedurę wykonywano w systemie zamkniętym przez wyciskanie krwi bezpośrednio do pojemnika. W drugim wariancie krew pępowinową uzyskano metodą aktywnego przetłaczania krwi strzykawek 1 z dalszym płukaniem żył łożyska i równoczesnym odprowadzaniem krwi do pojemnika (metoda otwarta). W trzecim wariancie krew pobierano w systemie półotwartym, aktywnie ekstrahując ją strzykawkami i przepłukując tętnicę pępowinową z równoczesnym wyciskaniem do pojemnika. W pierwszej wersji autorzy otrzymali krew pępowinową w objętości (76,4 + 32,1) ml z liczbą leukocytów (10,5 + 3,6) x 10 ⁶ na 1 ml krwi. W drugim wariancie odpowiednie wskaźniki wynosiły (174,4 + 42,8) ml i (8,8 + 3,4) x 10 ⁶ / ml; w trzecim - (173,7 + 41,3) ml i (9,3 + 3,8) x 10 ⁶ / ml. Najczęstsze zakażenie próbek krwi pępowinowej odnotowano w przypadku stosowania systemu otwartego. Stwierdza się bezpośrednią zależność między masą łożyska a objętością wyekstrahowanej krwi - wraz ze wzrostem masy łożyska wzrasta ilość pobieranej krwi.

Po pobraniu krwi pępowinowej następuje etap oddzielania - izolacja komórek jednojądrzastych i oczyszczanie zawiesiny komórek z erytrocytów. W warunkach eksperymentalnych komórki jądrzaste izoluje się metodą sedymentacji z metylocelulozą podczas lizy erytrocytów amonowych przez chlorek. Jednak do celów klinicznych nie należy stosować metylocelulozy, ponieważ utrata krwiotwórczych komórek macierzystych osiąga 50-90%. Lizę krwinek czerwonych, w związku z dużymi objętościami roztworu roboczego w klinice również prawie przeprowadzane, chociaż procent rozdzielenia w ten sposób jądrzastych komórek o fenotypie CD34 + i komórek progenitorowych funkcji CFU-GM i CFU-GEMM znacznie wyższa. Zgłaszano nowy czynnik do izolacji komórek jednojądrzastych w roztworze gęstości skupienia gęstości (BDS72). Substancja ta ma następujące parametry fizjologiczne: pH - 7,4, osmolalność - 280 mosm / kg, gęstość - 1.0720 g / ml. Według autorów, przy jego pomocy można wyizolować do 100% komórek CD34-dodatnich i usunąć 98% czerwonych krwinek. Jednak klinika nie stosuje jeszcze BDS72.

Metody rozdzielania przez komórki jądrzaste z krwi pępowinowej są zwykle używane do 10% roztworu HES lub 3% roztworu żelatyny. Skuteczność wytrącania erytrocytów i izolacji komórek jądrzastych w obu przypadkach jest w przybliżeniu równa. Jednakże, w przypadku zastosowania jako środka sedymentacji żelatyny możliwe jest uzyskanie nieco większej ilości CFU-GM, niż przy użyciu HES. Zakłada się, że różnica w skuteczności odzyskiwania CFU-GM różnej prędkości ze względu na osadzanie poszczególnych frakcji lub zdolność komórek posiadających jądro komórkowe cząsteczki HES zaabsorbowane na krwiotwórczych receptorów na powierzchni komórek, a tym samym blokują ich wrażliwość na czynniki stymulujące rozwój kolonii, które są stosowane przy hodowaniu komórek CFU-GM w warunkach in vitro. Niemniej jednak, zarówno sedymentator może również nadawać się do izolacji komórek jądrzastych w tworzeniu dużych bankach krwi pępowinowej.

Metody separacji i kriokonserwacji krwi pępowinowej w zasadzie nie różnią się od stosowanych w pracy z hematopoetycznymi komórkami macierzystymi krwi obwodowej i szpiku kostnego dorosłych dawców. Ale przy przygotowywaniu dużej liczby próbek krwi pępowinowej dla swoich banków, metody separacji muszą być przede wszystkim tanie. Dlatego teraz, niestety, na potrzeby kliniczne już stosowane są rutynowe metody izolacji i krioprezerwacji komórek krwi pępowinowej, a bardziej skuteczne, ale efektywne finansowo metody pozostają udziałem eksperymentatorów.

Ogólnie ustalono kryteria oceny liczby komórek krwiotwórczych i wymagania dotyczące badania próbek krwi pępowinowej w celu zidentyfikowania czynników zakaźnych. Aby zapewnić przeszczep krwiotwórczych komórek krwi pępowinowej, wszystkie próbki krwi muszą być badane głównie pod kątem zakażeń krwiopochodnych i chorób genetycznych. Niektórzy autorzy zalecają dodatkowe metody specjalne z badania krwi pępowinowej w celu diagnozowania chorób genetycznych, takich jak talasemia i sierpowatą niedokrwistość, niedobór deaminazy adenozyny, agammaglobulinemią Bruton, choroby Harlera i punter.

Zgodnie z zaleceniami Ticheli L. I inni, (1998), w każdej próbce krwi pępowinowej jest konieczne w celu określenia liczby komórek jądrzastych, SB34-dodatnich i CFU-GM, przeprowadzić HLA-pisania w celu określenia grupy krwi ABO i Rh jego skład. Ponadto siew prowadzi bakteriologicznych serologicznych testów na zakażenie wirusem HIV i CMV, HBsAg, zapalenie wątroby typu C, HTLY-I i HTLV-II (białaczka komórek T, człowieka), kiłę, toksoplazmozy. Obowiązkowe jest reakcja łańcuchowa polimerazy z zakażeniem HIV i CMV.

Sam proces uzyskiwania krwi pępowinowej powinien być przeprowadzony w ścisłej zgodzie z zasadami medycyny bioetycznej. Przed rozpoczęciem pobierania krwi konieczne jest uzyskanie zgody ciężarnej na jej wdrożenie. Wstępna rozmowa z kobietą w ciąży w celu uzyskania świadomej zgody na wykonanie wszystkich zabiegów, od przetoczenia krwi do ukończenia dokumentacji, jest przeprowadzana wyłącznie przez personel medyczny. W każdym przypadku niedopuszczalna wykonywania którejkolwiek z tych procedur przez pracowników z biologicznego, chemicznego, farmaceutycznego i innych edukacji niemedycznych, w związku z naruszeniem ustalonych norm bioetyki i praw człowieka. Pozytywnych testów dla nośnej HBsAg, przeciwciała dla czynnika sprawczego wirusowego zapalenia wątroby typu C, HIV, a nie Kiła przewód krwi pobranej, a zebrane próbki krwi już usunięte i zniszczone. Należy zauważyć, że wózek utajonych infekcji noworodków jest znacznie rzadziej niż u dorosłych, a zatem prawdopodobieństwo krwiopochodnej przepływu i rozwoju powikłań infekcyjnych krwiotwórczych infuzji komórek krwi pępowinowej są znacznie niższe niż w przypadku transplantacji szpiku kostnego uzyskano z dorosłych dawców.

Ważnym punktem w stosowaniu krwi pępowinowej w klinice jest ocena przeszczepu, która opiera się na określeniu liczby hematopoetycznych komórek macierzystych w próbce krwi pępowinowej i dawkach komórek wymaganych do przeszczepu. Nie opracowano jeszcze standardów optymalnej liczby komórek krwi pępowinowej wymaganych do przeszczepu. Nie ma ogólnie akceptowanego punktu widzenia nawet w przypadku takich rutynowych parametrów, jak liczba komórek CD34-dodatnich i CFU-GM. Niektórzy autorzy oceniają potencjał komórek krwiotwórczych analizując długookresowe hodowle, określając stężenie jednostek tworzących kolonie wspólnych dla granulocytów, erytrocytów, monocytów i megakariocytów - CFU-GEMM.

Jednak w warunkach klinicznych standardowa ocena przeszczepu krwi pępowinowej zwykle obejmuje jedynie oznaczenie liczby komórek jądrzastych lub jednojądrzastych.

Przechowywanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej

Istnieją pewne problemy w technologii przechowywania krwiotwórczych komórek krwi pępowinowej. Gdy kriokonserwacji krwiotwórczych komórek macierzystych, w celu uzyskania ich optymalny tryb zamrażania musi minimalizować ilość krwi pępowinowej i krwinkach czerwonych uprzednio usunąć, aby uniknąć hemolizy i ryzyko reakcji niezgodności antygenów krwinek czerwonych (ABO, RH). Do tych celów odpowiednie są różne metody izolacji komórek jądrzastych. Na początku lat 90-tych ubiegłego wieku, najczęściej stosowanym sposobem rozdzielania komórek jądrzastych w gradiencie gęstości na podstawie Ficoll o gęstości 1,077 g / ml, lub perkolacji o gęstości 1,080 g / ml. Oddzielenie kordu krwi gradientem gęstości umożliwia wybór komórki jednojądrzaste ale przeważnie prowadzi do znacznych strat krwiotwórczych komórek progenitorowych - do 30-50%.

Wydajność sedymentacji skrobi hydroksyetylowej w procesie izolacji komórek pępowinowych szacuje się na różne sposoby. Niektórzy autorzy wskazują na niską jakość separacji za pomocą tej metody, podczas gdy inni badacze, wręcz przeciwnie, wśród wszystkich możliwych metod preferują przydzielanie krwi pępowinowej HSC dokładnie za pomocą 6% roztworu hydroksyetyloskrobi. Podkreśla to wysoką skuteczność sedymentacji komórek hemopoetycznych, która według niektórych danych sięga od 84% do 90%.

Zwolennicy innego punktu widzenia myślę, że prawie wszystkie procesy frakcjonowania wiązać duże komórki straty yadrosoderzhashih i oferują do rozdzielenia przez wirowanie, oddzielając krwi pępowinowej na 3 frakcje: erytrocytów, leukocytów i pierścienia plazmowego. Oddzielenie komórek w ten sposób, wynalazcy odkryli, że zawartość komórek jednojądrzastych komórek krwiotwórczych i progenitorowych komórek CD34 + immunofenotypu ostatecznie wynosiły odpowiednio 90, 88 i 100% pierwotnego poziomu. Podobne ilości oczyszczonej wzrostu w tym sposobie komórek krwi pępowinowej uzyskanych przez innych badaczy Po sedymentacji jądrzastych przydzielono 92%, 98% - 96% jednojądrzastych - komórek CD34-dodatnich i 106% jednostek tworzących kolonie.

Pod koniec lat 90. żelatyna była szeroko stosowana jako środek sedymentujący. W praktyce klinicznej, z pomocą żelatyny, krwiotwórcze komórki macierzyste krwi pępowinowej wyizolowano od 1994 roku. Przy stosowaniu 3% roztworu żelatyny skuteczność izolacji komórek jądrzastych osiąga 88-94%. Powszechne stosowanie żelatyny w rozwoju banku krwi pępowinowej potwierdziło jego zalety w porównaniu z innymi środkami sedymentacyjnymi. Analiza porównawcza wszystkich powyższych metodach izolacji komórek jądrzastych w zakresie ich powtórnego użycia w każdej z próbek krwi pępowinowej testy wykazały, że optymalne sedymentator out Komórki jednojądrzaste o fenotypie CD34 + / CD45 +, jak również przez liczbę CFU-GM i CFU-GEMM 3% roztwór żelatyny. Okazało się, że znacznie mniej skuteczne sposoby z zastosowaniem gradientu gęstości Ficoll i stosowanie metylocelulozy i skrobi hydroksyetylowej, w których utrata komórek krwiotwórczych osiągnął 60%.

Ekspansja objętości przeszczepu komórek macierzystych krwi pępowinowej wiąże się nie tylko z rozwojem metod ich produkcji, ale także z przechowywaniem. Istnieje wiele problemów związanych bezpośrednio z przygotowaniem krwi pępowinowej do długotrwałego przechowywania oraz wyborem optymalnej technologii kriokonserwacji dla próbek. Wśród nich są zagadnienia dotyczące celowości wykonywania procedur rozdzielania, stosowania różnych mediów krioprezerwujących oraz stosowania metod przygotowywania rozmrożonych komórek do przeszczepu. Transport macierzystych próbek krwi pępowinowej często przeprowadzany jest z regionów oddalonych od centrów hematologicznych. W związku z tym pojawia się problem dopuszczalnych okresów przechowywania krwi pępowinowej od momentu jej otrzymania do początku kriokonserwacji, co ma szczególne znaczenie w rozwoju banków krwi pępowinowej.

Badanie aktywności funkcjonalnej hematopoetycznych komórek krwi pępowinowej po długoterminowym przechowywaniu (do 12 lat) w ciekłym azocie, wykazała, że około 95% komórek krwiotwórczych w tym czasie nie tracą swoją wysoką zdolność do proliferacji. Papier Yurasova S. I współpracownicy (1997) wykazali, że przewód krwi przechowywano w temperaturze pokojowej (22 ° C) lub w temperaturze 4 ° C przez 24 i 48 godzin, nie powoduje istotnego zmniejszenia żywotności komórek krwiotwórczych, które poziom wyjściowy jest korzystnie 92 i 88%. Jednakże, jeśli czas przechowywania zostanie przedłużony do trzech dni, liczba żywych komórek jądrzastych w krwi pępowinowej jest znacznie zmniejszona. Jednocześnie podczas innych badań stwierdzono, że po przechowywaniu przez 2-3 dni w temperaturze 22 lub 4 ° C cierpi przede wszystkim na żywotność dojrzałych granulocytów, a nie komórek hemopoetycznych.

Na żywotność hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej mogą mieć niekorzystny wpływ elementy systemu do jej gromadzenia. Analiza wpływu różnych leków przeciwzakrzepowych, który to mechanizm działania wynika z wiązania jonów wapnia (ACD, EDTA XAPD-1) dla krwiotwórczych komórek progenitorowych z krwi pępowinowej warunkach przechowywania 24 do 72 godzin wykazały ich negatywny wpływ na żywotność komórek jądrzastych. W związku z tym, autorzy zaleca się stosowanie PBS (roztwór buforu fosforanowego) z dodatkiem natywnego heparyny bez środka konserwującego w stężeniu 20 U / ml, który w opinii, pozwala na zwiększenie czasu przechowywania niefrakcjonowanej krwi pępowinowej do 72 godzin i zapisuje funkcjonalną aktywność jednostek tworzących kolonie. Jednakże, badając bezpieczeństwo CFU-GM i CFU-G, wykazano, że czas przechowywania krwi pępowinowej przed kriokonserwacją nie powinien przekraczać dziewięciu godzin. Oczywiście, w tym przypadku powinna działać zasada, że jeśli jest sprzeczne dane powinny stosować minimalny zalecany okres przechowywania krwi pępowinowej i rozpocząć programowalny zamrażania pojedyncze komórki, tak szybko jak to możliwe.

Podczas zamrażania hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej, 10% roztwór DMSO jest zwykle stosowany jako krioprotektant. Jednakże, oprócz wyrażonego efektu krioprotekcyjnego, dimetylosulfotlenek w tym stężeniu ma bezpośredni efekt cytotoksyczny, nawet pod warunkiem minimalnej ekspozycji na komórki krwiotwórcze krwi pępowinowej. Aby zmniejszyć działanie cytotoksyczne DMSO, stosuje się temperaturę zerową ekspozycji, wzrost szybkości wszystkich manipulacji i wielokrotne mycie po rozmrożeniu próbek pępowiny.

Instytut Hematologii i Transfuzjologii Akademii Medycznej Ukrainy rozwija kierunek naukowy od 1995 roku, którego celem jest zbadanie krwi pępowinowej jako alternatywnego źródła komórek hemopoetycznych macierzystych. W szczególności opracowano nowe technologie kriokonserwacji niskotemperaturowej komórek krwiotwórczych niefrakcjonowanej i frakcjonowanej krwi pępowinowej. Jako krioprotektant stosuje się medyczny poliwinylopirolidon o niskim ciężarze cząsteczkowym. Metoda kriokonserwacji niefrakcjonowanej krwi pępowinowej opiera się na oryginalnej technologii wstępnego przygotowania komórek do zamrażania i techniki specjalnego traktowania zawiesiny komórek bezpośrednio przed przeszczepieniem.

Jednym z najważniejszych czynników wpływających na poziom funkcjonalnej aktywności kriokonserwowanych hemopoetycznych komórek macierzystych jest szybkość chłodzenia zawiesiny komórek, zwłaszcza podczas fazy krystalizacji. Oprogramowanie do rozwiązywania problemu szybkości i czasu zamrażania daje ogromne możliwości tworzenia prostych i wysoce skutecznych metod kriokonserwacji, bez przemywania zawiesiny komórek z krioprotektantów przed przeszczepieniem.

Etapy natychmiastowego zamrażania i rozmrażania są najbardziej niebezpieczne dla żywotności komórek podczas ich przygotowywania. Podczas zamrażania komórek hemopoetycznych znaczną ich część można zniszczyć w momencie przejścia ośrodka międzykomórkowego z fazy ciekłej do fazy stałej - krystalizacji. Aby zmniejszyć odsetek śmierci komórek, stosuje się krioprotektanty, których mechanizmy działania i skuteczność krioochronna zostały odpowiednio opisane w literaturze naukowej.

Obiecujące techniki kierunku optymalizacji kriokonserwacji szpiku kostnego i komórek krwi pępowinowej jest połączenie w tym samym roztworze do niskich stężeń krioprotektantów o różnych mechanizmach działania, na przykład, działając na wewnątrzkomórkowy poziom DMSO i hydroksyetyloskrobia lub albumina posiadającego zewnątrzkomórkowe działanie zamknięcia.

Do kriokonserwacji komórek krwi pępowinowej są tradycyjnie stosowany 20% roztwór w DMSO, który jest trwale mechanicznie mieszając, w łaźni lodowej, powoli wlewa się do zawiesiny komórek w celu uzyskania równej (1: 1) stosunek objętość zawiesiny komórek i konserwantu kriogenicznego. Końcowe stężenie dimetylosulfotlenku wynosi 10%. Zawiesinę komórek następnie chłodzi się na kriostacie programowym z szybkością HS / min do -40 ° C, po czym szybkość chłodzenia zwiększa się do 10 ° C / min. Po osiągnięciu -100 ° C pojemnik z zawiesiną komórek umieszcza się w ciekłym azocie (-196 ° C). Dzięki tej metodzie krioprezerwacji bezpieczeństwo funkcjonalnie aktywnych jednojądrzastych komórek po rozmrożeniu osiąga 85% początkowego poziomu.

Modyfikacje metod kriokonserwacji mają na celu zmniejszenie stężenia DMSO przez dodanie skrobi hydroksyetylowej (końcowe stężenia dimetylosulfotlenku i hydroksyetyloskrobi wynoszą odpowiednio 5% i 6%). Wysoką skuteczność tej kombinacji krioprotektantów obserwuje się, gdy zawiesina komórek szpikowych jest zamrożona, przy nie mniejszej ochronie cytoprotekcyjnej niż przy pojedynczym 10% roztworze dimetylosulfotlenku. Liczba żywotnych komórek jądrzastych osiągnęła 96,7% poziomu bazowego, a ich aktywność funkcjonalna, oszacowana na podstawie liczby CFU-GM, wynosiła 81,8%.

Przy użyciu roztworu sulfotlenku dimetylu w stężeniach w zakresie od 5 do 10% w połączeniu z 4% hydroksyetyloskrobi (stężenie końcowe), stwierdzono, że zachowanie komórek CD34-dodatnich w tych zakresach dimetylosulfotlenek praktycznie niezmienione. W tym samym czasie, w warunkach zmniejszonego stężenia sulfotlenku dimetylu od 5 do 2,5%, obserwuje się utratę masy komórek krwi pępowinowej - liczba żywotnych komórek spada z 85,4 do 12,2%. Inni autorzy doszli do wniosku, że to 5 i 10% roztwór dimetylosulfotlenku (w przykładzie wykonania autorskiego - w połączeniu z autologicznym surowicy) z maksymalną wydajnością podczas zapewnić cytoochrony kriokonserwacji HSC krwi pępowinowej. Ponadto, kolejno wysokie bezpieczeństwo zamrożone i rozmrożone komórki oznaczone w przypadku kompozycji z 5 lub 10% DMSO 4% roztwór skrobi hydroksyetylowej, zwłaszcza przy kontrolowanej szybkości chłodzenia TOS / min. W innym opracowaniu roztworu użytego krioochronny składającego się z trzech składników już - DMSO, oczyszczoną ludzką albuminę i pożywce RPMI w stosunku 1: 4: 5, który dodaje się do zawiesiny po komórkach w takim samym stosunku objętościowym (końcowe stężenie DMSO wynosiło 5%). Po rozmrożeniu w łaźni wodnej o temperaturze + 4 ° C bezpieczeństwo CFU-GM przekroczyło 94%.

Niektórzy autorzy sugerują stosowanie niefrakcjonowanej krwi pępowinowej do krioprezerwacji, ponieważ znaczne ilości komórek krwiotwórczych są tracone podczas usuwania czerwonych krwinek. W tym wykonaniu, 10% roztwór dimetylosulfotlenku jest stosowany do ochrony komórek jednojądrzastych przed szkodliwym działaniem kriokrystalizacji. Zamrażanie prowadzi się przy stałej szybkości schładzania HS / min do -80 ° C, po czym zawiesinę komórek krwi pępowinowej zanurza się w ciekłym azocie. Ta metoda zamrażania prowadzi do częściowej lizy erytrocytów, dlatego próbki krwi nie wymagają frakcjonowania. Po rozmrożeniu zawiesinę komórek przemywa się z wolnej hemoglobiny i dimetylosulfotlenku w roztworze ludzkiej albuminy lub w surowicy autologicznej pacjenta i stosuje do przeszczepu.

Zachowanie krwiotwórczych komórek progenitorowych po rozmrożeniu niefrakcjonowanej krwi pępowinowej jest istotnie wyższa niż frakcjonowane, ale w związku z krioustoychivostyu czerwonych krwinkach może powodować poważne problemy w wyniku potransfuzyjnego transfuzji czerwonych krwinek ABO niekompatybilny. Ponadto znacznie wzrasta objętość przechowywanej niefrakcjonowanej krwi. Z klinicznego punktu widzenia nadal preferuje się krioprezerwację wcześniej izolowanych i oczyszczonych z innych komórkowych frakcji krwiotwórczych komórek krwi pępowinowej.

W szczególności, sposób jest kriokonserwacji komórek krwi pępowinowej frakcjonowane pozwala usunąć erytrocytów w przygotowaniu do zamrażania, który wykorzystuje 6% roztwór hydroksyetyloskrobi w roztworze środka plazmozameshchath „Stabizol”. Po rozmrożeniu uzyskana w ten sposób zawiesina komórkowa jest gotowa do użytku klinicznego bez dodatkowej manipulacji.

Tak więc obecnie istnieje wiele całkiem skutecznych sposobów kriokonserwacji krwi pępowinowej. Główną różnicą jest to, że próbki krwi są zamrożone, niefrakcjonowane lub poddane rozdziałowi na frakcje komórkowe podczas etapu przygotowania i zebrane komórki jądrzaste bez domieszki erytrocytów.

Transplantacja hemopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej

Pod koniec lat 80. - wczesnych lat 90. Ubiegłego wieku stwierdzono, że krew pępowinowa dostarczająca płód w czasie ciąży charakteryzuje się wysoką zawartością krwiotwórczych komórek macierzystych. Względna prostota pozyskiwania komórek krwi pępowinowej i brak oczywistych problemów etycznych sprzyjała wykorzystaniu komórek macierzystych krwi pępowinowej w praktycznym leczeniu. Pierwsza udana transplantacja krwi pępowinowej u dziecka z niedokrwistością Fanconiego posłużyła jako punkt wyjścia do rozszerzenia objętości transplantacji komórek pępowinowych krwi pępowinowej i stworzenia systemu do zaopatrzenia banku. W globalnym systemie banków krwi pępowinowej największym jest New York Center for Placental Blood, które znajduje się w bilansie National Institutes of Health. Liczba przechowywanych próbek krwi pępowinowej w tym banku zbliża się do 20 LLC. Wzrasta również liczba biorców (głównie dzieci) i przeprowadzono udaną transplantację. Według Departamentu Zdrowia USA okres wolnego od nawrotów życia po przeszczepie biorców krwi pępowinowej HSC przekroczył już 10 lat.

Nie jest to zaskakujące, ponieważ liczne badania nad potencjałem krwiotwórczych krwi pępowinowej wykazały, że ilość i jakość najwcześniejszych komórek macierzystych nie tylko nie jest gorsza od dorosłego człowieka szpiku kostnego, ale także przez niektóre środki przekraczają go. Wyższy potencjał proliferacyjny komórki macierzyste krwi pępowinowej spowodowane funkcje rozwojowe Celi Signalling, obecność receptorów na HSC specyficznymi czynnikami wzrostu, zdolność komórek krwi pępowinowej do autokrynne wytwarzanie czynników wzrostu, dużych rozmiarów i długości telomerów.

Tak więc genomowe i fenotypowe cechy komórek krwi pępowinowej tworzące krew pępowinową determinują jakościowe wszczepienie przeszczepu o wysokim potencjale przywracania hemopozy dawcy w organizmie biorcy.

Zalety hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej

Wśród rzeczywistych korzyści z użyciem komórek macierzystych krwi pępowinowej krwiotwórczych do transplantacji w stosunku do innych źródeł komórek krwiotwórczych należy zauważyć, prawie zero ryzyka dla zdrowia dawcy (jeśli nie jest uważany za taki łożysko), eliminując jednocześnie konieczność znieczulenia ogólnego. Zastosowanie krwi pępowinowej rozszerza możliwości przeszczepu komórek dzięki częściowo kompatybilnej transplantacji w układzie HLA (niezgodność od jednego do trzech antygenów). Technika długotrwałego przechowywania hematopoetycznych komórek krwi pępowinowej w stanie zamrożenia, co zwiększa prawdopodobieństwo otrzymania rzadki typ HLA oraz zmniejsza czas wyszukiwania HLA allogenicznym. Jednocześnie ryzyko rozwoju niektórych utajonych infekcji przenoszonych drogą transmisji jest znacznie zmniejszone. Ponadto istnieje niedroga forma biologicznego ubezpieczenia na życie w związku z możliwością zastosowania komórek krwi pępowinowej do autologicznych przeszczepów.

Jednakże, z powodu małych objętości krwi, które mogą być zbierane z łożyska (średnio nie więcej niż 100 ml) do wyżej problem uzyskania maksymalnej możliwej ilości krwi z żyły pępowinowej kręgowego w ścisłej zgodności z warunkami minimalnym ryzykiem zanieczyszczenia bakteryjnego krwi pępowinowej próbek pochodnych.

Prymitywne krwiotwórcze komórki z krwi pępowinowej są ogólnie określone przez obecność w ich glikofosfoproteina powierzchni CD34, a w oparciu o ich właściwości funkcyjnych przez badanie klonogenny testowego lub tworzenie kolonii in vitro. Porównawcza analiza wykazała, że w krwi pępowinowej i szpiku kostnego maksymalnej zawartości komórek jednojądrzastych komórek CD34-pozytywnych z frakcji wynosi odpowiednio 1,6 i 5,0%, przy czym maksymalny poziom jednostek tworzących kolonie w subpopulacji komórek CD34 + - 80 do 25%, całkowitej wydajności klonowania komórek CD34 + komórki b - 88 i 58% maksymalnego tworzenia kolonii komórek o dużym potencjale proliferacyjnym (HPP-CFC w -populyatsii CD34 +) - 50, a 6,5%. Należy dodać, że wydajność klonowania komórek CD34 + CD38 komórek i zdolność do odpowiedzi na stymulację cytokiny wyższa w krwiotwórczych komórek macierzystych z krwi pępowinowej.

Kombinacja antygenów fenotypowe Thy-1, CD34 i CD45RA potwierdza wysoką zdolność proliferacyjną komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej i ekspresji trzech antygenów na powierzchni komórek krwi pępowinowej wskazuje, że należą one do komórek macierzystych. Ponadto ustalono, że krew pępowinowa zawiera komórki o fenotypie CD34 +, które nie mają liniowych markerów różnicowania. Poziom subpopulacji komórek krwi pępowinowej do profilu fenotypowa komórek CD34 + / Lin około 1% całkowitej liczby komórek CD34-dodatnich. Komórki prekursorowe krwi pępowinowej powodują powstanie zarówno limfoidalnej linii komórkowej, jak i polipowatej serii mieloidalnych liniowych różnicowania komórek, co również wskazuje na ich przynależność do komórek macierzystych.

Jak już wspomniano, istotne różnice między szpikiem kostnym a krwi pępowinowej to ilość komórek krwiotwórczych używanych do przeszczepu, uzyskanych za pomocą jednej procedury. Gdy szpiku kostnego utraty przeszczepu masy komórek w procesie rozdzielania, kriokonserwacji, rozmrożeniu i testy są dopuszczalne w zakresie 40-50% komórek krwi pępowinowej taka strata jest bardzo istotne, ponieważ przy stosowaniu niewystarczającą liczbę HSC przeszczepu, może być nie do przyjęcia. Według G. Kogler et al (1998), do przeszczepu komórek w stosunku do masy ciała biorcy na 10 kg potencjał przeszczepie (całkowita liczba pobranych próbek krwi pępowinowej - 2098) może być dla wszystkich próbek krwi pępowinowej, masa ciała 35 kg - 67%, a jedynym 25% próbek będzie w stanie zapewnić skuteczny przeszczep u pacjentów o masie ciała 50-70 kg. Ta sytuacja kliniczna wskazuje na potrzebę optymalizacji i poprawy skuteczności istniejących metod pobierania próbek, reprodukcji i przechowywania komórek krwi pępowinowej. W związku z tym problemy standaryzacji metody próbkowania, badania oddzielenie i kriokonserwacji krwi pępowinowej są obecnie szeroko omówione w literaturze, do tworzenia banków krwi, jego zastosowania w leczeniu klinicznym, oraz stworzenie warunków, i warunki przechowywania krwiotwórczych komórek macierzystych z krwi pępowinowej.

[7], [8], [9],

Wykorzystanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej w medycynie

Zwykle z krwi pępowinowej można izolować do 10 ⁶ hematopoetycznych komórek macierzystych, rzadko więcej. W związku z tym, do dzisiaj pozostaje pytanie o wystarczalność tak wielu krwiotwórczych komórek krwi pępowinowej, aby przywrócić hematopoezę dorosłego biorcy. Opinie w tej sprawie były podzielone. Niektórzy naukowcy uważają, że ta ilość jest wystarczająca dla dzieci z transplantacją, ale zbyt mały, aby przeszczep dorosłego człowieka, dla którego podawanie jest optymalny (7-10) x 10 ⁶ komórek CD34-dodatnich, na 1 kg masy ciała - średnio 7 x 10 ⁸ na przeszczep. Z tych obliczeń wynika, że jedna próbka pępowinowa zawiera 700 razy mniej hematopoetycznych komórek macierzystych, niż jest wymagana w przypadku jednego przeszczepu u dorosłego pacjenta. Taka ocena ilościowa jest jednak przeprowadzana analogicznie do liczby przetoczonych komórek w szpiku kostnym i całkowicie ignoruje ontogenetyczne cechy hematopoezy.

W szczególności fakt wyższego potencjału proliferacyjnego krwiotwórczych komórek macierzystych krwi pępowinowej jest ignorowany w porównaniu z hematopoetycznymi komórkami prekursorowymi szpiku kostnego. Wyniki badania in vitro potencjału tworzenia kolonii sugerują, że pojedyncza dawka krwi pępowinowej może zapewnić odtworzenie hematopoezy dorosłego biorcy. Z drugiej strony, nie należy zapominać, że liczba HSC maleje nawet w trakcie rozwoju embrionalnego: zawartość komórek CD34-dodatnich w krwi pępowinowej jest liniowo zmniejszona 5 razy w okresie 20 tygodni (krew do badania uzyskano w przypadku przedwczesnego zakończenia ciąży) do 40 tygodnia ciąży (okres fizjologicznych porodów), któremu towarzyszy równoległy, stały wzrost ekspresji liniowych markerów cytodróżnicowania.

Z powodu braku standaryzowanego podejścia do oznaczania ilościowego komórek progenitorowych w próbkach krwi pępowinowej, kontrowersje dotyczące optymalnej dawki krwiotwórczych komórek macierzystych krwi pępowinowej trwają nadal. Niektórzy badacze uważają, że liczba komórek jądrzastych i komórek jednojądrzastych, ponownie przeliczona na masę ciała biorcy, czyli ich dawka, może być stosowana jako kryterium wyboru próbek pępowiny. Niektórzy autorzy uważają, że minimalny próg ilościowy komórek CD34 +, nawet w przypadku autologicznej transplantacji HSC, wynosi 2 x 10 ⁶ / kg. Wzrost dawki komórek krwiotwórczych do 5 x 10 ⁶ komórek / kg (w sumie 2,5) zawiera już bardziej nadaje się do wczesnych lat po przeszczepie, zmniejsza ryzyko powikłań infekcyjnych i skraca okres profilaktycznej terapii antybiotykami.

Według E. Gluckmana et al (1998) w hematologii pomyślnego przeszczepiania komórek krwi pępowinowej jest wprowadzenie co najmniej 3.7 x 10 ⁷ komórek jądrzastych na 1 kg masy ciała pacjenta. Przez zmniejszenie dawki krwiotwórczych komórek macierzystych do 1 x 10 ⁷ lub mniej komórek jądrzastych na 1 kg masy ciała pacjenta i ryzyko niewydolności przeszczepu nawrotowe nowotwory krwi wzrasta dramatycznie. Należy zauważyć, że minimalna liczba komórek progenitorowych wymaganych do szybkiego odzyskania hemopoezy po alotransplantacji GSG nie jest jeszcze znana. Teoretycznie można to osiągnąć za pomocą pojedynczej komórki, ale kliniczne szpiku kostnego szybkiego i trwałego zagwarantowane Zagnieżdżenie transfuzji przynajmniej (1-3) x 10 ⁸ komórek jądrzastych na 1 kg masy ciała pacjenta.

Ostatnie szczegółowe badanie w celu określenia optymalnej ilości HSC w onkohematologii obejmowało obserwację pacjentów z trzech grup wyizolowanych w zależności od zawartości komórek CD34-dodatnich w materiale do przeszczepu. Pacjenci z pierwszej grupy otrzymali (3-5) x ¹⁰⁶ komórek / kg. GSK dawki u pacjentów w drugiej grupie wynosiła do (5-10) X 10 ⁶ komórek / kg, a w trzeciej grupie pacjentów przeszczepionego więcej niż 10 x 10 ⁶ komórek CD34 + / kg. Najlepsze wyniki zaobserwowano w grupie otrzymujących przeszczep z liczbą komórek CD34-dodatnich równą (3-5) x 10 ⁶ / kg. Wraz ze wzrostem dawki przeszczepionych komórek powyżej 5 × 10 ⁶ / kg nie zidentyfikowano statystycznie istotnych korzyści. Jednocześnie bardzo duża zawartość HSC w przeszczepie (> 10 x 10 ⁶ / kg) jest związana z ponowną infuzją znacznej liczby resztkowych komórek nowotworowych, co prowadzi do nawrotu choroby. Nie było bezpośredniego związku między liczbą przeszczepionych allogenicznych komórek progenitorowych a rozwojem reakcji "przeszczep przeciwko gospodarzowi".

Zgromadzone na całym świecie doświadczenie transplantacji krwi pępowinowej HSC potwierdza ich wysoki potencjał w zakresie zasiedlania. Współczynnik wszczepienia przeszczepu krwi pępowinowej koreluje z liczbą wprowadzonych komórek jądrzastych. Najlepsze wyniki obserwuje się przy transplantacji 3 × 10 ⁷ / kg, podczas gdy dla szpiku kostnego dawka ta wynosi 2 × 10 ⁸ / kg. Według danych ośrodków koordynacyjnych, pod koniec 2000 r. Na świecie wykonano 1200 przeszczepów komórek krwi pępowinowej, głównie od krewnych dawców (83%). Oczywiście krew pępowinowa powinna być traktowana jako alternatywa dla szpiku kostnego do przeszczepu u pacjentów z hemoblastozami.

Jednakże, charakter noworodków Cordova źródło tkanki krwiotwórczej zachęcające ze względu na obecność funkcjonalnych jego GCW. Jednak tylko doświadczenie kliniczne mogą dać odpowiedź na pytanie o adekwatność próbki krwi pępowinowej dla dorosłych krwiotwórczego rozpuszczeniu odbiorcy z aplazji hematopoezy. Transplantacja komórek krwi pępowinowej są wykorzystywane w leczeniu wielu chorób o charakterze guza i nienowotworowych: białaczek i zespołów mielodysplastycznych, chłoniaki nieziarnicze i nerwiaka, niedokrwistość aplastyczną, wrodzoną niedokrwistość Fanconiego diamentową czerni wentylatora, niedobór adhezji leukocytów, zespół Barr, zespół Gunther choroba Harlera, talasemii ,

Szczególna uwaga i odrębne badania zasługują na immunologiczne aspekty transplantacji komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej. Wykazano, że w przypadku transplantacji komórek macierzystych z krwi pępowinowej od dawców z niepełnych HLA wyników transplantacji jest zadowalająca, że według twórców, wskazując krwi pępowinowej immunoreaktywność mniejszą od szpiku kostnego.

Szczegółowe badanie składu komórek krwi pępowinowej wykazały cechy zarówno fenotypowej spektrum komórek efektorowych układu odpornościowego i ich funkcjonalną aktywność, co pozwala rozważyć krwi pępowinowej jako źródło HSC ze stosunkowo niskiego ryzyka reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi”. Wśród objawów czynnościowej niedojrzałości immunokompetentnych komórek pępowinowych należy zauważyć brak równowagi w wytwarzaniu cytokin i zmniejszenie wrażliwości na regulację odpowiedzi immunologicznej na cytokiny. Wynikające z tego hamowanie cytotoksycznej aktywności limfocytów jest uważane za czynnik przyczyniający się do tworzenia odporności immunologicznej na przeszczepioną tkankę hemopoetyczną. W populacji limfocytów krwi pępowinowej, w przeciwieństwie do krwi obwodowej i szpiku kostnego dorosłych dawców, dominują nieaktywne, niedojrzałe limfocyty i komórki supresorowe. Wskazuje to na zmniejszoną dostępność limfocytów T krwi pępowinowej do odpowiedzi immunologicznej. Ważną cechą populacji monocytów w komórkach krwi pępowinowej jest niska zawartość funkcjonalnie pełnych i aktywnych komórek prezentujących antygen.

Z jednej strony, niski stopień dojrzałości komórek efektorowych układu odpornościowego w odczytach krwi pępowinowej rozszerza jego zastosowania w klinice, ponieważ te cechy pozwalają na zmniejszenie intensywności konfliktu odpornościowego między komórkami dawcy i biorcy. Ale z drugiej strony, wiemy o istnieniu korelacji pomiędzy stopniem reakcji „przeszczep przeciw gospodarzowi” i przeszczepu działania przeciwnowotworowego, czyli efekt rozwoju „przeszczep przeciwko białaczce”. W związku z tym przeprowadzono badanie przeciwnowotworowej cytotoksyczności komórek pępowinowych. Wyniki wskazują, że pomimo bardzo osłabioną odpowiedzią immunologiczną komórek krwi pępowinowej do stymulacji antygenowej, aktywowanych w pierwszej kolejności są komórek NK i komórek killeropodobnymi, które są aktywnie zaangażowane w mechanizmach realizacji cytotoksyczności przeciwnowotworowej. Ponadto, w subpopulacji limfocytów krwi pępowinowej były w fenotypie CD16 + CD56 + i CD16 znaleziono „TCRA / p +. Uważa się, że komórki te są w postaci aktywnej realizacji reakcji” przeszczep przeciwko białaczce”.

W Instytucie Onkologii Akademii Nauk Medycznych Ukrainy kriokonserwowane krwiotwórcze komórki z krwi pępowinowej były podawane pacjentom z rakiem z przetrwałym hipoplazji hematopoezy powodu chemioterapii i radioterapii. U tych pacjentów, przeszczep komórek hematopoetycznych krwi pępowinowej skutecznie przywrócić ucisk krwi, o czym świadczy przetrwałego uniesienia dojrzałych uformowanych elementów w krwi obwodowej, a także wzrost wskaźników charakteryzujących stan odporności komórkowej i humoralnej. Stabilność repopulyatsionnogo efekt po transplantacji komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej pozwala na ciągłym promieniowaniem i chemioterapią, bez przerywania leczenia. Istnieją dowody, że większa wydajność aloprzeszczepu pacjentów nowotworowych komórek macierzystych krwi pępowinowej: roczne ryzyko nawrotu guza w ich użycia wynosił 25% w porównaniu z 40% u pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego allogenicznego genu.

Mechanizm działania zamrożonych krwi pępowinowej komórek macierzystych powinny być traktowane jako wynik humoralnej stymulacji odbiorców hematopoezy spowodowanych przez unikalną zdolność komórek noworodków do autokrynnych produkcję krwiotwórczych czynników wzrostu, jak również na skutek tymczasowego wszczepienia komórek dawcy (jako potwierdzenie - znaczny wzrost zawartości krwi obwodowej hemoglobiny płodowej odbiorcy 7-15 ty dzień po transfuzji krwi, w porównaniu do wartości początkowej). Brak u biorców krwi pępowinowej reakcji potransfuzyjnego - wynik jego względną tolerancję komórek układu odpornościowego, a także jako kryterium ufności użyteczność zamrożonego materiału biologicznego.

Komórki progenitorowe limfocyty T zabójcy przewód krwi w stanie aktywacji pod wpływem stymulacji egzogennych cytokin, które jest wykorzystane do opracowania nowych ex vivo i in vivo, sposobów indukowania komórki cytotoksyczne limfoidalne przeciwnowotworowej immunoterapii do dalszego przeszczepu. Ponadto "niedojrzałość" genomu immunokompetentnych komórek krwi pępowinowej umożliwia ich stosowanie w celu wzmocnienia aktywności przeciwnowotworowej za pomocą metod modelowania molekularnego.

Dzisiaj krew pępowinowa znalazła szerokie zastosowanie głównie w hematologii dziecięcej. U dzieci z ostrą białaczką allotransplantacja krwiotwórczych komórek macierzystych krwi pępowinowej porównaniu do przeszczepów szpiku kostnego, co znacznie zmniejsza ryzyko reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi”. Jednak istnieje dłuższy okres neutropenii i małopłytkowości, a niestety wyższy poziom 100-dniowej śmiertelności po przeszczepie. Dłuższy okres odzysku w obwodowych granulocytów i płytek krwi mogą być spowodowane niedostateczną zróżnicowania poszczególnych subpopulacji komórek pozytywnych CD34 krwi pępowinowej, co potwierdza niski poziom absorpcji rodamina radioaktywnego i niską ekspresją antygenu CD38 na powierzchni.

W tym samym czasie transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych z pępowiny krwi u dorosłych pacjentów, wykonanych ze względu na brak zarówno zgodnego niespokrewnionego dawcy szpiku kostnego, a także możliwości mobilizacji autologicznych HSC wykazało wysoką roczną nawrotów przeżycie u pacjentów w wieku poniżej 30 lat (73%) , Rozbudowa przedział wiekowy odbiorca (18-46 lat) zmniejszyła się przeżywalność do 53%.

Ilościowa analiza komórek o fenotypie CD34 + szpiku kostnego i krwi pępowinowej wykazała wyższy (3,5-krotnie), ich zawartość w szpiku kostnym, a krew pępowinowa wykazywały znaczące przewagi komórek z fenotypową profilu CD34 + HLA-DR .Izvestno, chtokletkikrovisimmunologicheskimi markerów CD34 + HLA-DR proliferacji bardziej aktywne niż immunofenotypu komórek CD34 + HLA-DR +, co potwierdzono w badaniach doświadczalnych wzrostu długotrwałej hodowli komórek krwiotwórczych in vitro. Prymitywne prekursorami komórek o fenotypie CD34 + CD38 zawarta w krwi pępowinowej i szpiku kostnego, ale komórek krwi pępowinowej z ustalonym znacznikiem CD34 + CD38 ma większą aktywność niż klonogenne krwiotwórcze komórki tego samego fenotypu izolowanych dorosłego dawcy szpiku kostnego. Ponadto, komórek krwi pępowinowej z CD34 + CD38 immunofenotypu będzie proliferacji w odpowiedzi na stymulację cytokiny (IL-3, IL-6, G-CSF) i powtórnie 7 razy więcej kolonii w hodowlach w dłuższym okresie niż komórek szpiku kostnego.

Banki komórek macierzystych krwi pępowinowej

Dla prawidłowego rozwoju nowej dziedziny medycyny praktycznej - transplantacji komórek macierzystych krwi pępowinowej, a także do przeprowadzenia transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych szpiku kostnego, trzeba mieć rozległą sieć banków krwi, które są już ustanowione w Stanach Zjednoczonych i Europie. Wewnętrzne sieci banków krwi pępowinowej są zjednoczone przez Stowarzyszenie Netcord Banks. Celowość stworzenia międzynarodowego stowarzyszenia banków krwi pępowinowej jest zdeterminowana faktem, że do przeprowadzenia niepowiązanych przeszczepów niezbędna jest duża liczba próbek pępowiny, co pozwala na wybranie identycznego donora HLA. Jedynie ustanowienie systemu banków z przechowywaniem próbek krwi różnych typów HLA może naprawdę rozwiązać problem znalezienia potrzebnego dawcy. Organizacja takiego systemu banków krwi pępowinowej wymaga wstępnego opracowania norm etycznych i prawnych, które są obecnie omawiane na poziomie międzynarodowym.

Aby utworzyć banki krwi pępowinowej na Ukrainie, konieczne jest opracowanie szeregu przepisów i dokumentów.

Przede wszystkim są to kwestie standaryzacji metod pobierania próbek, frakcjonowania i zamrażania krwi pępowinowej. Konieczne jest uregulowanie zasad pobierania krwi pępowinowej w szpitalach położniczych zgodnie z wymaganiami etyki lekarskiej, w celu ustalenia minimalnej ilości krwi pępowinowej, która zapewni pomyślny przeszczep. Powinno to być porównane i standaryzacji różnych kryteriów oceny jakości i ilości krwiotwórczych komórek prekursorowych oraz metody HLA typowania i metody diagnozy chorób genetycznych i zakaźnych, które mogą być przenoszone przez infuzję komórek krwi pępowinowej określone ogólne kryteria wyboru zdrowych dawców. Warto także omówić stworzenie osobnych urządzeń do przechowywania surowicy, komórek i DNA pochodzących z krwi pępowinowej.

Konieczne jest zorganizowanie komputerowej sieci danych dotyczących krwi pępowinowej w celu wdrożenia relacji z rejestrami dawców szpiku kostnego. Aby dalej rozwijać transplantologię komórek, należy opracować specjalne protokoły do porównywania wyników krwi pępowinowej i przeszczepu szpiku od krewnych identycznych z HLA i niepowiązanych dawców. W rozwiązywaniu etycznych i prawnych problemów klinicznego zastosowania komórek pępowinowych pomocne może być standaryzacja dokumentacji, w tym świadomej zgody rodziców oraz powiadamianie matki lub krewnych o genetycznych i / lub zakaźnych chorobach dziecka.

Decydującym warunkiem rozwoju transplantacji komórek na Ukrainie będzie przyjęcie Narodowego Programu dawstwa komórek macierzystych oraz rozwój międzynarodowej współpracy z innymi krajami poprzez Światowego Związku szpiku dawca kości (WMDA) program szpiku dawca kości Narodowe USA (NMDP) i innych rejestrów.

Uogólniając jeszcze krótką historię krwiotwórczych komórek macierzystych z krwi pępowinowej, możemy zauważyć, że pierwsze założenie o możliwości zastosowania klinicznego z krwi pępowinowej, wykonane na początku lat 70-tych, zostały potwierdzone w ciągu 80 lat wyniki badań doświadczalnych na zwierzętach, a w 1988 roku roku został przeprowadzony pierwszy na świecie przeszczep krwiotwórczych komórek ludzkiej krwi pępowinowej, a następnie zaczął się rozwijać globalną sieć banków krwi pępowinowej. Po 10 latach Liczba pacjentów z przeszczepem komórek krwiotwórczych, krwi pępowinowej bliżej do 800. Spośród nich u pacjentów z rozmaitymi chorobami nowotworowymi (białaczka, chłoniaki, guzy lite) i niemających nowotworu (wrodzonym niedoborem odporności, niedokrwistości, chorób związanych z zaburzeniami metabolicznymi) naturze.

W krwi pępowinowej zawartość wczesnych i zaangażowanych komórek progenitorowych jest wyższa niż we krwi obwodowej osoby dorosłej. Dzięki liczbie jednostek tworzących kolonie granulocytowo-makrofagowe i ich potencjałowi proliferacyjnemu, krew pępowinowa znacznie przekracza krew obwodową dorosłych nawet po wprowadzeniu czynników wzrostu. W długookresowych hodowlach komórkowych in vitro stwierdzono większą aktywność proliferacyjną i żywotność komórek krwi pępowinowej niż komórek szpiku kostnego. Krytyczne momenty w transplantacji komórek macierzystych krwi pępowinowej są krwiotwórcze potencjalnej liczby komórek jądrzastych, a obecność infekcji wirusem cytomegalii, HLA-kompatybilnego dawcy i biorcy, ciężar ciała i wiek pacjenta.

Niemniej jednak, przeszczep komórek macierzystych krwi pępowinowej należy uznać za alternatywę dla przeszczepu szpiku kostnego w celu leczenia ciężkich chorób krwi, zwłaszcza u dzieci. Problemy kliniczne transplantacji komórek krwi pępowinowej stopniowo rozwiązane - nie są już bardzo wydajnych technik próbkowania, rozdzielanie i kriokonserwacji komórek krwi pępowinowej, pod warunkiem, że warunki do tworzenia banków krwi pępowinowej, metody badań są lepsze komórki jądrzaste. Optymalny do separacji z dużą ilością krwiotwórczych komórek macierzystych krwi pępowinowej podczas tworzenia banków należy uznać za 3% roztwór żelatyny i 6% roztwór hydroksyetyloskrobi.

Perehrestenko P. I inni (2001) słusznie zauważyć, że przeszczep komórek macierzystych krwi pępowinowej powinny prawowitego się w złożonych środków terapeutycznych do pokonania depresji hematopoezy różnego pochodzenia, GSK przewód krwi różnią się szereg istotnych zalet, z których ważna jest względna łatwość zbiorze nie ma ryzyka dla dawcy, niskiego zanieczyszczenia noworodkowych komórek z wirusami i stosunkowo niski koszt przeszczepu. Niektórzy autorzy wskazują, że przeszczep komórek krwi pępowinowej rzadziej niż komórki szpiku kostnego towarzyszą komplikacje związane z reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi”, co jest spowodowane, ich zdaniem słabą ekspresję w komórkach krwi pępowinowej antygenów HLA-DR i ich niedojrzałość. Tym niemniej główny populacji jądrzastych komórek krwi pępowinowej są limfocyty T (komórki SDZ-dodatnie), której zawartość wynosi około 50%, czyli 20% mniej niż w krwi obwodowej u dorosłego, ale różnice fenotypowe subpopulacji komórek T z tych źródła są znikome.

Wśród czynników, które bezpośrednio wpływają na przeżywalność przeszczepu komórek macierzystych z krwi pępowinowej, powinniśmy zwrócić uwagę na wiek chorych (najlepsze wyniki są widoczne u biorców w wieku do 5 lat), wczesnego diagnozowania choroby i formę białaczki (wydajność jest znacznie wyższa w ostrej białaczce). Duże znaczenie ma dawka jądrzastych komórek krwi pępowinowej, a także ich kompatybilność z HLA u biorcy. Nie jest analiza wypadek skuteczności klinicznej transplantacji krwi pępowinowej GSK w onkologii i hematologii pokazuje najlepsze wyniki leczenia przy użyciu podobnych przeszczepów: jeden rok przeżycia bez choroby w tym przypadku sięga 63%, podczas gdy niepowiązanych transplantacji - tylko 29%.

Tak więc, obecność dużej liczby komórek macierzystych we krwi pępowinowej i wysokiej zdolności repopulyatsionnaya noworodków krwiotwórczych komórek macierzystych, by nadawały się do allogenicznego przeszczepu u pacjentów z nowotworami układu krwiotwórczego. Należy jednak pamiętać, że podsumowanie hematopoezy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych z krwi pępowinowej „jest rozciągnięta w czasie”: przywrócenie zawartość granulocytów obojętnochłonnych krwi obwodowej występuje zwykle pod koniec 6 tygodnia, a trombocytopenia zjawisko zniknie, zwykle po 6 miesiącach. Ponadto niedojrzałe krwiotwórcze komórki krwi pępowinowej nie wyklucza konfliktu immunologicznej: ciężki przebieg ostrych i przewlekłych reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi” obserwowanego odpowiednio w 23 i 25% biorców. Nawroty ostrej białaczki pod koniec pierwszego roku po transplantacji komórek krwi pępowinowej odnotowano w 26% przypadków.

[10], [11]