Ograniczenia, zagrożenia i powikłania przeszczepu komórek

Medycyna regeneracyjna z tworzywa sztucznego jest oparta na realizacji w pluripotencjalnych komórek macierzystych i progenitorowych w klinice i właściwości toti-, dzięki czemu in vitro i in vivo do tworzenia z góry określone linie komórek zasiedlających uszkodzonych tkanek i organów ludzkiego pacjenta.

Prawdziwa możliwość wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych i komórek macierzystych tkanek ostatecznych (tak zwanych dorosłych komórek macierzystych) człowieka do celów terapeutycznych nie jest już wątpliwa. Jednak eksperci w National and Medical Academies w Stanach Zjednoczonych (USA) zalecają bardziej szczegółowe badanie właściwości komórek macierzystych w eksperymentach o odpowiednich modelach biologicznych i obiektywnie oceniają wszystkie konsekwencje przeszczepienia, a dopiero potem wykorzystują komórki macierzyste w klinice.

Ustalono, że komórki macierzyste są częścią pochodnych tkankowych wszystkich trzech ulotek zarodkowych. Komórki macierzyste występują w siatkówce, skóry, rogówki, naskórka, szpiku kostnego i krwi obwodowej, w naczyniach pulpa zęba, nerki, nabłonek przewodu pokarmowego, trzustki i wątroby. Za pomocą nowoczesnych metod udowodniono, że komórki nerwowe trzonu są umiejscowione w mózgu dorosłego i rdzeniu kręgowym. Te sensacyjne dane przyciągnęły szczególną uwagę naukowców i mediów, ponieważ neurony mózgu służyły jako klasyczny przykład statycznej populacji komórek, która nie dochodzi do siebie. Oba wczesne i późne okresy ontogenezy powodu nerwowych komórek macierzystych w mózgu ludzi i zwierząt generowane neuronów, astrocytów i oligodendrocytów (komórek macierzystych: postęp naukowy i przyszłe kierunki badań Nat Inst, Zdrowia USA ..).

Jednak w normalnych warunkach plastyczność komórek macierzystych tkanek ostatecznych nie pojawia się. Aby zrealizować potencjał plastyczny komórek macierzystych tkanek ostatecznych, należy je wyizolować, a następnie hodować w pożywkach z cytokinami (LIF, EGF, FGF). Co więcej, pochodne komórek macierzystych z powodzeniem przeżywają tylko po przeszczepieniu do organizmu zwierzęcia z obniżonym układem odpornościowym (promieniowanie γ, cytostatyki, busulfan, itp.). Do chwili obecnej nie było przekonujących dowodów plastyczności komórek macierzystych u zwierząt, które nie były napromieniowane lub w inny sposób narażone na głęboką immunosupresję.

W takich okolicznościach niebezpiecznych PGC potencji objawia się przede wszystkim w dziedzinie transplantacji ich pozamacicznej - iniekcja podskórna ESK myszy z niedoborem odporności w miejscu wstrzyknięcia utworzonej potworniaka. Ponadto, w trakcie ludzkiego rozwoju embrionalnego częstości zaburzeń chromosomowych niż z w embriogenezy u zwierząt. W stadium blastocysty tylko 20-25% ludzkich zarodków składa się z komórek o normalnym kariotypu, w przeważającej większości wczesnych zarodków ludzkich otrzymanych przy zapłodnieniu in vitro, chromosomalny mozaicyzm wykryte chaotyczny i bardzo często aberracji liczbowych i strukturalnych.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Korzystny efekt komórek macierzystych

Wstępne wyniki badań klinicznych potwierdzają korzystny wpływ komórek macierzystych na pacjenta, ale jak dotąd nie ma informacji na temat długoterminowych konsekwencji transplantacji komórek. W literaturze, początkowo zdominowane przez doniesienia o pozytywnych wyników transplantacji szpiku fragmentów zarodków w chorobie Parkinsona, ale potem zaczęły się pojawiać dane zaprzeczającemu skutecznych efektów terapeutycznych zarodka lub płodu tkanki nerwowej przeszczepione do mózgów pacjentów.

W połowie XX wieku przywrócenie hematopoezy została po raz pierwszy odkryta w śmiertelnie napromieniowanych zwierząt po dożylnym transfuzji komórek szpiku kostnego, a w 1969 roku amerykański badacz Thomas D. Przeprowadzono pierwszy przeszczep szpiku kostnego człowieka. Brak wiedzy na temat mechanizmów immunologicznych niezgodność szpiku kostnego dawcy i biorcy, a spowodowane wysoką śmiertelnością z powodu częstego neprizhivleniya przeszczepu oraz rozwoju reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi”. Wykrycie głównego kompleksu zgodności tkankowej, która składa się z ludzkim antygenem leukocytów (HBA) i doskonalenie metod typowania można znacznie zwiększyć przeżywalność po przeszczepie szpiku kostnego, który doprowadził do szerokiego tej metody leczenia w onkologii i hematologii. Po dekadzie przeprowadzono pierwszą transplantację krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC) z krwi obwodowej przy pomocy leukaferezy. W 1988 roku we Francji do leczenia dziecka z Fanconiego niedokrwistości jako źródła HSC został po raz pierwszy użyty krwi pępowinowej, a do końca 2000 roku w prasie zaczęły pojawiać się na temat możliwości HSC do różnicowania w komórki różnych typów tkanek, które potencjalnie rozszerza zakres ich stosowania klinicznego. Okazało się jednak, że materiał do transplantacji, wraz z GSK, zawiera znaczną liczbę komórek niehemopoetycznych, które mają różny charakter i właściwości. W związku z tym opracowywane są metody oczyszczania przeszczepu i kryteria oceny jego czystości komórkowej. W szczególności stosuje się pozytywną immunozłączalność komórek CD34 +, która umożliwia izolację HSC za pomocą przeciwciał monoklonalnych.

[8], [9], [10], [11], [12]

Powikłania terapii komórkami macierzystymi

Powikłania przeszczepu szpiku kostnego są najczęściej hematologiczne i związane są z przedłużonym okresem jatrogennej pancytopenii. Najczęstsze infekcje to anemia, anemia i krwotoki. W związku z tym niezwykle ważne jest, aby wybrać optymalny sposób pobierania próbek, przetwarzania i przechowywania szpiku kostnego dla maksymalnej konserwacji komórek macierzystych, co zapewni szybkie i stabilne odzyskanie krwiaka. Charakteryzując przeszczep, obecnie akceptuje się ocenę następujących parametrów: liczby jednojądrzastych i / lub jądrzastych komórek, jednostek tworzących kolonie i zawartości komórek SB34-dodatnich. Niestety, wskaźniki te zapewniają tylko pośrednią ocenę rzeczywistej zdolności krwiotwórczej populacji po przeszczepie komórek macierzystych. Na dzień dzisiejszy istnieją absolutnie dokładne parametry do określenia wystarczalności przeszczepu do długoterminowego odzyskiwania hemopoez u pacjentów, nawet w autologicznym transplantacji szpiku kostnego. Opracowanie wspólnych kryteriów jest niezwykle trudne ze względu na brak sztywnych standardów przetwarzania, kriokonserwacji i testów przeszczepów. Ponadto konieczne jest wzięcie pod uwagę różnorodnych czynników, które wpływają na parametry powodzenia w odzyskaniu krwiaka u każdego pacjenta. Autologicznego przeszczepu szpiku kostnego najważniejsze z nich to szereg wcześniejszych schematów leczenia, w szczególności schemat kondycjonujący, okres od choroby, która jest wytwarzana w szpiku kostnego systemu zbierania stosowania czynników pobudzających wzrost kolonii w okresie po przeszczepie. Ponadto nie należy zapominać, że chemioterapia poprzedzona przeszczepem płodu może mieć negatywny wpływ na komórki macierzyste szpiku kostnego.

Częstotliwość ciężkich powikłań toksycznych znacznie wzrasta w przypadku alogenicznego przeszczepu szpiku kostnego. W związku z tym interesujące są dane statystyczne dotyczące transplantacji alogenicznego szpiku kostnego w talasemii. W doniesieniach Europejskiej Grupy Transplantacji Szpiku Kostnego zarejestrowano około 800 przeszczepów szpiku kostnego u pacjentów z dużą talasemią. Allogeniczny przeszczep w talasemii wykonywanych w większości przypadków z HLA-identyczne rodzeństwa, które wiąże się z groźnymi powikłaniami i wyższej śmiertelności po transplantacji komórek macierzystych związanego materiału częściowo zgodna lub dopasowane niespokrewnionych dawców. W celu zminimalizowania ryzyka śmiertelnych powikłań infekcyjnych, pacjentów umieszczano w izolowanym pudełku aseptycznych z przepływem laminarnym, jest niska lub bezbakteryjnego zapalenia diety. Do bakteryjnego odkażenia jelita przepisać nieodporne formy antybiotyków, leków przeciwgrzybiczych. W celu zapobieżenia amfoterycyny B. Dożylnie zapobiegania zakażeniom ogólnoustrojowym stałych amikacyny i ceftazydym, które wyznaczają dzień przed przeszczepem, kontynuując leczenie do odprowadzania pacjentów. Wszystkie preparaty krwi przed napromieniowaniem są napromieniowane w dawce 30 Gy. Żywienie pozajelitowe podczas przeszczepu jest warunkiem wstępnym i rozpoczyna się natychmiast poprzez naturalne ograniczenie spożycia pokarmu.

Pewna liczba powikłań związanych z wysoką toksyczność leków immunosupresyjnych, które często wywołują nudności, wymioty, zapalenie błony śluzowej, uszkodzenia nerek i śródmiąższowe zapalenie płuc. Jednym z najcięższych powikłań chemioterapii jest żylno-okluzyjna choroba wątroby, prowadząca do śmierci we wczesnym okresie po transplantacji. Wśród czynników ryzyka zakrzepicy żylnej systemu wrotnego wątroby należy zauważyć, wiek pacjenta, występowanie zapalenia wątroby i zwłóknienia wątroby i posiadający leczenie immunosupresyjne po przeszczepieniu szpiku kostnego. Choroba Veno-occlusive jest szczególnie groźna w talasemii, której towarzyszy hemosyderoza wątroby, zapalenie wątroby i włóknienie - częste satelity terapii transfuzją. Zakrzepica systemu wrotnego wątroby rozwija się w ciągu 1-2 tygodni po przeszczepie, charakteryzuje się szybkim wzrostem stężenia bilirubiny we krwi i transaminaz, postępujące powiększenie wątroby, wodobrzusze, encefalopatia i ból w nadbrzuszu. Histologicznie materiał autopsji zdefiniowane uszkodzenie śródbłonka podśródbłonkowej krwotoku, uszkodzenia tsentrolobulyarnyh hepatocyty, zakrzepowej niedrożności żyłki wątroby i żyły centralnej. U pacjentów z talasemią opisano przypadki śmiertelnego zatrzymania krążenia związane z toksycznym działaniem cytostatyków.

W przygotowaniu do transplantacji cyklofosfamid i busulfan często powodują toksyczne krwotoczne zapalenie pęcherza z patologicznymi zmianami w komórkach nabłonka. Stosowaniu cyklosporyny A w transplantacji szpiku często towarzyszą efekty nefro- i neurotoksyczności, zespół nadciśnienia, retencja płynów w organizmie i cytoliza hepatocytów. Naruszenie funkcji seksualnych i rozrodczych jest częściej obserwowane u kobiet. U małych dzieci po transplantacji rozwój pokwitowy zwykle nie cierpi, ale u starszych dzieci patologia rozwoju skazy narządów płciowych może być bardzo poważna - aż do bezpłodności. Komplikacje bezpośrednio związane z samym przeszczepem obejmują odrzucenie allogenicznych komórek szpiku kostnego, niekompatybilność w układzie ABO, ostre i przewlekłe formy reakcji "przeszczep przeciwko gospodarzowi".

Pacjentowi po przeszczepie ABO niekompatybilny szpiku kostnego idioagglutinin typu „gospodarz przeciwko dawcy ABO” wyprodukowanej 330-605 dni po transplantacji, co może prowadzić do wydłużenia hemolizy i znacznego wzrostu zapotrzebowania na transfuzję krwi. Wspomniana trudność związana jest uniemożliwione przez transfuzję grup erytrocytów tylko 0. Po transplantacji, u wielu pacjentów z autoimmunologiczną neutropenię, małopłytkowość, pancytopenię, lub do korekcji, które muszą być prowadzone splenektomię.

U 35-40% biorców ostra reakcja "przeszczep przeciwko gospodarzowi" rozwija się w ciągu 100 dni po transplantacji allogenicznego HbA-identycznego szpiku kostnego. Stopień uszkodzenia skóry, wątroby i jelit zależy od wysypka, hiperbilirubinemii, biegunka i łagodne dla złuszczanie się skóry, niedrożność jelit, ostra niewydolność wątroby. Pacjenci z częstotliwością talasemii ostrej reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi „” I stopnia, po przeszczepie szpiku kostnego w 75%, II i wyższy stopień - 11-53%. Przewlekła reakcja "przeszczep przeciwko gospodarzowi" jako układowy zespół wielonarządowy zwykle rozwija się w ciągu 100-500 dni po allogenicznym transplantacji szpiku kostnego u 30-50% pacjentów. Dotyczy to skóry, jamy ustnej, wątroby, oczu, przełyku i górnych dróg oddechowych. Odróżnić ograniczoną formę przewlekłą reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi”, gdy dotyczy skóry i / lub wątroby, i powszechne, uogólnione zmiany skórne w połączeniu z przewlekłego agresywnego zapalenia wątroby, choroby oczu, gruczołów ślinowych lub innego narządu. Przyczyną śmierci są często infekcyjne powikłania wynikające z ciężkiego niedoboru odporności. W talasemii chronicznego łagodnego postaci „przeszczep przeciwko gospodarzowi” reakcja stwierdzono w 12%, średni - 3% i ciężką - posiada 0,9% biorców HLA zgodnym z allogenicznego szpiku kostnego. Poważnym powikłaniem w transplantacji szpiku kostnego jest odrzucenie przeszczepu, które rozwija się 50-130 dni po operacji. Częstotliwość odrzucania zależy od trybu kondycjonowania. W szczególności, pacjenci z talasemią oczyszczanie podczas wytwarzania samym metotreksatem, odrzucenie przeszczepu szpiku kostnego występuje w 26% przypadków, kombinacje metotreksatu cyklosporyny A - 9%, a gdy przypisanie tylko cyklosporyny A - 8% przypadków (Haziyev etc. 1995).

Zakaźne powikłania po przeszczepie szpiku kostnego spowodowane przez wirusy, bakterie i grzyby. Ich rozwój jest związany z głębokiej neutropenii, która jest indukowana podczas chemioterapii klimatyzacji, cytostatyki pokonaniu barier i błon śluzowych reakcji „przeszczep przeciw gospodarzowi”. W zależności od czasu rozwoju, istnieją trzy fazy zakażenia. W pierwszym etapie (wytwarzanie w pierwszym miesiącu po przeszczepie) jest zdominowany przez uszkodzenie bariery śluzówki i neutropenii, często towarzyszy infekcji wirusowych (wirusem opryszczki, wirusem Epsteina-Barra, wirus cytomegalii, wirus ospy wietrznej i półpaśca), a także w leczeniu zakażeń grampolozhi - zapalnych i Gram-ujemnych bakterii Candida grzybów , aspergillomas. W pierwszym okresie po transplantacji (drugi i trzeci miesiące po przeszczepie) jest najbardziej ciężkie zakażenie wirusem cytomegalii, który często prowadzi do śmierci pacjentów w drugiej fazie zakażenia. Talasemii zakażenie wirusem cytomegalii, po przeszczepie szpiku kostnego występuje 1.7-4.4% biorców. Trzecia faza występuje w późnym okresie po przeszczepie (trzy miesiące po operacji), i charakteryzuje się ciężki złożony niedobór odporności. Okres ten jest powszechnie spotykane zakażeń wywołanych przez paciorkowce, ospy wietrznej i półpaśca, Pneumocystis Carini, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae oraz wirusami zapalenia wątroby. Śmiertelność talasemia u pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego jest związany z bakterii i grzybów posocznica, idiopatyczne śródmiąższowe zapalenie płuc i cytomegalii, zespół ostrej niewydolności oddechowej, ostrego uszkodzenia serca, tamponady, krwotok mózgowy, choroby wątroby venookklyuzionnoy i ostrej reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi”.

Obecnie poczyniono pewne postępy w opracowywaniu metod izolowania ze szpiku kostnego czystej populacji komórek hemopoetycznych macierzystych. Udoskonalono technikę uzyskiwania krwi płodowej z pępowiny i opracowano metody izolacji komórek krwiotwórczych z krwi pępowinowej. W prasie naukowej istnieją doniesienia, że podczas hodowania w mediach z cytokinami hematopoetyczne komórki macierzyste są zdolne do namnażania. Przy użyciu specjalnie zaprojektowanych bioreaktorów do ekspansji HSC, biomasa macierzystych komórek hemopoetycznych wyizolowanych ze szpiku kostnego, krwi obwodowej lub pępowinowej jest znacznie zwiększona. Możliwość ekspansji HSC jest ważnym krokiem w klinicznym rozwoju transplantacji komórek.

Jednak przed reprodukcją HSC in vitro konieczne jest wyizolowanie homogennej populacji hematopoetycznych komórek macierzystych. Jest to zwykle osiągane przy użyciu znaczników, dzięki czemu selektywnie oznaczyć HSC monoklonalnych przeciwciał kowalentnie związanych z etykietą magnetycznym lub fluorescencyjnym i wybierz je z odpowiednim sortera komórek. W tym samym czasie problem fenotypowej charakterystyki hematopoetycznych komórek macierzystych nie został ostatecznie rozwiązany. A. Petrenko. V. Hryschenko (2003), jako kandydatów na GSK traktowane komórki, które są obecne na powierzchni komórki CD34 +, AC133 i antygeny metylo oraz brak CD38, HLA-DR i innych markerów różnicowania (komórek CD34 fenotyp + Liir). Liniowymi markerów różnicowania rodowych (Lin) obejmują glikoforyna A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Perspektywą przeszczepu są komórki o fenotypie CD34 + CD45RalüW CD71low, jak również CD34 + Thyl + CD38low / c-kit / low.

Problem liczby HSC wystarczającej do skutecznego przeszczepienia pozostaje problemem. Obecnie źródłem komórek krwiotwórczych macierzystych są szpik kostny, krew obwodowa i pępowinowa, a także zarodkowa wątroba. Ekspansję komórek hemopoetycznych macierzystych uzyskuje się przez hodowanie ich w obecności śródbłonka i hematopoetycznych czynników wzrostu. W różnych protokołach mieloproteiny, SCF, erytropoetyna, insulinopodobne czynniki wzrostu, kortykosteroidy i estrogeny są stosowane do indukowania proliferacji HSC. Gdy połączenia cytokin są stosowane in vitro, znaczący wzrost puli HSC można osiągnąć z maksimum ich uwalniania pod koniec drugiego tygodnia hodowli.

Tradycyjnie krew pępowinowa HSC używana jest głównie w hemoblastozach. Jednak minimalna dawka komórek krwiotwórczych potrzebnych do pomyślnego przeszczepienia komórek krwi pępowinowej wynosi 3,7 x 10 ⁷ komórek jądrzastych na 1 kg masy ciała biorcy. Stosowanie mniejszej ilości HSC znacznie zwiększa ryzyko niepowodzenia przeszczepu i nawrotu choroby. Dlatego transplantacja komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej jest głównie stosowana w leczeniu hemoblastozy u dzieci.

Niestety, nadal nie ma standardowy puste, a standaryzowane protokoły kliniczne zastosowanie komórek krwiotwórczych z krwi pępowinowej. Odpowiednio same komórki macierzyste z krwi pępowinowej nie są prawnie uznane jako źródło krwiotwórczych komórek macierzystych do przeszczepu. Ponadto, nie ma zasady etyczne lub prawne regulujące działalność i organizację banków krovb pępowinowej, które są dostępne za granicą. Tymczasem dla bezpieczeństwa przeszczepiania krwi pępowinowej, wszystkie próbki powinny być dokładnie monitorowane. Przed pobraniem próbki krwi od kobiety w ciąży należy uzyskać jej zgodę. Każdy ciąży muszą być badane na wózku HBsAg, przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C, HIV i kiły. Każdą próbkę krwi pępowinowej przeprowadza się na standardowej liczby komórek jądrzastych i CD34 + zdolności tworzenia kolonii. Ponadto przeprowadzono HbA typowania grup krwi ABO i jego przynależność czynnika Rh. Procedury testowe są wymagane upraw bakteriologicznego niepłodności, badania serologiczne w HIV-1 i HIV-2, HBsAg, wirusa zapalenia wątroby typu C, zakażenia wirusem cytomegalii, NTLY NTLY-1 i II, kiłę, toksoplazmozę. Ponadto, dla wykrywania wirusa cytomegalii i HIV reakcji łańcuchowej polimerazy przeprowadzone. Wydaje się odpowiednie uzupełnienie analizy protokoły testowania krwi pępowinowej HSC przewód do identyfikacji takich chorób genetycznych, takich jak talasemii i anemię sierpowatą, niedobór deaminazy adenozyny, agammaglobulinemią Brutona, choroby Harlera i punter.

W następnym etapie przygotowania do przeszczepu pojawia się pytanie o zachowanie GSK. Najbardziej niebezpieczne dla żywotności komórek podczas ich przygotowywania są procedury zamrażania i rozmrażania. Podczas zamrażania komórek hemopoetycznych znaczna ich część może zostać zniszczona z powodu tworzenia się kryształów. Aby zmniejszyć odsetek śmierci komórek, stosuje się specjalne substancje - krioprotektanty. Najczęściej jako krioprotektant stosuje się DMSO o końcowym stężeniu 10%. Jednak dla DMSO to stężenie charakteryzuje się bezpośrednim działaniem cytotoksycznym, które objawia się nawet w warunkach minimalnej ekspozycji. Zmniejszenie efektu cytotoksycznego uzyskuje się przez ścisłe utrzymywanie zerowej temperatury trybu ekspozycji, a także przez przestrzeganie procedury przetwarzania materiału w procesie i po odszranianiu (szybkość wszystkich manipulacji, stosowanie procedur prania wielokrotnego użytku). Nie należy stosować stężenia DMSO poniżej 5%, ponieważ w tym przypadku śmierć masy komórek krwiotwórczych występuje w okresie zamrażania.

Obecność zanieczyszczeń czerwonymi komórkami krwi w zawiesinowej mieszaninie GSK stwarza niebezpieczeństwo wywołania reakcji niekompatybilności antygenów erytrocytów. W tym samym czasie, wraz z usuwaniem erytrocytów, znacząco wzrasta utrata komórek hematopoetycznych. W związku z tym zaproponowano metodę niefrakcjonowanego rozdzielania GCS. W tym przypadku, w celu ochrony jądrzaste komórki przed szkodliwym działaniem o niskiej temperaturze przy użyciu 10% roztworu DMSO i chłodzenia przy stałej szybkości (HS / min) do temperatury -80 ° C, po czym zawiesinę komórek zamrożono w ciekłym azocie. Uważa się, że dzięki tej technice krioprezerwacji zachodzi częściowa liza erytrocytów, dlatego próbki krwi nie wymagają frakcjonowania. Przed transplantacją zawiesinę komórek rozmraża się, przemywa wolną od hemoglobiny i DMSO w roztworze ludzkiej albuminy lub surowicy. Zachowanie krwiotwórczych komórek progenitorowych tą metodą jest w istocie wyższe niż po frakcjonowaniu krwi pępowinowej, ale ryzyko powikłań związanych z transfuzją ABO niekompatybilny transfuzji erytrocytów przechowywanych.

Utworzenie systemu banków do przechowywania testowanych HSC i próbek HSC może rozwiązać powyższe problemy. Jednak w tym celu konieczne jest opracowanie norm etycznych i prawnych, które wciąż są przedmiotem dyskusji. Przed utworzeniem sieci bankowej konieczne jest przyjęcie szeregu przepisów i dokumentów dotyczących standaryzacji procedur pobierania próbek, frakcjonowania, testowania i pisania oraz kriokonserwacji GCW. Warunkiem skutecznego funkcjonowania banków GSK jest organizacja bazy komputerowej do współpracy z rejestrami Światowego Stowarzyszenia Mediatorów Darczyńców (WMDA) i Programu Mediacyjnego Stanów Zjednoczonych (NMDP).

Ponadto konieczne jest zoptymalizowanie i standaryzacja metod ekspansji HSC in vitro, głównie krwiotwórczych komórek krwi pępowinowej. Powielanie krwi pępowinowej HSC jest konieczne, aby zwiększyć liczbę potencjalnych biorców zgodnych z systemem HLA. Z powodu niewielkich objętości krwi pępowinowej ilość zawartego w nim HSC z reguły nie jest w stanie zapewnić zasiedlania szpiku u dorosłych pacjentów. Jednocześnie, aby przeprowadzić niepowiązane transplantacje, konieczne jest posiadanie dostępu do wystarczającej liczby typowych próbek GSK (od 10 000 do 1 500 000 na 1 odbiorcę).

Transplantacja komórek macierzystych hemopoetycznych nie eliminuje powikłań towarzyszących przeszczepowi szpiku kostnego. Analiza wykazuje, że w transplantacji komórek macierzystych krwi pępowinowej ciężkie postacie ostrej reakcji "przeszczep przeciwko gospodarzowi" rozwijają się w 23%, przewlekle u 25% biorców. U pacjentów z onkohematologią nawroty ostrej białaczki w pierwszym roku po przeszczepie krwi pępowinowej HSC obserwowane są w 26% przypadków.

W ostatnich latach intensywnie rozwijają się metody przeszczepiania obwodowych hematopoetycznych komórek macierzystych. Zawartość HSC w krwi obwodowej jest tak mała (jest 1 GSK na 100 000 komórek krwi), że ich izolacja bez specjalnego przygotowania nie ma sensu. Dlatego dawcy dawano wcześniej przebieg stymulacji lekowej uwalniania krwiotwórczych komórek szpiku kostnego do krwi. W tym celu stosuje się tak daleko nieszkodliwe leki, jak cyklofosfamid i czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów. Ale nawet po procedurze mobilizacji HSC we krwi obwodowej, zawartość komórek CD34 + w niej nie przekracza 1,6%.

Aby zmobilizować HSC w klinice, częściej stosuje się C-CEC, który charakteryzuje się stosunkowo dobrą tolerancją, z wyjątkiem prawie regularnego pojawiania się bólu w kościach. Należy zauważyć, że zastosowanie nowoczesnych separatorów krwi pozwala nam skutecznie izolować przodków hematopoezy. Jednakże w warunkach prawidłowej hematopoezy należy wykonać co najmniej 6 zabiegów w celu uzyskania wystarczającej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych, porównywalnych z wydajnością repopulacyjną zawiesiny szpiku kostnego. Przy każdej takiej procedurze separator przetwarza 10-12 litrów krwi, co może powodować trombocytopenię i leukopenię. Procedura rozdzielania obejmuje podawanie środka przeciwkrzepliwego (cytrynianu sodu) do dawcy, co nie wyklucza jednak kontaktu z aktywacją płytek podczas wirowania pozaustrojowego. Czynniki te stwarzają warunki do rozwoju powikłań zakaźnych i krwotocznych. Inną wadą tej metody jest znaczna zmienność reakcji mobilizacji, która wymaga monitorowania zawartości HSC w dawcach krwi obwodowej, niezbędnej do określenia ich maksymalnego poziomu.

Autologiczny przeszczep HSC, w przeciwieństwie do alogenicznego, całkowicie wyklucza rozwój reakcji odrzucenia. Niemniej jednak, istotną wadą autoprzeszczepienia komórek krwiotwórczych macierzystych, co ogranicza spektrum wskazań do jej postępowania, jest wysokie prawdopodobieństwo ponownego wlewu komórek klonów białaczkowych za pomocą przeszczepu. Ponadto brak efektu immunologicznego "przeszczep przeciwko nowotworowi" znacznie zwiększa częstotliwość nawrotów złośliwych chorób krwi. W związku z tym, jedyną drogą rodnikowej klonalnej eliminacji nowotworowych układu krwiotwórczego i przywracania normalnego poliklonalne krwinek w mielodysplastycznych intensywna chemioterapia allogenicznego przeszczepu HSC.

Ale nawet w tym przypadku leczenie większości hemoblastoz ma na celu jedynie zwiększenie czasu przeżycia pacjentów i poprawę ich jakości życia. Według kilku dużych badań, przedłużone przeżycie wolne od choroby po alloprzeszczepie HSC osiąga się u 40% pacjentów onkohematologicznych. Podczas korzystania z komórek macierzystych zgodnego z HbA rodzeństwa, najlepsze wyniki obserwuje się u młodych pacjentów z krótką historią choroby, liczbą komórek blastycznych do 10% i korzystną cytogenetyką. Niestety, śmiertelność związana z procedurą allotransplantacji HSC u pacjentów z chorobami mielodysplastycznymi pozostaje wysoka (w większości raportów - około 40%). Wyniki 10 lat pracy dawstwa szpiku kostnego US Narodowego Programu (510 pacjentów, średni wiek - 38 lata) wskazują, że czas przeżycia wolnego od choroby wynosi 29% w ciągu dwóch lat na stosunkowo niskim prawdopodobieństwem nawrotu (14%). Jednakże śmiertelność spowodowana procedurą alotransplantacji GSC od niepowiązanego dawcy jest wyjątkowo wysoka i sięga 54% w ciągu dwóch lat. Podobne wyniki uzyskano w badaniu europejskim (118 pacjentów, mediana wieku 24 lata, 2-letnie przeżycie bez nawrotów 28%, nawrót 35%, śmiertelność 58%).

Podczas przeprowadzania intensywnych kursów chemioterapii z późniejszym przywróceniem hematopoezy przez allogeniczne komórki krwiotwórcze często pojawiają się powikłania immunohematologiczne i transfuzje. Pod wieloma względami są one związane z faktem, że grupy krwi u ludzi są dziedziczone niezależnie od cząsteczek MHC. Dlatego nawet jeśli dawcy i biorcy są kompatybilne z głównymi antygenami HLA, ich erytrocyty mogą mieć inny fenotyp. Przydzielanie „duże” niezgodność, gdy preegzystował w przeciwciele biorcy na antygeny dawcy czerwonych krwinek, a „małe”, gdy przeciwciała dawcy do antygenów krwinek czerwonych odbiorcy. Zdarzają się przypadki połączenia "dużych" i "małych" niezgodności.

Wyniki analizy porównawczej skuteczności klinicznej szpiku kostnego i krwiotwórczych komórek macierzystych pępowinowej przeszczepów krwionośnych nowotworów hematologicznych wskazują, że dzieci allotransplantacja GSK przewód krwi znacznie zmniejsza ryzyko reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi”, ale nie jest dłuższy okres pokrycia obojętnochłonnych i płytek wyższa częstotliwość 100-dniowej śmiertelności po przeszczepie.

Badanie przyczyn wczesnej letalności umożliwiło wyjaśnienie przeciwwskazań do allogenicznego przeszczepu GSK, wśród których najważniejsze to:

• obecność u biorcy lub dawcy pozytywnych testów na zakażenie wirusem cytomegalii (bez przeprowadzenia leczenia zapobiegawczego);
• ostra choroba popromienna;
• obecność lub nawet podejrzenie obecności infekcji grzybiczej u pacjenta (bez systemowej wczesnej profilaktyki za pomocą leków grzybobójczych);
• hemoblastozy, w których pacjenci otrzymywali przedłużone leczenie cytostatykami (z powodu wysokiego prawdopodobieństwa nagłego zatrzymania krążenia i niewydolności wielonarządowej);
• przeszczep z dawców nieidentycznych HLA (bez zapobiegania ostrej reakcji "przeszczepu przeciwko gospodarzowi" przez cyklosporynę A);
• przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby typu C (ze względu na wysokie ryzyko rozwoju veno-okluzyjnej choroby wątroby).

Zatem HSC transplantacja może powodować poważne powikłania, które często prowadzą do śmierci. Na początku (do 100 dni po transplantacji) okres obejmują one powikłań infekcyjnych, ostra reakcja „przeszczep przeciwko gospodarzowi”, odrzucenie przeszczepu (neprizhivlenie HSC dawcy), venookklyuzionnaya choroby wątroby, a także ze względu na toksyczność kondycjonowaniu, uszkodzenia tkanki, na której wysoką charakterystykę szybkość przebudowy (skóra, śródbłonku naczyń, nabłonek jelitowy). Powikłania późnym okresie po transplantacji obejmują przewlekłe reakcji „przeszczep przeciwko gospodarzowi” nawrót choroby podstawowej, opóźnienie wzrostu u dzieci, zaburzenia funkcji rozrodczych i choroby tarczycy oczu.

Ostatnio, w związku z pojawieniem się publikacji na temat plastyczności komórek szpiku kostnego, pojawił się pomysł zastosowania GSK w leczeniu zawałów serca i innych chorób. Chociaż niektóre eksperymenty na zwierzętach również wspierają tę możliwość, wnioski dotyczące plastyczności komórek szpiku kostnego muszą zostać potwierdzone. Okoliczność ta powinna być brana pod uwagę przez tych naukowców, którzy uważają, że przeszczepione komórki ludzkiego szpiku kostnego łatwo przekształcają się w komórki mięśni szkieletowych, mięśnia sercowego lub OUN. Hipoteza, że GSK są naturalnym komórkowym źródłem regeneracji tych narządów, wymaga poważnych dowodów.

W szczególności, opublikowane pierwsze wyniki otwartym randomizowanym badaniu BELENKOVA V. (2003), którego celem - w celu zbadania wpływu C-SIS (czyli mobilizacja autologicznych HSC krwi) na klinicznej hemodynamiczny i statusu neurohumoralnej pacjentów z umiarkowaną lub ciężką niewydolnością serca, jak również jego oceny bezpieczeństwa ze standardową terapią (inhibitory ACE, beta-blokery, diuretyki, glikozydy nasercowe). Pierwsza publikacja wyników autorzy programu badawczego jest pamiętać, że jedynym argumentem przemawiającym O-CBP są wyniki leczenia jednego pacjenta w trakcie leczenia tym lekiem znaleziono niezaprzeczalną poprawę wszystkich parametrów hemodynamicznych i klinicznych. Jednak teoria HSC mobilizacji do krwiobiegu, a następnie regeneracji mięśnia sercowego w strefie pozawałowej nie zostało potwierdzone - nawet u chorych z dodatnią dynamiką klinicznych echokardiografii obciążeniowej z dobutaminą nie ujawnił pojawienie żywotnego mięśnia sercowego w obszarach blizna dziedzinie.

Należy zauważyć, że w chwili obecnej dane, które pozwalają zalecić substytucyjną terapię komórkową do powszechnego wprowadzenia do codziennej praktyki klinicznej, zdecydowanie nie wystarczą. Dobrze przygotowane i jakościowe wykonanie badań klinicznych w celu określenia skuteczności różnych opcji regeneracyjnej terapii komórkowej, rozwój wskazań i przeciwwskazań do niego, a także wytycznych dotyczących skojarzonego stosowania regeneracyjnym i terapii plastycznej i konwencjonalnego leczenia operacyjnego lub zachowawczego. Jak dotąd, nie ma odpowiedzi na pytanie, jaki rodzaj populacji komórek krwiotwórczych szpiku kostnego (macierzystych lub zrębowych) może prowadzić do neuronów i kardiomiocytów, a nie jest jasne, co przyczyni się do tego warunki in vivo.

Praca w tych obszarach odbywa się w wielu krajach. W podsumowaniu sympozjum na ostrą niewydolność wątroby US National Institutes of Health wśród obiecujących metod leczenia, wraz z transplantacji wątroby, przeszczep oznaczone ksenonowe lub allogenicznych i hepatocyty w bioreaktorach vitro połączenia z komórek wątrobowych. Istnieją bezpośrednie dowody, że tylko obce, funkcjonalnie aktywne hepatocyty mogą zapewnić skuteczne wsparcie dla wątroby biorcy. Do klinicznego zastosowania izolowanych hepatocytów konieczne jest utworzenie banku komórek, który znacząco skróci czas pomiędzy uwalnianiem komórek a ich użyciem. Najbardziej akceptowalnym sposobem tworzenia banku izolowanych hepatocytów jest kriokonserwacja komórek wątroby w ciekłym azocie. W przypadku stosowania takich komórek w klinice u pacjentów z ostrą i przewlekłą niewydolnością wątroby stwierdzono dość wysoki efekt terapeutyczny.

Pomimo optymistycznych i zachęcających wyników zastosowania transplantacji komórek wątroby w eksperymencie i klinice, istnieje wiele problemów, które wciąż są dalekie od ich rozwiązania. Należą do nich ograniczone ilości odpowiednich organów, do uzyskania pojedynczych hepatocytów niewystarczająco skuteczne sposoby rozdzielania, brak standardowych sposobów konserwowania komórek wątroby rozmytej zrozumienia mechanizmów regulacji wzrostu i proliferacji komórek przeszczepionych komórek, brak odpowiedniej oceny metody wszczepienie lub odrzucenia allogenicznych hepatocytów. Te powinny być również obejmują obecność odporności transplantacji użyciem komórek allogenicznych albo ksenogenicznych, ale mniej niż przeszczepieniu wątroby, lecz wymaga stosowania środków immunosupresyjnych, kapsułkowania wyizolowane hepatocyty lub specjalne enzymy przetwarzania. Transplantacja hepatocytów często prowadzi do konfliktów między odpornościowego biorcy i dawcy w reakcji odrzucenia, który wymaga korzystania z cytostatykami. Jednym z rozwiązań tego problemu jest zastosowanie polimerów mikroporowatych materiałów do izolacji komórek wątroby, które poprawiają ich przetrwania, ponieważ membrana kapsułki skutecznie chroni hepatocyty mimo immunizacji gospodarza.

Jednakże, ostrą niewydolność wątroby, takiego przeszczepienia hepatocytów nie ma wpływu ze względu na dość długi czas wymagany do zasiedlania komórek wątroby w nowym środowisku dostęp do etapu optymalnego funkcjonowania. Potencjalnym ograniczeniem jest wydzielanie żółci ektopowej przeszczepu izolowanych hepatocytów i przy użyciu bioreaktorów istotne fizjologiczne bariery działa gatunków różnicę między ludzkimi białkami a białkami, które wytwarzają ksenogeniczne hepatocytów.

W literaturze istnieją doniesienia, że lokalna przeszczep szpiku kostnego komórek macierzystych zrębu ułatwia sprawną korekcję wad kości i odbudowę kości w tym przypadku jest bardziej intensywny niż w spontanicznej regeneracji reparacyjnej. W kilku badaniach przedklinicznych na modelach eksperymentalnych przekonująco wykazano możliwość zastosowania przeszczepów szpiku kostnego ze szpiku kostnego w ortopedii, chociaż potrzebne są dalsze prace w celu optymalizacji tych technik, nawet w najprostszych przypadkach. W szczególności nie znaleziono jeszcze optymalnych warunków dla ekspansji osteogennych komórek zrębowych ex vivo, struktura i skład ich idealnego nośnika (matrycy) pozostają nieobrobione. Nie określono minimalnej liczby komórek potrzebnych do masowej regeneracji kości.

Udowodniono, że mezenchymalne komórki macierzyste wykazują plastyczność transgermalną - zdolność różnicowania się w typy komórkowe, które są fenotypowo niezwiązane z komórkami pierwotnej linii. W optymalnych warunkach poliklonalną linię komórek macierzystych hodowli komórek zrębu szpiku kostnego in vitro prowadzonych na więcej niż 50 podziałów, co sprawia, że możliwy jest odbiór miliardy komórek zrębowych 1 ml aspiratu szpiku kostnego. Jednakże populacja mezenchymalnych komórek macierzystych, znamienny tym, niejednorodności, co przejawia się w postaci zmienności wielkości kolonii, z różnymi prędkościami i powstawania morfologicznego różnorodność rodzajów komórek - z fibroblastów wrzecionowate dużych płaskich komórek. W ciągu 3 tygodni hodowla komórek macierzystych zrębu obserwuje się fenotypu niejednorodności: jedna tworzących kolonie bryłek tkanki kostnej, zaś inne - skupiska komórek tłuszczowych i inne, rzadziej, tworząc wyspy chrząstki.

W leczeniu chorób zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego po raz pierwszy zastosowano transplantację zarodkowej tkanki nerwowej. W ostatnich latach zamiast tkanki zarodkowego mózgu transplantowano elementy komórkowe neurosfer pochodzących z nerwowych komórek macierzystych (Poltavtseva, 2001). Neurosfery zawierają zaangażowane prekursory nerwowe i neuroglinię - daje to nadzieję na przywrócenie utraconych funkcji mózgu po przeszczepieniu. Po przeszczepie komórek na neurosfer rozproszone ciało prążkowia mózgu szczura oznaczone ich proliferację i różnicowanie neuronów dopaminergicznych, co eliminuje asymetrii silnika u szczurów z gemiparkinsonizmom doświadczalnej. Jednak w niektórych przypadkach komórki nowotworowe powstały z komórek neurosfery, co doprowadziło do śmierci zwierząt (Bjorklund, 2002).

Klinika Dokładne badanie dwóch grup pacjentów, u których ani pacjenci, ani lekarze nie wiedzieli ich (double-blind) obserwowanie, że jedna grupa pacjentów przeszczepione tkanki embrionalnej z neuronów produkujących dopaminę, druga grupa pacjentów popełnił fałszywy krok, dał nieoczekiwane rezultaty . Pacjenci, którzy zostali przeszczepieni zarodkowymi tkankami nerwowymi, nie czuli się lepiej niż pacjenci z grupy kontrolnej. Ponadto 5 z 33 pacjentów po 2 latach po transplantacji embrionalnej tkanki nerwowej opracowany uporczywy dyskinezy, który nie miał grupę pacjentów z grupy kontrolnej (komórki macierzyste: postęp naukowy i przyszłych kierunków badań Nat Inst, Zdrowia USA ...). Jednym z nierozwiązanych problemów klinicznych badaniach mózgu nerwowych komórek macierzystych jest analiza realnych perspektyw i ograniczenia ich pochodnych transplantacji korekcji zaburzeń OUN. Jest możliwe, że przedłużona aktywność napadu wywołane neyronogenez w hipokampie, które prowadzą do zmian strukturalnych i funkcjonalnych może być czynnikiem w postępującym rozwojem padaczki. Wniosek ten jest szczególnie godne uwagi, ponieważ wskazuje na możliwe negatywne skutki powstawania nowych neuronów w mózgu dorosłych i powstawanie nieprawidłowych połączeń synaptycznych.

Nie należy zapominać, że w podłożu hodowlanym z cytokinami mitogeny) (w przybliżeniu właściwości komórek macierzystych, do komórek nowotworowych, tak jak występują one w pobliżu zmian w regulacji cyklu komórki, które określają zdolność dzielenia przez czas nieokreślony. Głupotą jest przeszczepienie ludziom wczesnych pochodnych zarodkowych komórek macierzystych, ponieważ w tym przypadku zagrożenie rozwojem złośliwych nowotworów jest bardzo duże. Znacznie bezpieczniej jest używać ich bardziej zaangażowanych potomków, czyli komórek progenitorowych o zróżnicowanych liniach. Jednak obecnie nie opracowano jeszcze niezawodnej techniki otrzymywania stabilnych linii komórkowych ludzkich, różnicujących we właściwym kierunku.

Wykorzystanie technologii biologii molekularnej do korekcji dziedzicznej patologii i chorób ludzi za pomocą modyfikacji komórek macierzystych jest bardzo interesujące dla medycyny praktycznej. Cechy genomu komórek macierzystych umożliwiają rozwój unikalnych programów przeszczepiania w celu korygowania chorób genetycznych. Ale w tym kierunku istnieje również szereg ograniczeń, które należy pokonać, zanim zacznie się praktyczne zastosowanie inżynierii genetycznej komórek macierzystych. Przede wszystkim konieczne jest zoptymalizowanie procesu modyfikacji genomu komórek macierzystych ex vivo. Wiadomo, że przedłużona (3-4 tygodnie) proliferacja komórek macierzystych zmniejsza ich transfekcję, więc kilka cykli transfekcji jest niezbędnych do osiągnięcia wysokiego poziomu ich genetycznej modyfikacji. Jednak główny problem związany jest z czasem trwania ekspresji genu terapeutycznego. Do tej pory w żadnym z badań okres skutecznej ekspresji po przeszczepie zmodyfikowanych komórek nie przekraczał czterech miesięcy. W 100% przypadków w czasie ekspresja transfekowanych genów jest zmniejszona z powodu inaktywacji promotorów i / lub śmierci komórek ze zmodyfikowanym genomem.

Ważnym problemem jest koszt korzystania z technologii komórkowych w medycynie. Na przykład szacowany roczny wymóg finansowania jedynie kosztów leczenia wydziału transplantacji szpiku kostnego, który ma na celu wykonanie 50 przeszczepów rocznie, wynosi około 900 000 USD.

Rozwój technologii komórkowych w medycynie klinicznej jest złożonym i wieloetapowym procesem obejmującym konstruktywną współpracę multidyscyplinarnych ośrodków naukowych i klinicznych oraz społeczności międzynarodowej. Jednocześnie zwraca się szczególną uwagę na organizację badań naukowych w dziedzinie terapii komórkowej. Najważniejsze z nich to opracowywanie protokołów badań klinicznych, monitorowanie ważności danych klinicznych, tworzenie krajowego rejestru badań, integracja z międzynarodowymi programami wieloośrodkowych badań klinicznych oraz wprowadzanie wyników do praktyki klinicznej.

Zawarcie wprowadzenie do zagadnień związanych z transplantacją komórek, chciałbym wyrazić nadzieję, że wspólne wysiłki czołowych ekspertów Ukrainy z różnych dziedzin nauki zapewni znaczny postęp w badaniach doświadczalnych i klinicznych i pozwoli w najbliższych latach do znalezienia skutecznych sposobów, aby pomóc ciężko chorym potrzebującym przeszczepów narządów , tkanki i komórki.

[13], [14], [15], [16], [17], [18]