Komórki macierzyste i regeneracyjna medycyna plastyczna

Dziś niewielu praktykujących lekarzy nie wie o rozwoju nowego kierunku w leczeniu najcięższych chorób, dotychczas nieuleczalnych przez medycynę tradycyjną i alternatywną. Mowa o medycynie regeneracyjno-plastycznej, opartej na wykorzystaniu potencjału regeneracyjnego komórek macierzystych. Wokół rozwijającego się kierunku, w dużej mierze stworzonego dzięki informacyjnym hiperbolom World Wide Web, narosła bezprecedensowa dyskusja naukowa i pseudonaukowy szum. W bardzo krótkim czasie badania laboratoryjne nad terapeutycznymi możliwościami komórek macierzystych wyszły poza eksperyment i zaczęły być aktywnie wprowadzane do medycyny praktycznej, co wywołało szereg problemów o charakterze naukowym, etycznym, religijnym, prawnym i ustawodawczym. Instytucje państwowe i publiczne wyraźnie okazały się nieprzygotowane na szybkość przejścia komórek macierzystych z płytek Petriego do systemów do podawania dożylnego, co nie jest korzystne ani dla całego społeczeństwa, ani dla konkretnej cierpiącej osoby. Niełatwo jest zrozumieć niewyobrażalną ilość informacji na temat możliwości komórek macierzystych, zarówno pod względem ilościowym, jak i jakościowym, nawet dla specjalistów (których nie ma, bo wszyscy próbują samodzielnie opanować nowe trendy naukowe), nie wspominając już o lekarzach, którzy nie zajmują się bezpośrednio regeneracyjną medycyną plastyczną.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Dlaczego takie eksperymenty są potrzebne i czy w ogóle są potrzebne?

Na pierwszy rzut oka tworzenie komórkowych chimer międzygatunkowych jest owocem nieokiełznanej fantazji fanatycznego naukowca, który zapomniał o bioetyce. Jednak to właśnie to podejście znacznie poszerzyło naszą podstawową wiedzę na temat embriogenezy, ponieważ umożliwiło obliczenie liczby komórek niezbędnych do organogenezy (tworzenia wątroby, mózgu, skóry i narządów układu odpornościowego). Ponadto (być może to jest najważniejsze w biologii ESC) genetycy otrzymali do dyspozycji unikalne narzędzie, za pomocą którego można ustalić cel funkcjonalny genów podczas chimeryzacji zarodków. Najpierw stosuje się specjalną technikę podwójnego knockoutu, aby „wyłączyć” badaną parę genów w ESC. Następnie takie ESC wprowadza się do blastocysty i monitoruje się zmiany zachodzące w ciele rozwijającego się chimerycznego zarodka. W ten sposób ustalono funkcje genów sf-1 (rozwój nadnerczy i narządów płciowych), urt-l (zawiązek nerki), muoD (rozwój mięśni szkieletowych), gata-l-4 (zawiązek erytropoezy i limfopoezy). Ponadto ludzkie geny, które nie zostały jeszcze zbadane, mogą zostać wprowadzone (transfekowane) do ESC zwierząt laboratoryjnych w celu określenia ich funkcji przy użyciu chimerycznego zarodka.

Ale z reguły uzasadnienie eksperymentu poprzez uzyskanie nowej podstawowej wiedzy nie znajduje poparcia u szerokiego grona odbiorców. Podajmy przykład znaczenia chimeryzacji przy użyciu ESC. Przede wszystkim jest to ksenotransplantacja, czyli przeszczepianie narządów zwierzęcych ludziom. Teoretycznie tworzenie chimer komórek ludzko-świńskich pozwala uzyskać zwierzę, które jest znacznie bliższe pod względem cech antygenowych dawcy ESC, co w różnych sytuacjach klinicznych (cukrzyca, marskość wątroby) może uratować życie chorej osobie. Co prawda, w tym celu musimy najpierw nauczyć się, jak przywrócić genom dojrzałej komórki somatycznej właściwość totipotencji, po czym można ją wprowadzić do rozwijającego się zarodka świni.

Obecnie zdolność ESC do niemal nieskończonego dzielenia się w specjalnych warunkach hodowli jest wykorzystywana do produkcji masy komórkowej totipotencjalnej z jej późniejszym różnicowaniem w wyspecjalizowane komórki, takie jak neurony dopaminergiczne, które są następnie przeszczepiane pacjentowi z chorobą Parkinsona. W tym przypadku przeszczepowi koniecznie poprzedza ukierunkowane różnicowanie uzyskanej masy komórkowej w wyspecjalizowane komórki potrzebne do leczenia i oczyszczania tych ostatnich z niezróżnicowanych elementów komórkowych.

Jak się później okazało, zagrożenie karcynogenezą nie było jedyną przeszkodą w transplantacji komórek. Spontanicznie, ESC w ciałach embrionalnych różnicują się heterogenicznie, to znaczy tworzą pochodne szerokiej gamy linii komórkowych (neurony, keratynocyty, fibroblasty, endoteliocyty). W polu widzenia mikroskopu w tym przypadku kardiomiocyty wyróżniają się wśród komórek o różnych fenotypach, z których każda kurczy się we własnym rytmie. Jednak do leczenia pacjenta konieczne jest posiadanie czystych populacji komórek: neuronów - w przypadku udaru, kardiomiocytów - w przypadku zawału mięśnia sercowego, komórek β trzustki - w przypadku cukrzycy, keratynocytów - w przypadku oparzeń itp.

Kolejny etap rozwoju transplantologii komórkowej wiązał się z opracowaniem technologii umożliwiających uzyskanie wystarczającej liczby (milionów komórek) takich czystych populacji komórkowych. Poszukiwanie czynników powodujących ukierunkowane różnicowanie ESC miało charakter empiryczny, ponieważ sekwencja ich syntezy podczas embriogenezy pozostawała nieznana. Początkowo ustalono, że tworzenie woreczka żółtkowego jest indukowane przez dodanie cAMP i kwasu retinowego do hodowli ESC. Linie komórek hematopoetycznych powstawały w obecności 1L-3, SCF, czynnika wzrostu fibroblastów (FGH), insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-1), 1L-6 i czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-СSF) w podłożu hodowlanym. Komórki układu nerwowego powstawały z ESC po usunięciu LIF i warstwy fibroblastów, która pełniła funkcję podajnika. Po leczeniu kwasem retinowym w obecności surowicy płodowej, ESC zaczęły różnicować się w neurony, a kardiomiocyty uzyskano przez dodanie dimetylosulfotlenku (DMSO), który zapewnia ukierunkowane dostarczanie hydrofobowych cząsteczek sygnałowych do jądra komórkowego. W tym przypadku akumulacja aktywnych form tlenu w podłożu hodowlanym, a także stymulacja elektryczna, przyczyniły się do powstania dojrzałych kurczliwych kardiomiocytów.

Ogromne wysiłki i zasoby zostały poświęcone na znalezienie warunków do różnicowania ESC w komórki produkujące insulinę trzustki. Jednak wkrótce stało się jasne, że szereg wyspecjalizowanych linii komórkowych (komórki β trzustki, komórki odpornościowe i endokrynologiczne, adipocyty) nie powstaje z ESC, gdy są stymulowane zgodnie z zasadą „jeden czynnik stymulujący – jedna linia komórkowa”. Zasada ta okazała się ważna tylko dla ograniczonej liczby linii komórkowych. W szczególności powstawanie neuronów może być indukowane przez kwas retinowy, linia komórek mięśniowych – przez transformujący czynnik wzrostu-β (TCP-β), linie erytrocytowe – 1L-6, linia monocytowo-mieloidalna – 1L-3. Ponadto wpływ tych czynników na różnicowanie ESC okazał się ściśle zależny od dawki.

Rozpoczął się etap poszukiwania kombinacji czynników wzrostu, które przesunęłyby ESC do późniejszych stadiów embriogenezy z utworzeniem mezodermy (źródła kardiomiocytów, mięśni szkieletowych, nabłonka kanalików nerkowych, mieloerytropoezy i komórek mięśni gładkich), ektodermy (naskórka, neuronów, siatkówki) i endodermy (nabłonka jelita cienkiego i gruczołów wydzielniczych, pneumocytów). Natura zdawała się zmuszać badaczy do podążania ścieżką embriogenezy, powtarzając jej etapy na szalce Petriego, nie dając możliwości natychmiastowego i łatwego uzyskania pożądanego rezultatu. I takie kombinacje czynników wzrostu znaleziono. Aktywina A w połączeniu z TGF-β okazała się silnym stymulatorem powstawania komórek mezodermalnych z ESC, blokując jednocześnie rozwój endodermy i ektodermy. Kwas retinowy i połączenie białka morfogenetycznego szpiku kostnego (BMP-4) i sygnałów czynnika wzrostu naskórka (EGF) aktywują powstawanie komórek ekto- i mezodermy, zatrzymując rozwój endodermy. Intensywny wzrost komórek wszystkich trzech warstw zarodkowych jest obserwowany przy jednoczesnym działaniu dwóch czynników na ESC - czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) i czynnika wzrostu komórek nerwowych.

Tak więc, aby uzyskać niezbędne linie komórkowe, konieczne jest najpierw przeniesienie komórek macierzystych zarodka do etapu formowania komórek jakiejś warstwy zarodkowej, a następnie wybranie nowej kombinacji czynników wzrostu, zdolnej do wywołania ukierunkowanego różnicowania ekto-, mezo- i endodermy w wyspecjalizowane komórki niezbędne do przeszczepu pacjentowi. Liczba kombinacji czynników wzrostu dzisiaj sięga tysięcy, większość z nich jest opatentowana, niektóre w ogóle nie są ujawniane przez firmy biotechnologiczne.

Nadszedł czas na oczyszczenie uzyskanych komórek z niezróżnicowanych zanieczyszczeń komórkowych. Komórki zróżnicowane w hodowli zostały oznaczone markerami dojrzałych linii komórkowych i przepuszczone przez szybki laserowy sorter immunofenotypowy. Wiązka lasera znalazła je w ogólnym przepływie komórkowym i skierowała je na odrębną ścieżkę. Zwierzęta laboratoryjne jako pierwsze otrzymały uzyskany oczyszczony materiał komórkowy. Nadszedł czas na ocenę skuteczności stosowania pochodnych ESC w modelach chorób i procesów patologicznych. Jednym z takich modeli była eksperymentalna choroba Parkinsona, która jest dobrze odtwarzana u zwierząt przy użyciu związków chemicznych niszczących neurony dopaminergiczne. Ponieważ choroba u ludzi opiera się na nabytym niedoborze neuronów dopaminergicznych, zastosowanie terapii zastępczej komórek w tym przypadku było uzasadnione patogenetycznie. U zwierząt z eksperymentalnym hemiparkinsonizmem zakorzeniła się około połowa neuronów dopaminergicznych uzyskanych z ESC i wprowadzonych do struktur mózgu. To wystarczyło, aby znacznie zmniejszyć objawy kliniczne choroby. Próby przywrócenia funkcji uszkodzonych struktur ośrodkowego układu nerwowego w wyniku udarów, urazów, a nawet pęknięć rdzenia kręgowego okazały się bardzo skuteczne.

Należy jednak zauważyć, że niemal wszystkie przypadki udanego wykorzystania zróżnicowanych pochodnych ESC do korekty patologii eksperymentalnej przeprowadzono w ostrym okresie symulowanej sytuacji patologicznej. Wyniki leczenia zdalnego nie były tak pocieszające: po 8-16 miesiącach pozytywny efekt przeszczepu komórek zniknął lub gwałtownie spadł. Powody tego są dość jasne. Różnicowanie przeszczepionych komórek in vitro lub in loco morbi nieuchronnie prowadzi do ekspresji komórkowych markerów obcości genetycznej, co prowokuje atak immunologiczny ze strony organizmu biorcy. Aby rozwiązać problem niezgodności immunologicznej, zastosowano tradycyjną immunosupresję, równolegle z którą badania kliniczne zaczęły realizować potencjał transdyferencjacji i korekty genetycznej autologicznych komórek macierzystych hematopoetycznych i mezenchymalnych, które nie powodują konfliktu immunologicznego.

Czym jest regeneracyjna medycyna plastyczna?

Ewolucja określiła dwie główne opcje zakończenia życia komórki - martwicę i apoptozę, które na poziomie tkankowym odpowiadają procesom proliferacji i regeneracji. Proliferację można uznać za rodzaj poświęcenia, gdy wypełnienie ubytku uszkodzonej tkanki następuje w wyniku jej zastąpienia elementami tkanki łącznej: przy zachowaniu integralności strukturalnej organizm częściowo traci funkcję dotkniętego narządu, co determinuje późniejszy rozwój reakcji kompensacyjnych z przerostem lub przerostem elementów strukturalnych i funkcjonalnych, które pozostają nienaruszone. Czas trwania okresu kompensacji zależy od objętości uszkodzeń strukturalnych wywołanych czynnikami pierwotnej i wtórnej zmiany, po czym w zdecydowanej większości przypadków następuje dekompensacja, gwałtowne pogorszenie jakości i skrócenie czasu trwania życia człowieka. Fizjologiczna regeneracja zapewnia procesy przebudowy, czyli zastąpienie starzejących się i obumierających komórek przez mechanizmy naturalnej śmierci komórkowej (apoptozy) nowymi pochodzącymi z rezerw komórek macierzystych organizmu człowieka. Procesy regeneracji naprawczej angażują również zasoby komórkowe przestrzeni macierzystych, które jednak są mobilizowane w stanach patologicznych związanych z chorobą lub uszkodzeniem tkanek, co inicjuje śmierć komórek poprzez mechanizmy martwicy.

Duża uwaga naukowców, lekarzy, prasy, telewizji i opinii publicznej na problem badania biologii komórek macierzystych zarodka (ESC) wynika przede wszystkim z wysokiego potencjału terapii komórkowej lub, jak ją nazywamy, regeneracyjno-plastycznej. Rozwój metod leczenia najcięższych chorób człowieka (degeneracyjna patologia ośrodkowego układu nerwowego, urazy rdzenia kręgowego i mózgu, choroby Alzheimera i Parkinsona, stwardnienie rozsiane, zawał mięśnia sercowego, nadciśnienie tętnicze, cukrzyca, choroby autoimmunologiczne i białaczka, choroba oparzeniowa i procesy nowotworowe stanowią daleką od pełnej listę) opiera się na unikalnych właściwościach komórek macierzystych, które pozwalają na tworzenie nowych tkanek w celu zastąpienia, jak wcześniej sądzono, nieodwracalnie uszkodzonych obszarów tkanek chorego organizmu.

Postęp teoretycznych badań nad biologią komórek macierzystych w ciągu ostatnich 10 lat został zrealizowany przez spontanicznie pojawiające się obszary powstającej medycyny regeneracyjno-plastycznej, której metodologia nie tylko jest w pełni podatna na systematyzację, ale i wymaga jej. Pierwszym i najszybciej rozwijającym się obszarem praktycznego wykorzystania potencjału regeneracyjnego komórek macierzystych stała się zastępcza terapia regeneracyjno-plastyczna. Jej droga jest dość łatwo prześledzona w literaturze naukowej - od eksperymentów na zwierzętach z martwicą mięśnia sercowego do prac ostatnich lat ukierunkowanych na przywrócenie po zawale niedoboru kardiomiocytów lub uzupełnienie utraty komórek β trzustki i neuronów dopaminergicznych ośrodkowego układu nerwowego.

Transplantacja komórek

Podstawą medycyny substytucyjnej regeneratywno-plastycznej jest transplantacja komórek. Tę ostatnią należy zdefiniować jako zespół zabiegów medycznych, podczas których organizm pacjenta ma bezpośredni kontakt z żywymi komórkami pochodzenia auto-, allo-, izo- lub ksenogenicznego przez krótki lub długi okres czasu. Środkiem transplantacji komórek jest zawiesina komórek macierzystych lub ich pochodnych, standaryzowana liczbą jednostek transplantacyjnych. Jednostka transplantacyjna to stosunek liczby jednostek tworzących kolonie w hodowli do całkowitej liczby przeszczepionych komórek. Metody transplantacji komórek: dożylne, dootrzewnowe, podskórne podanie zawiesiny komórek macierzystych lub ich pochodnych; podanie zawiesiny komórek macierzystych lub ich pochodnych do komór mózgu, naczyń limfatycznych lub płynu mózgowo-rdzeniowego.

Allo- i autologiczne przeszczepianie komórek wykorzystuje dwa zasadniczo różne podejścia metodyczne do realizacji pluri-, multi- lub polipotencjalnego potencjału komórek macierzystych - in vivo lub in vitro. W pierwszym przypadku wprowadzanie komórek macierzystych do organizmu pacjenta odbywa się bez ich wstępnego różnicowania, w drugim - po rozmnożeniu w hodowli, ukierunkowanym różnicowaniu i oczyszczeniu z niezróżnicowanych elementów. Spośród licznych technik metodycznych terapii komórkowej zastępczej dość wyraźnie wyróżnia się trzy grupy metod: zastępowanie szpiku kostnego i komórek krwi, zastępowanie komórek narządów i tkanek miękkich, zastępowanie sztywnych i stałych elementów organizmu (chrząstki, kości, ścięgien, zastawek serca i naczyń pojemnościowych). Ten ostatni kierunek należy określić jako medycynę rekonstrukcyjną i regeneracyjną, ponieważ potencjał różnicowania komórek macierzystych realizowany jest na matrycy - biologicznie obojętnej lub wchłanialnej strukturze ukształtowanej jak zastępowany obszar ciała.

Innym sposobem zwiększenia intensywności procesów regeneracyjno-plastycznych w uszkodzonych tkankach jest mobilizacja własnych zasobów macierzystych pacjenta poprzez wykorzystanie zewnętrznych czynników wzrostu, takich jak czynniki stymulujące kolonie granulocytów i granulocytów-makrofagów. W tym przypadku zerwanie połączeń podścieliska prowadzi do zwiększenia uwalniania do ogólnego krwiobiegu komórek macierzystych hematopoezy, które w obszarze uszkodzenia tkanek zapewniają procesy regeneracji ze względu na swoją wrodzoną plastyczność.

Metody medycyny regeneracyjnej ukierunkowane są zatem na stymulację procesów przywracania utraconych funkcji – bądź to poprzez mobilizację własnych rezerw macierzystych pacjenta, bądź poprzez wprowadzenie allogenicznego materiału komórkowego.

Ważnym praktycznym rezultatem odkrycia komórek macierzystych zarodka jest klonowanie terapeutyczne oparte na zrozumieniu czynników wyzwalających embriogenezę. Jeśli początkowym sygnałem do rozpoczęcia embriogenezy jest kompleks pre-mRNA zlokalizowany w cytoplazmie oocytu, to wprowadzenie jądra dowolnej komórki somatycznej do enukleowanego jaja powinno uruchomić program rozwoju zarodka. Dziś już wiemy, że w realizacji programu embriogenezy uczestniczy około 15 000 genów. Co dzieje się z nimi później, po urodzeniu, w okresach wzrostu, dojrzewania i starzenia? Odpowiedź na to pytanie dała owca Dolly: są konserwowane. Stosując najnowocześniejsze metody badawcze, udowodniono, że jądra komórek dorosłych zachowują wszystkie kody niezbędne do formowania komórek macierzystych zarodka, warstw zarodkowych, organogenezy i dojrzewania restrykcyjnego (wyjście do różnicowania i specjalizacji) linii komórkowych pochodzenia mezenchymalnego, ekto-, endo- i mezodermalnego. Klonowanie terapeutyczne jako kierunek rozwoju ukształtowało się już na wczesnych etapach rozwoju transplantologii komórkowej i zakłada przywrócenie totipotencji własnym komórkom somatycznym pacjenta w celu uzyskania genetycznie identycznego materiału przeszczepowego.

Odkrycie komórek macierzystych rozpoczęło się „od końca”, ponieważ termin wprowadzony do biologii i medycyny przez A. Maksimowa odnosił się do komórek macierzystych szpiku kostnego, które dają początek wszystkim dojrzałym elementom komórkowym krwi obwodowej. Jednak komórki macierzyste układu krwiotwórczego, podobnie jak komórki wszystkich tkanek dorosłego organizmu, mają również swojego własnego, mniej zróżnicowanego poprzednika. Wspólnym źródłem absolutnie wszystkich komórek somatycznych jest komórka macierzysta zarodka. Należy zauważyć, że pojęcia „komórki macierzyste zarodka” i „komórki macierzyste zarodka” nie są w żadnym wypadku identyczne. Komórki macierzyste zarodka zostały wyizolowane przez J. Thomsona z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty i przeniesione do długowiecznych linii komórkowych. Tylko te komórki mają faksymile „ESC”. Leroy Stevens, który odkrył komórki macierzyste zarodka w eksperymentach na myszach, nazwał je „embrionalnymi pluripotentnymi komórkami macierzystymi”, odnosząc się do zdolności ESC do różnicowania się w pochodne wszystkich trzech warstw zarodkowych (ekto-, mezo- i endodermy). Jednakże wszystkie komórki zarodka w późniejszych stadiach rozwoju są również komórkami macierzystymi, ponieważ dają początek ogromnej liczbie komórek, które tworzą ciało dorosłego. Aby je zdefiniować, proponujemy termin „embrionalne pluripotentne komórki progenitorowe”.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Rodzaje komórek macierzystych

Współczesna klasyfikacja komórek macierzystych opiera się na zasadzie ich podziału według zdolności (potencji) do dawania początku liniom komórkowym, które są definiowane jako toti-, pluri-, multi-, poli-, bi- i unipotencja. Totipotencja, czyli zdolność do odtworzenia genetycznie zaprogramowanego organizmu jako całości, posiadają komórki zygotyczne, blastomery i komórki macierzyste zarodka (komórki masy wewnętrznej blastocysty). Inną grupę komórek totipotentnych, które powstają na późniejszych etapach rozwoju embrionalnego, reprezentują pierwotne komórki rozrodcze strefy genitalnej zarodka (guzki płciowe). Pluripotencja, czyli zdolność do różnicowania się w komórki dowolnego organu lub tkanki, jest inherentna dla komórek zarodkowych trzech warstw zarodkowych - ekto-, mezo- i endodermy. Uważa się, że multipotencja, czyli zdolność do tworzenia dowolnych komórek w obrębie jednej wyspecjalizowanej linii, jest charakterystyczna tylko dla dwóch typów komórek: tzw. komórek macierzystych mezenchymalnych, które powstają w grzebieniach nerwowych i są prekursorami wszystkich komórek tkanki łącznej podstawowej organizmu, w tym komórek glejowych, a także hematopoetycznych komórek macierzystych hematopoetycznych, które dają początek wszystkim liniom komórek krwi. Ponadto wyróżnia się komórki macierzyste bi- i unipotentne, w szczególności komórki prekursorowe mieloidalnych, limfoidalnych, monocytowych i megakariocytarnych kiełków hematopoetycznych. Istnienie komórek macierzystych unipotentnych zostało jednoznacznie udowodnione na przykładzie komórek wątroby - utrata znacznej części tkanki wątroby jest rekompensowana przez intensywny podział zróżnicowanych poliploidalnych hepatocytów.

Podczas rozwoju wszystkie narządy i tkanki powstają w wyniku proliferacji i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej blastocysty, której komórki są w ścisłym tego słowa znaczeniu totipotencjalnymi komórkami macierzystymi zarodka. Pierwsze prace nad izolacją komórek macierzystych zarodka przeprowadził Evans, który wykazał, że blastocysty wszczepione do mózgu myszy dają początek potworniakom, których komórki po sklonowaniu tworzą linie pluripotentnych komórek macierzystych zarodka (oryginalna nazwa tych komórek - komórki raka zarodka lub w skrócie ECС - nie jest obecnie używana). Dane te zostały potwierdzone w szeregu innych badań, w których komórki macierzyste zarodka uzyskano poprzez hodowlę komórek blastocysty myszy i innych gatunków zwierząt, a także ludzi.

W ostatnich latach w literaturze coraz częściej mówi się o plastyczności komórek macierzystych, którą uważa się nie tylko za zdolność tych ostatnich do różnicowania się w różne typy komórek na różnych etapach rozwoju, ale także do przechodzenia dedyferencjacji (transdyferencjacji, retrodyferencjacji). Oznacza to, że dopuszcza się zasadniczą możliwość powrotu zróżnicowanej komórki somatycznej do etapu rozwoju embrionalnego z rekapitulacją (powrotem) pluripotencji i jej realizacji w powtórnym różnicowaniu z formowaniem komórek innego typu. W szczególności donosi się, że komórki macierzyste układu krwiotwórczego są zdolne do transdyferencjacji z formowaniem hepatocytów, kardiomioblastów i śródbłonków.

Trwają naukowe debaty na temat podziału komórek macierzystych ze względu na ich plastyczność, tzn. opracowywana jest terminologia i słownik pojęć dotyczących transplantacji komórek, co ma bezpośrednie znaczenie praktyczne, gdyż większość metod regeneracyjnej medycyny plastycznej opiera się na wykorzystaniu właściwości plastycznych i zdolności komórek macierzystych do różnicowania się w różne linie komórkowe.

Liczba publikacji w dziedzinie podstawowych i stosowanych problemów medycyny regeneracyjno-plastycznej gwałtownie rośnie. Przedstawiono już szereg różnych podejść metodologicznych ukierunkowanych na jak najbardziej optymalne wykorzystanie potencjału regeneracyjno-plastycznego komórek macierzystych. Kardiolodzy i endokrynolodzy, neurolodzy i neurochirurdzy, transplantolodzy i hematolodzy zidentyfikowali obszary swoich pilnych zainteresowań. Okuliści, ftyzjolodzy, pulmonolodzy, nefrolodzy, onkolodzy, genetycy, pediatrzy, gastroenterolodzy, terapeuci i pediatrzy, chirurdzy i położnicy-ginekolodzy poszukują rozwiązania palących problemów w zakresie możliwości plastycznych komórek macierzystych - wszyscy przedstawiciele współczesnej medycyny mają nadzieję na otrzymanie możliwości leczenia chorób, które wcześniej uważano za śmiertelne.

Czy przeszczep komórek będzie nowym „panem na całe zło”?

Pytanie to słusznie pojawia się u wszystkich myślących lekarzy i naukowców, którzy analizują obecny stan nauk medycznych. Sytuację komplikuje fakt, że po jednej stronie pola naukowej konfrontacji stoją „zdrowi konserwatyści”, po drugiej – „chorzy fanatycy” transplantologii komórkowej. Oczywiste jest, że prawda, jak zawsze, leży między nimi – na „ziemi niczyjej”. Nie poruszając kwestii prawa, etyki, religii i moralności, rozważmy zalety i wady wyznaczonych obszarów medycyny regeneratywno-plastycznej. „Lekki powiew” pierwszych doniesień naukowych na temat możliwości terapeutycznych ESC zamienił się w „burzliwy wiatr” rok po ich odkryciu, który w 2003 r. przerodził się w „tornado informacyjne”. Pierwszy cykl publikacji dotyczył zagadnień hodowli komórek macierzystych zarodków, ich reprodukcji i ukierunkowanego różnicowania in vitro.

Okazało się, że do nieograniczonej reprodukcji komórek macierzystych zarodka w hodowli konieczne jest ścisłe przestrzeganie szeregu warunków. W kondycjonowanym podłożu muszą być obecne trzy czynniki: interleukina-6 (IL-6), czynnik komórek macierzystych (SCF) i czynnik hamujący leukase (LIF). Ponadto komórki macierzyste zarodka muszą być hodowane na podłożu (warstwa odżywcza komórek) fibroblastów zarodkowych i w obecności surowicy cielęcej. Jeśli te warunki zostaną spełnione, ESC w hodowli rosną jako klony i tworzą ciała embrionalne - agregaty klonów zawiesinowych sferycznych komórek. Najważniejszą cechą klonu ESC jest to, że w hodowli ciało embrionalne przestaje rosnąć, gdy w agregacie gromadzi się 50-60, maksymalnie 100 komórek. W tym okresie następuje stan równowagi - tempo podziału komórek wewnątrz klonu jest równe tempu apoptozy (programowanej śmierci komórek) na jego obwodzie. Po osiągnięciu takiej dynamicznej równowagi komórki obwodowe ciała embrionalnego ulegają spontanicznemu różnicowaniu (zwykle z utworzeniem fragmentów endodermalnych woreczka żółtkowego, angioblastów i śródbłonków) z utratą totipotencji. Dlatego też, aby uzyskać wystarczającą ilość masy komórek totipotencjalnych, ciało embrionalne musi być co tydzień dezagregowane poprzez przeszczepienie pojedynczych komórek macierzystych zarodka do nowego podłoża odżywczego – jest to proces dość pracochłonny.

Odkrycie komórek macierzystych zarodka nie odpowiedziało na pytanie, co dokładnie i w jaki sposób uruchamia programy embriogenezy zaszyfrowane w DNA zygoty. Nadal niejasne jest, jak program genomu rozwija się w trakcie życia człowieka. Jednocześnie badanie komórek macierzystych zarodka pozwoliło na opracowanie koncepcji mechanizmów podtrzymywania toti-, pluri- i multipotencji komórek macierzystych podczas ich podziału. Główną cechą wyróżniającą komórkę macierzystą jest jej zdolność do samoreprodukcji. Oznacza to, że komórka macierzysta, w przeciwieństwie do komórki zróżnicowanej, dzieli się asymetrycznie: jedna z komórek potomnych daje początek wyspecjalizowanej linii komórkowej, a druga zachowuje toti-, pluri- lub multipotencję genomu. Nadal niejasne jest, dlaczego i w jaki sposób proces ten zachodzi na najwcześniejszych etapach embriogenezy, gdy dzieląca się wewnętrzna masa komórkowa blastocysty jest całkowicie totipotencjalna, a genom ESC znajduje się w stanie uśpienia (uśpienia, zahamowania). Jeśli podczas podziału zwykłej komórki proces duplikacji jest koniecznie poprzedzony aktywacją i ekspresją całego kompleksu genów, to podczas podziału ESC tak się nie dzieje. Odpowiedź na pytanie „dlaczego” uzyskano po odkryciu istniejącego wcześniej mRNA (pre-mRNA) w ESC, z których część powstaje w komórkach pęcherzykowych i jest przechowywana w cytoplazmie komórki jajowej i zygoty. Drugie odkrycie odpowiedziało na pytanie „jak”: w ESC odkryto specjalne enzymy zwane „edytami”. Edyty pełnią trzy ważne funkcje. Po pierwsze, zapewniają alternatywne epigenetyczne (bez udziału genomu) odczytanie i duplikację pre-mRNA. Po drugie, realizują proces aktywacji pre-mRNA (splicing - wycinanie intronów, czyli nieaktywnych odcinków RNA, które hamują proces syntezy białka na mRNA), po czym w komórce rozpoczyna się montaż cząsteczek białka. Po trzecie, editazy promują powstawanie wtórnych mRNA, które są represorami mechanizmów ekspresji genów, co utrzymuje gęste upakowanie chromatyny i nieaktywny stan genów. Produkty białkowe syntetyzowane na takich wtórnych mRNA i nazywane białkami wyciszającymi lub strażnikami genomu są obecne w ludzkich komórkach jajowych.

Tak przedstawia się dziś mechanizm powstawania nieśmiertelnych linii komórkowych komórek macierzystych zarodka. Mówiąc najprościej, sygnał do uruchomienia programu embriogenezy, którego początkowe etapy polegają na tworzeniu masy komórek totipotencjalnych, pochodzi z cytoplazmy komórki jajowej. Jeśli na tym etapie wewnętrzna masa komórkowa blastocysty, czyli ESC, zostanie odizolowana od dalszych sygnałów regulacyjnych, proces samoreprodukcji komórek zachodzi w cyklu zamkniętym bez udziału genów jądra komórkowego (epigenetycznie). Jeśli taka komórka zostanie zaopatrzona w materiał odżywczy i odizolowana od sygnałów zewnętrznych, które promują różnicowanie masy komórkowej, będzie się dzielić i rozmnażać w nieskończoność.

Pierwsze wyniki prób eksperymentalnych wykorzystania komórek totipotencjalnych do przeszczepów były dość imponujące: wprowadzenie embrionalnych komórek macierzystych do tkanek myszy z osłabionym immunosupresantami układem odpornościowym doprowadziło do rozwoju nowotworów w 100% przypadków. Wśród komórek nowotworu, których źródłem były ESC, znajdowały się zróżnicowane pochodne totipotencjalnego egzogennego materiału komórkowego, w szczególności neurony, ale wzrost potworniaków obniżył wartość uzyskanych wyników do zera. Jednocześnie w pracach L. Stevensa ESC wprowadzone do jamy brzusznej tworzyły duże agregaty, w których fragmentarycznie formowały się mięśnie embrionalne, serce, włosy, skóra, kości, mięśnie i tkanka nerwowa. (Chirurdzy, którzy otwierali torbiele skórzaste powinni być zaznajomieni z tym obrazkiem). Co ciekawe, zawieszone komórki embrionów myszy zachowują się dokładnie tak samo: ich wprowadzenie do tkanek dorosłych zwierząt z obniżoną odpornością zawsze powoduje powstawanie potworniaków. Jeśli jednak z takiego guza wyizoluje się czystą linię ESC i wprowadzi do jamy brzusznej, wówczas ponownie utworzą się wyspecjalizowane pochodne somatyczne wszystkich trzech listków zarodkowych bez oznak karcynogenezy.

Tak więc kolejnym problemem, który należało rozwiązać, było oczyszczenie materiału komórkowego z zanieczyszczeń niezróżnicowanych komórek. Jednak nawet przy bardzo wysokiej efektywności ukierunkowanego różnicowania komórkowego, do 20% komórek w hodowli zachowuje swój totipotencjalny potencjał, który in vivo, niestety, realizuje się w rozwoju guza. Kolejna „proca” natury – w skali ryzyka medycznego gwarancja wyzdrowienia pacjenta równoważy się z gwarancją jego śmierci.

Związek między komórkami nowotworowymi a embrionalnymi pluripotentnymi komórkami progenitorowymi (EPPC), które są bardziej zaawansowane w rozwoju niż ESC, jest dość niejednoznaczny. Wyniki naszych badań wykazały, że wprowadzenie EPPC do różnych przeszczepialnych nowotworów u szczurów może prowadzić do rozpadu tkanki nowotworowej (G), szybkiego wzrostu masy guza (D), jej zmniejszenia (E-3) lub nie wpływa na wielkość spontanicznej centralnej martwicy ogniskowej tkanki nowotworowej (I, K). Oczywiste jest, że wynik interakcji EPPC i komórek nowotworowych jest determinowany przez całkowity zestaw cytokin i czynników wzrostu wytwarzanych przez nie in vivo.

Warto zauważyć, że komórki macierzyste zarodka, reagujące karcynogenezą na kontakt z tkankami dorosłych, są doskonale asymilowane z masą komórkową zarodka, integrując się ze wszystkimi narządami zarodka. Takie chimery, składające się z własnych komórek zarodka i dawcy ESC, nazywane są zwierzętami allofenowymi, chociaż w rzeczywistości nie są chimerami fenotypowymi. Układ krwiotwórczy, skóra, tkanka nerwowa, wątroba i jelito cienkie ulegają maksymalnej chimeryzacji komórkowej, gdy ESC są wprowadzane do wczesnego zarodka. Opisano przypadki chimeryzacji narządów płciowych. Jedyną strefą nienaruszalną dla ESC są pierwotne komórki rozrodcze.

Oznacza to, że zarodek zachowuje informację genetyczną o swoich rodzicach, co chroni czystość i kontynuację zarówno rodzaju, jak i gatunku.

W warunkach blokady podziału komórek wczesnego zarodka za pomocą cytoklazyny, wprowadzenie komórek macierzystych zarodka do blastocysty prowadzi do rozwoju zarodka, którego pierwotne komórki rozrodcze, podobnie jak wszystkie inne, powstały z komórek macierzystych zarodka dawcy. Ale w tym przypadku sam zarodek jest całkowicie dawcą, genetycznie obcy organizmowi matki zastępczej. Mechanizmy takiego naturalnego zablokowania potencjału mieszania się własnej i obcej informacji dziedzicznej nie zostały jeszcze wyjaśnione. Można przypuszczać, że w tym przypadku realizowany jest program apoptozy, którego determinanty nie są nam jeszcze znane.

Należy zauważyć, że embriogeneza zwierząt różnych gatunków nigdy nie jest skoordynowana: podczas realizacji programu dawstwa organogenezy w ciele biorcy zarodka ksenogenicznych komórek macierzystych zarodka zarodek obumiera w macicy i ulega resorpcji. Dlatego istnienie chimer „szczur-mysz”, „świnia-krowa”, „człowiek-szczur” należy rozumieć jako mozaicyzm komórkowy, a nie morfologiczny. Innymi słowy, gdy ESC jednego gatunku ssaka są wprowadzane do blastocysty innego gatunku, zawsze rozwija się potomstwo gatunku matczynego, w którym wśród własnych komórek niemal wszystkich narządów znajdują się inkluzje, a czasem skupiska jednostek strukturalnych i funkcjonalnych składających się z genetycznie obcego materiału pochodnych ESC. Terminu „uczłowieczona świnia” nie można postrzegać jako określenia jakiegoś potwora obdarzonego inteligencją lub zewnętrznymi cechami człowieka. To po prostu zwierzę, którego część komórek pochodzi z ludzkich komórek macierzystych wprowadzonych do blastocysty świni.

Perspektywy wykorzystania komórek macierzystych

Od dawna wiadomo, że choroby związane z genopatologią komórek linii hematopoetycznej i limfoidalnej są często eliminowane po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Zastąpienie własnej tkanki hematopoetycznej genetycznie prawidłowymi komórkami od spokrewnionego dawcy prowadzi do częściowego, a czasem całkowitego wyzdrowienia pacjenta. Wśród chorób genetycznych leczonych allogenicznym przeszczepem szpiku kostnego warto zwrócić uwagę na zespół niedoboru odporności, agammaglobulinemię sprzężoną z chromosomem X, przewlekłą ziarniniakowatość, zespół Wiskotta-Aldricha, choroby Gauchera i Hurlera, adrenoleukodystrofię, leukodystrofię metachromatyczną, niedokrwistość sierpowatokrwinkową, talasemię, niedokrwistość Fanconiego i AIDS. Podstawowym problemem w stosowaniu allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego w leczeniu tych chorób jest dobór dawcy spokrewnionego, zgodnego pod względem HbA, do którego przeprowadzenia potrzebnych jest średnio 100 000 próbek typowanej tkanki krwiotwórczej dawcy.

Terapia genowa pozwala na korektę defektu genetycznego bezpośrednio w hematopoetycznych komórkach macierzystych pacjenta. Teoretycznie terapia genowa zapewnia te same korzyści w leczeniu chorób genetycznych układu krwiotwórczego, co allogeniczny przeszczep szpiku kostnego, ale bez wszystkich możliwych powikłań immunologicznych. Wymaga to jednak techniki, która pozwala na skuteczny transfer pełnoprawnego genu do hematopoetycznych komórek macierzystych i utrzymanie wymaganego poziomu jego ekspresji, który w niektórych typach patologii dziedzicznej może nie być bardzo wysoki. W takim przypadku nawet niewielkie uzupełnienie produktu białkowego wadliwego genu daje pozytywny efekt kliniczny. W szczególności w hemofilii B 10-20% prawidłowego poziomu czynnika IX jest w zupełności wystarczające do przywrócenia wewnętrznego mechanizmu krzepnięcia krwi. Modyfikacja genetyczna autologicznego materiału komórkowego okazała się skuteczna w eksperymentalnym hemiparkinsonizmie (jednostronne zniszczenie neuronów dopaminergicznych). Transfecja fibroblastów zarodkowych szczura wektorem retrowirusowym zawierającym gen hydroksylazy tyrozynowej zapewniła syntezę dopaminy w ośrodkowym układzie nerwowym: śródmózgowe podanie transfekowanych fibroblastów znacznie zmniejszyło intensywność objawów klinicznych doświadczalnego modelu choroby Parkinsona u zwierząt laboratoryjnych.

Perspektywa wykorzystania komórek macierzystych do terapii genowej chorób ludzkich postawiła przed klinicystami i eksperymentatorami wiele nowych wyzwań. Problematyczne aspekty terapii genowej są związane z opracowaniem bezpiecznego i skutecznego systemu transportu genów do komórki docelowej. Obecnie wydajność transferu genów do dużych komórek ssaków jest bardzo niska (1%). Metodycznie problem ten rozwiązuje się na różne sposoby. Transfer genów in vitro obejmuje transfeccję materiału genetycznego do komórek pacjenta w hodowli, a następnie ich powrót do organizmu pacjenta. Podejście to należy uznać za optymalne w przypadku stosowania genów wprowadzonych do komórek macierzystych szpiku kostnego, ponieważ metody transferu komórek hematopoetycznych z organizmu do hodowli i z powrotem są dobrze ugruntowane. Retrowirusy są najczęściej stosowane do transferu genów do komórek hematopoetycznych in vitro. Jednak większość komórek macierzystych hematopoetycznych znajduje się w stanie uśpienia, co komplikuje transport informacji genetycznej za pomocą retrowirusów i wymaga poszukiwania nowych sposobów skutecznego transportu genów do uśpionych komórek macierzystych. Obecnie stosuje się takie metody transferu genów jak transfeccja, bezpośrednia mikroiniekcja DNA do komórek, lipofekcja, elektroporacja, „gen gun”, mechaniczne sprzęganie za pomocą szklanych kulek, transfeccja hepatocytów z zależnym od receptora sprzęganiem DNA z asialoglikoproteiną oraz wprowadzanie transgenu w aerozolu do komórek nabłonka pęcherzyków płucnych. Skuteczność transferu DNA tymi metodami wynosi 10,0-0,01%. Innymi słowy, w zależności od metody wprowadzania informacji genetycznej, sukcesu można spodziewać się u 10 pacjentów na 100 lub u 1 pacjenta na 10 000 pacjentów. Oczywiste jest, że skuteczna i jednocześnie bezpieczna metoda transferu genów terapeutycznych musi jeszcze zostać opracowana.

Zasadniczo odmiennym rozwiązaniem problemu odrzucenia allogenicznego materiału komórkowego w transplantologii komórkowej jest zastosowanie wysokich dawek embrionalnych pluripotentnych komórek progenitorowych w celu uzyskania efektu ponownej instalacji układu kontroli homeostazy antygenowej dorosłego organizmu (efekt Kukharchuka-Radchenko-Sirmana), którego istota polega na indukcji tolerancji immunologicznej poprzez stworzenie nowej bazy komórek immunokompetentnych z jednoczesnym przeprogramowaniem układu kontroli homeostazy antygenowej. Po wprowadzeniu wysokich dawek EPPC te ostatnie utrwalają się w tkankach grasicy i szpiku kostnego. W grasicy EPPC pod wpływem specyficznego mikrośrodowiska różnicują się w komórki dendrytyczne, interdigitate i elementy nabłonkowo-podścieliskowe. Podczas różnicowania EPPC w grasicy biorcy, obok własnych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) biorcy, dochodzi do ekspresji cząsteczek MHC, które są uwarunkowane genetycznie w komórkach dawcy, tzn. ustala się podwójny standard cząsteczek MHC, według którego następuje pozytywna i negatywna selekcja limfocytów T.

W ten sposób odnowa ogniwa efektorowego układu odpornościowego biorcy następuje poprzez znane mechanizmy pozytywnej i negatywnej selekcji limfocytów T, ale poprzez podwójny standard cząsteczek MHC - EPPC biorcy i dawcy.

Przeprogramowanie układu odpornościowego za pomocą EPPC nie tylko umożliwia przeszczep komórek bez późniejszego długotrwałego stosowania leków immunosupresyjnych, ale także otwiera zupełnie nowe perspektywy w leczeniu chorób autoimmunologicznych i stanowi punkt zaczepienia dla rozwoju nowych idei dotyczących procesu starzenia się człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy starzenia się, zaproponowaliśmy teorię wyczerpywania się przestrzeni macierzystych organizmu. Zgodnie z głównym założeniem tej teorii starzenie się jest trwałym zmniejszeniem wielkości przestrzeni macierzystych organizmu, które są rozumiane jako pula regionalnych („dorosłych”) komórek macierzystych (komórek macierzystych mezenchymalnych, neuronalnych, hematopoetycznych, progenitorowych skóry, przewodu pokarmowego, nabłonka endokrynnego, komórek barwnikowych fałdów rzęskowych itp.), uzupełniających straty komórkowe odpowiedniej tkanki w procesie przebudowy organizmu. Przebudowa organizmu to odnowa składu komórkowego wszystkich tkanek i narządów dzięki komórkom przestrzeni macierzystej, która trwa przez całe życie organizmu wielokomórkowego. Liczba komórek w przestrzeniach macierzystych jest determinowana genetycznie, co determinuje ograniczoną wielkość (potencjał proliferacyjny) każdej przestrzeni macierzystej. Z kolei wielkość przestrzeni macierzystych determinuje tempo starzenia się poszczególnych organów, tkanek i układów organizmu. Po wyczerpaniu rezerw komórkowych przestrzeni macierzystych intensywność i tempo starzenia się organizmu wielokomórkowego są determinowane przez mechanizmy starzenia się zróżnicowanych komórek somatycznych w granicach Hayflicka.

Dlatego na etapie ontogenezy postnatalnej ekspansja przestrzeni macierzystych może nie tylko znacząco wydłużyć życie, ale także poprawić jego jakość poprzez przywrócenie potencjału przebudowy organizmu. Ekspansję przestrzeni macierzystych można osiągnąć poprzez wprowadzenie dużych dawek allogenicznych embrionalnych komórek progenitorowych pluripotentnych, pod warunkiem jednoczesnego przeprogramowania układu odpornościowego biorcy, co znacząco wydłuża życie starych myszy w eksperymencie.

Teoria wyczerpywania się przestrzeni macierzystych może zmienić dotychczasowe poglądy nie tylko na temat mechanizmów starzenia się, ale także na temat choroby, a także konsekwencji jej leczenia farmakologicznego. W szczególności choroba może rozwinąć się w wyniku patologii komórek przestrzeni macierzystych (onkopatologia). Wyczerpanie rezerwy komórek macierzystych mezenchymalnych zaburza procesy przebudowy tkanki łącznej, co prowadzi do pojawienia się zewnętrznych oznak starzenia (zmarszczek, wiotkości skóry, cellulitu). Wyczerpanie rezerwy macierzystej komórek śródbłonka powoduje rozwój nadciśnienia tętniczego i miażdżycy. Początkowo niewielki rozmiar przestrzeni macierzystej grasicy determinuje jej wczesną trwałą inwolucję związaną z wiekiem. Przedwczesne starzenie się jest konsekwencją początkowego patologicznego zmniejszenia się wielkości wszystkich przestrzeni macierzystych organizmu. Lekowa i nielekowa stymulacja rezerw komórek macierzystych poprawia jakość życia poprzez skrócenie jego trwania, ponieważ zmniejsza wielkość przestrzeni macierzystych. Niska skuteczność współczesnych geroprotektorów wynika z ich ochronnego działania na starzejące się zróżnicowane komórki somatyczne, a nie na przestrzenie macierzyste organizmu.

Podsumowując, chcielibyśmy raz jeszcze zauważyć, że medycyna regeneracyjno-plastyczna jest nowym kierunkiem w leczeniu chorób człowieka, opartym na wykorzystaniu potencjału regeneracyjno-plastycznego komórek macierzystych. W tym przypadku plastyczność jest rozumiana jako zdolność egzogennych lub endogennych komórek macierzystych do wszczepiania się i wywoływania nowych wyspecjalizowanych kiełków komórkowych w uszkodzonych obszarach tkanek chorego organizmu. Przedmiotem medycyny regeneracyjno-plastycznej są śmiertelne choroby człowieka, które są obecnie nieuleczalne, patologie dziedziczne, choroby, w których tradycyjne metody medyczne osiągają jedynie efekt objawowy, a także wady anatomiczne organizmu, których odtworzenie jest celem rekonstrukcyjno-plastycznej chirurgii regeneracyjnej. Naszym zdaniem jest za wcześnie, aby pierwsze próby odtworzenia całych i funkcjonalnie kompletnych organów z komórek macierzystych uważać za odrębną dziedzinę medycyny praktycznej. Przedmiotem medycyny regeneracyjno-plastycznej są komórki macierzyste, które w zależności od źródła ich otrzymania mają różny potencjał regeneracyjno-plastyczny. Metoda regeneracyjnej medycyny plastycznej opiera się na przeszczepianiu komórek macierzystych lub ich pochodnych.