Sztuczne zastawki serca

Nowoczesne biologiczne sztuczne zastawki serca dostępne do użytku klinicznego, z wyjątkiem autoprzeszczepu płucnego, są nieżywotnymi strukturami, które nie mają potencjału wzrostu i naprawy tkanek. Nakłada to znaczne ograniczenia na ich stosowanie, zwłaszcza u dzieci, w celu korekcji patologii zastawek. Inżynieria tkankowa rozwinęła się w ciągu ostatnich 15 lat. Celem tego kierunku naukowego jest tworzenie w sztucznych warunkach takich struktur, jak sztuczne zastawki serca z powierzchnią odporną na zakrzepy i żywotnym śródmiąższem.

[ 1 ], [ 2 ]

Jak powstają sztuczne zastawki serca?

Koncepcja naukowa inżynierii tkankowej opiera się na idei zasiedlania i hodowli żywych komórek (fibroblastów, komórek macierzystych itp.) w syntetycznym lub naturalnym wchłanialnym rusztowaniu (matrycy), będącym trójwymiarową strukturą zastawkową, a także na wykorzystaniu sygnałów regulujących ekspresję genów, organizację i produktywność przeszczepionych komórek w okresie formowania macierzy zewnątrzkomórkowej.

Takie sztuczne zastawki serca są integrowane z tkanką pacjenta w celu ostatecznej odbudowy i dalszego utrzymania ich struktury i funkcji. W tym przypadku na oryginalnej macierzy powstaje nowy szkielet kolagenowo-elastynowy lub, ściślej rzecz biorąc, macierz pozakomórkowa w wyniku funkcjonowania komórek (fibroblastów, miofibroblastów itp.). W rezultacie optymalne sztuczne zastawki serca tworzone metodą inżynierii tkankowej powinny być zbliżone do rodzimych pod względem struktury anatomicznej i funkcji, a także mieć zdolność adaptacji biomechanicznej, zdolność do naprawy i wzrostu.

Inżynieria tkankowa opracowuje sztuczne zastawki serca, wykorzystując różne źródła pozyskiwania komórek. W ten sposób można stosować komórki ksenogeniczne lub allogeniczne, chociaż te pierwsze wiążą się z ryzykiem przeniesienia zoonoz na ludzi. Możliwe jest zmniejszenie antygenowości i zapobieganie reakcjom odrzucenia organizmu poprzez modyfikację genetyczną komórek allogenicznych. Inżynieria tkankowa wymaga niezawodnego źródła komórek. Takim źródłem są komórki autogeniczne pobrane bezpośrednio od pacjenta i nie wywołujące reakcji immunologicznych podczas reimplantacji. Skuteczne sztuczne zastawki serca są produkowane na bazie autologicznych komórek uzyskanych z naczyń krwionośnych (tętnic i żył). Opracowano metodę opartą na wykorzystaniu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją - FACS w celu uzyskania czystych kultur komórkowych. Mieszana populacja komórek uzyskana z naczynia krwionośnego jest znakowana acetylowanym markerem lipoprotein o niskiej gęstości, który jest selektywnie absorbowany na powierzchni śródbłonków. Komórki śródbłonka można następnie łatwo oddzielić od większości komórek uzyskanych z naczyń, które będą mieszaniną komórek mięśni gładkich, miofibroblastów i fibroblastów. Źródło komórek, czy to tętnica czy żyła, wpłynie na właściwości ostatecznej konstrukcji. Tak więc sztuczne zastawki serca z matrycą zaszczepioną komórkami żylnymi są lepsze w tworzeniu kolagenu i stabilności mechanicznej niż konstrukcje zaszczepione komórkami tętniczymi. Wybór żył obwodowych wydaje się być wygodniejszym źródłem pobierania komórek.

Miofibroblasty można również pozyskiwać z tętnic szyjnych. Jednak komórki pochodzące z naczyń mają znacząco inne cechy niż naturalne komórki śródmiąższowe. Autologiczne komórki pępowinowe mogą być wykorzystywane jako alternatywne źródło komórek.

Sztuczne zastawki serca na bazie komórek macierzystych

W ostatnich latach postęp w inżynierii tkankowej został ułatwiony dzięki badaniom nad komórkami macierzystymi. Wykorzystanie komórek macierzystych czerwonego szpiku kostnego ma swoje zalety. W szczególności prostota pobierania biomateriału i hodowli in vitro z późniejszym różnicowaniem do różnych typów komórek mezenchymalnych pozwala uniknąć stosowania nienaruszonych naczyń. Komórki macierzyste są pluripotentnymi źródłami linii komórkowych i mają unikalne cechy immunologiczne, które przyczyniają się do ich stabilności w warunkach allogenicznych.

Komórki macierzyste ludzkiego szpiku kostnego czerwonego uzyskuje się przez nakłucie mostka lub grzebienia biodrowego. Wyizolowuje się je z 10-15 ml aspiratu mostka, oddziela od innych komórek i hoduje. Po osiągnięciu wymaganej liczby komórek (zwykle w ciągu 21-28 dni) wysiewa się je (kolonizuje) na matrycach i hoduje w pożywce w pozycji statycznej (przez 7 dni w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2). Następnie stymuluje się wzrost komórek poprzez pożywkę kuwetową (bodźce biologiczne) lub poprzez stworzenie warunków fizjologicznych do wzrostu tkanki podczas jej izometrycznej deformacji w aparacie rozrodczym z przepływem pulsującym - bioreaktorze (bodźce mechaniczne). Fibroblasty są wrażliwe na bodźce mechaniczne, które promują ich wzrost i aktywność funkcjonalną. Pulsujący przepływ powoduje wzrost zarówno odkształceń promieniowych, jak i obwodowych, co prowadzi do orientacji (wydłużenia) zaludnionych komórek w kierunku takich naprężeń. To z kolei prowadzi do tworzenia zorientowanych struktur włóknistych zastawek. Stały przepływ powoduje jedynie naprężenia styczne na ściankach. Pulsujący przepływ ma korzystny wpływ na morfologię komórkową, proliferację i skład macierzy zewnątrzkomórkowej. Charakter przepływu pożywki, warunki fizykochemiczne (pH, pO2 i pCO2) w bioreaktorze również znacząco wpływają na produkcję kolagenu. Tak więc przepływ laminarny, cykliczne prądy wirowe zwiększają produkcję kolagenu, co prowadzi do poprawy właściwości mechanicznych.

Innym podejściem do hodowli struktur tkankowych jest tworzenie warunków embrionalnych w bioreaktorze zamiast symulowania warunków fizjologicznych organizmu ludzkiego. Biozastawki tkankowe hodowane na bazie komórek macierzystych mają ruchome i elastyczne klapy, zdolne do funkcjonowania pod wpływem wysokiego ciśnienia i przepływu przekraczającego poziom fizjologiczny. Badania histologiczne i histochemiczne klap tych struktur wykazały obecność aktywnych procesów biodestrukcji macierzy i jej zastępowania żywą tkanką. Tkanka jest zorganizowana według typu warstwowego z cechami białek macierzy zewnątrzkomórkowej podobnymi do tych w tkance natywnej, obecnością kolagenu typu I i III oraz glikozaminoglikanów. Jednak nie uzyskano typowej trójwarstwowej struktury klap - warstw komorowych, gąbczastych i włóknistych. Komórki ASMA-pozytywne wyrażające wimentynę znalezione we wszystkich fragmentach miały cechy podobne do miofibroblastów. Mikroskopia elektronowa ujawniła elementy komórkowe o cechach charakterystycznych dla żywych, wydzielniczych miofibroblastów (filamenty aktyny/miozyny, nici kolagenowe, elastyna) oraz komórki śródbłonka na powierzchni tkanki.

Na płatkach wykryto kolagen typu I, III, ASMA i wimentynę. Właściwości mechaniczne płatków tkanek i struktur natywnych były porównywalne. Sztuczne zastawki serca z tkanki wykazywały doskonałą wydajność przez 20 tygodni i przypominały naturalne struktury anatomiczne pod względem mikrostruktury, profilu biochemicznego i tworzenia macierzy białkowej.

Wszystkie sztuczne zastawki serca uzyskane metodą inżynierii tkankowej wszczepiono zwierzętom w pozycji płucnej, ponieważ ich właściwości mechaniczne nie odpowiadają obciążeniom w pozycji aortalnej. Zastawki tkankowe pobrane od zwierząt są zbliżone strukturą do rodzimych, co wskazuje na ich dalszy rozwój i restrukturyzację in vivo. Czy proces restrukturyzacji i dojrzewania tkanek będzie kontynuowany w warunkach fizjologicznych po wszczepieniu sztucznych zastawek serca, jak zaobserwowano w eksperymentach na zwierzętach, zostanie wykazane w dalszych badaniach.

Idealne sztuczne zastawki serca powinny mieć porowatość co najmniej 90%, ponieważ jest to niezbędne do wzrostu komórek, dostarczania składników odżywczych i usuwania produktów metabolizmu komórkowego. Oprócz biokompatybilności i biodegradowalności sztuczne zastawki serca powinny mieć chemicznie korzystną powierzchnię do zaszczepiania komórek i pasować do właściwości mechanicznych naturalnej tkanki. Poziom biodegradacji macierzy powinien być kontrolowany i proporcjonalny do poziomu formowania się nowej tkanki, aby zapewnić stabilność mechaniczną w czasie.

Obecnie opracowywane są matryce syntetyczne i biologiczne. Najczęstszymi materiałami biologicznymi do tworzenia matryc są anatomiczne struktury dawcy, kolagen i fibryna. Polimerowe sztuczne zastawki serca są projektowane tak, aby ulegały biodegradacji po implantacji, gdy wszczepione komórki zaczną wytwarzać i organizować własną sieć macierzy zewnątrzkomórkowej. Tworzenie nowej tkanki macierzy może być regulowane lub stymulowane przez czynniki wzrostu, cytokiny lub hormony.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Sztuczne zastawki serca dawcy

Sztuczne zastawki serca dawcy uzyskane od ludzi lub zwierząt i pozbawione antygenów komórkowych poprzez decelularyzację w celu zmniejszenia ich immunogenności mogą być używane jako matryce. Zachowane białka macierzy zewnątrzkomórkowej są podstawą późniejszej adhezji zaszczepionych komórek. Istnieją następujące metody usuwania elementów komórkowych (acelularyzacja): zamrażanie, obróbka trypsyną/EDTA, detergenty - dodecylosiarczan sodu, deoksykolan sodu, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, a także wieloetapowe metody obróbki enzymatycznej. W tym przypadku usuwane są błony komórkowe, kwasy nukleinowe, lipidy, struktury cytoplazmatyczne i rozpuszczalne cząsteczki macierzy, przy jednoczesnym zachowaniu kolagenu i elastyny. Jednak idealnej metody jeszcze nie znaleziono. Tylko dodecylosiarczan sodu (0,03-1%) lub deoksykolan sodu (0,5-2%) powodowały całkowite usunięcie komórek po 24 godzinach obróbki.

Badanie histologiczne usuniętych odkomórkowionych biozastawek (allograft i ksenograft) w eksperymencie na zwierzętach (pies i świnia) wykazało częściową śródbłonkową i wrastanie miofibroblastów biorcy do podstawy, bez oznak zwapnienia. Zaobserwowano umiarkowane nacieki zapalne. Jednak wczesna niewydolność rozwinęła się podczas badań klinicznych odkomórkowionej zastawki SynerGraftTM. Wykryto wyraźną reakcję zapalną w macierzy bioprotezy, która początkowo była niespecyficzna i towarzyszyła jej reakcja limfocytarna. Dysfunkcja i degeneracja bioprotezy rozwinęły się w ciągu jednego roku. Nie odnotowano kolonizacji komórkowej macierzy, ale wykryto zwapnienie zastawek i pozostałości komórek przedimplantacyjnych.

Bezkomórkowe matryce zaszczepione komórkami śródbłonka i hodowane in vitro i in vivo utworzyły spójną warstwę na powierzchni zastawek, a zaszczepione komórki śródmiąższowe o natywnej strukturze wykazały zdolność do różnicowania. Nie udało się jednak osiągnąć wymaganego fizjologicznego poziomu kolonizacji komórek na matrycy w dynamicznych warunkach bioreaktora, a wszczepione sztuczne zastawki serca towarzyszyły dość szybkiemu (trzy miesiące) zagęszczaniu z powodu przyspieszonej proliferacji komórek i tworzenia macierzy pozakomórkowej. Tak więc na tym etapie wykorzystanie bezkomórkowych matryc dawcy do ich kolonizacji komórkami ma szereg nierozwiązanych problemów, w tym immunologicznych i zakaźnych; prace nad odkomórkowionymi bioprotezami trwają.

Należy zauważyć, że kolagen jest również jednym z potencjalnych materiałów biologicznych do produkcji matryc zdolnych do biodegradacji. Może być stosowany w postaci pianki, żelu lub płytek, gąbek i jako półfabrykat na bazie włókien. Jednak stosowanie kolagenu wiąże się z szeregiem trudności technologicznych. W szczególności trudno jest go uzyskać od pacjenta. Dlatego obecnie większość matryc kolagenowych jest pochodzenia zwierzęcego. Powolna biodegradacja kolagenu zwierzęcego może nieść ze sobą zwiększone ryzyko zakażenia zoonozami, powodować reakcje immunologiczne i zapalne.

Fibryna jest kolejnym materiałem biologicznym o kontrolowanych właściwościach biodegradacji. Ponieważ żele fibrynowe można wytwarzać z krwi pacjenta w celu późniejszej produkcji macierzy autologicznej, implantacja takiej struktury nie spowoduje jej toksycznej degradacji i reakcji zapalnej. Jednakże fibryna ma takie wady, jak dyfuzja i wypłukiwanie do środowiska oraz niskie właściwości mechaniczne.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Sztuczne zastawki serca wykonane z materiałów syntetycznych

Sztuczne zastawki serca są również wykonane z materiałów syntetycznych. Kilka prób produkcji matryc zastawkowych opierało się na wykorzystaniu poliglaktyny, kwasu poliglikolowego (PGA), kwasu polimlekowego (PLA), kopolimeru PGA i PLA (PLGA) oraz polihydroksyalkanoanów (PHA). Wysoce porowaty materiał syntetyczny można uzyskać z włókien plecionych lub nieplecionych i przy użyciu technologii ługowania solą. Obiecujący materiał kompozytowy (PGA/P4HB) do produkcji matryc uzyskuje się z nieplecionych pętli kwasu poliglikolowego (PGA) pokrytych poli-4-hydroksybutyratem (P4HB). Sztuczne zastawki serca wytwarzane z tego materiału są sterylizowane tlenkiem etylenu. Jednak znaczna początkowa sztywność i grubość pętli tych polimerów, ich szybka i niekontrolowana degradacja, której towarzyszy uwalnianie kwaśnych produktów cytotoksycznych, wymagają dalszych badań i poszukiwania innych materiałów.

Zastosowanie autologicznych płytek do hodowli tkankowej miofibroblastów hodowanych na rusztowaniu w celu utworzenia podtrzymujących macierzy poprzez stymulację produkcji tych komórek umożliwiło uzyskanie próbek zastawek z aktywnymi żywymi komórkami otoczonymi macierzą pozakomórkową. Jednak właściwości mechaniczne tkanek tych zastawek są nadal niewystarczające do ich implantacji.

Wymagany poziom proliferacji i regeneracji tkanki tworzonej zastawki może nie zostać osiągnięty poprzez połączenie samych komórek i macierzy. Ekspresja genów komórkowych i tworzenie tkanek mogą być regulowane lub stymulowane poprzez dodawanie czynników wzrostu, cytokin lub hormonów, czynników mitogennych lub czynników adhezji do macierzy i rusztowań. Badana jest możliwość wprowadzenia tych regulatorów do biomateriałów macierzy. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje znaczny brak badań nad regulacją tworzenia zastawki tkankowej za pomocą bodźców biochemicznych.

Bezkomórkowa świńska ksenogeniczna bioproteza płuc Matrix P składa się z odkomórkowionej tkanki przetworzonej specjalną opatentowaną procedurą AutoTissue GmbH, obejmującą leczenie antybiotykami, deoksycholanem sodu i alkoholem. Ta metoda przetwarzania, zatwierdzona przez Międzynarodową Organizację Normalizacyjną, eliminuje wszystkie żywe komórki i struktury pozakomórkowe (fibroblasty, komórki śródbłonka, bakterie, wirusy, grzyby, mykoplazmy), zachowuje architekturę macierzy zewnątrzkomórkowej, redukuje poziom DNA i RNA w tkankach do minimum, co redukuje do zera prawdopodobieństwo przeniesienia świńskiego retrowirusa endogennego (PERV) na ludzi. Bioproteza Matrix P składa się wyłącznie z kolagenu i elastyny z zachowaną integracją strukturalną.

W eksperymentach na owcach odnotowano minimalną reakcję otaczających tkanek 11 miesięcy po wszczepieniu bioprotezy Matrix P z dobrym wskaźnikiem przeżycia, co było szczególnie widoczne w błyszczącej wewnętrznej powierzchni wsierdzia. Reakcje zapalne, pogrubienie i skrócenie płatków zastawki były praktycznie nieobecne. Odnotowano również niskie poziomy wapnia w tkankach bioprotezy Matrix P, różnica była statystycznie istotna w porównaniu z tymi leczonymi glutaraldehydem.

Sztuczna zastawka serca Matrix P dostosowuje się do stanu pacjenta w ciągu kilku miesięcy od wszczepienia. Badanie przeprowadzone pod koniec okresu kontrolnego wykazało nienaruszoną macierz pozakomórkową i zlewający się śródbłonek. Ksenograft Matrix R wszczepiony 50 pacjentom z wrodzonymi wadami podczas zabiegu Rossa w latach 2002–2004 wykazał lepszą wydajność i niższe gradienty ciśnienia przezzastawkowego w porównaniu z kriokonserwowanymi i odkomórkowionymi allograftami SynerGraftMT oraz bioprotezami bez rusztowania traktowanymi glutaraldehydem. Sztuczne zastawki serca Matrix P są przeznaczone do wymiany zastawki płucnej podczas rekonstrukcji drogi odpływu prawej komory w chirurgii wad wrodzonych i nabytych oraz podczas wymiany zastawki płucnej podczas zabiegu Rossa. Są dostępne w 4 rozmiarach (według średnicy wewnętrznej): dla noworodków (15–17 mm), dla dzieci (18–21 mm), pośrednich (22–24 mm) i dorosłych (25–28 mm).

Postęp w rozwoju zastawek modyfikowanych tkankowo będzie zależał od postępów w biologii komórek zastawkowych (w tym kwestii ekspresji genów i regulacji), badań nad rozwojem zastawek embriogenicznych i związanych z wiekiem (w tym czynników angiogennych i neurogennych), dokładnej wiedzy na temat biomechaniki każdej zastawki, identyfikacji odpowiednich komórek do zaszczepienia i opracowania optymalnych matryc. Dalszy rozwój bardziej zaawansowanych zastawek tkankowych będzie wymagał gruntownego zrozumienia związku między cechami mechanicznymi i strukturalnymi natywnych zastawek a bodźcami (biologicznymi i mechanicznymi) w celu odtworzenia tych cech in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]