Molekularne metody genetyczne w diagnostyce chorób dziedzicznych
Ostatnia recenzja: 23.04.2024
Cała zawartość iLive jest sprawdzana medycznie lub sprawdzana pod względem faktycznym, aby zapewnić jak największą dokładność faktyczną.
Mamy ścisłe wytyczne dotyczące pozyskiwania i tylko linki do renomowanych serwisów medialnych, akademickich instytucji badawczych i, o ile to możliwe, recenzowanych badań medycznych. Zauważ, że liczby w nawiasach ([1], [2] itd.) Są linkami do tych badań, które można kliknąć.
Jeśli uważasz, że któraś z naszych treści jest niedokładna, nieaktualna lub w inny sposób wątpliwa, wybierz ją i naciśnij Ctrl + Enter.
Metody technologii DNA są wykorzystywane do określenia lokalizacji w danym chromosomie zmutowanego genu odpowiedzialnego za powstawanie niektórych form dziedzicznej patologii. Ponieważ gen jest segmentem DNA i mutacja genu - uszkodzenie struktury pierwotnej DNA (mutacja jest zrozumiałe dla wszystkich zmian w sekwencji DNA, niezależnie od ich lokalizacji i wpływu na indywidualną żywotności), a następnie sondowania preparaty chromosomów metafazy pacjenta chorobą dziedziczną, możliwe ustalenie lokalizacja patologicznego genu. Metody genetyki molekularnej stwarzają możliwości diagnozowania chorób na poziomie zmienionej struktury DNA, pozwalają na poznanie lokalizacji chorób dziedzicznych. Molekularne metody genetyczne mogą ujawnić mutacje związane z zastąpieniem nawet jednej zasady.
Najważniejszym etapem identyfikacji genu jest jego izolacja. DNA można wyizolować z dowolnego typu tkanki i jąder zawierających komórki. Etapy izolacji DNA obejmują szybkiej lizy komórek za pomocą wirowania z usuwaniem fragmenty organelli komórkowych i błon, enzymatycznych niszczenie białek i ich ekstrakcji z roztworu fenolu i chloroformu, stężenie DNA przez wytrącenie etanolem.
W laboratoriach genetycznych DNA najczęściej izoluje się z leukocytów krwi, za które pacjentowi pobiera się 5-20 ml krwi żylnej w jałowej probówce z roztworem przeciwzakrzepowym (heparyną). Leukocyty są następnie rozdzielane i przetwarzane zgodnie z etapami opisanymi powyżej.
W następnym etapie przygotowania surowca do badania DNA - „cut” do fragmentów w miejscach, w ściśle określonej kolejności bazowej odbywa się za pomocą enzymów bakteryjnych - endonukleaz restrykcyjnych (enzymów restrykcyjnych). Enzymy restrykcyjne rozpoznawać specyficzne sekwencje 4-6, co najmniej 8-12 nukleotydów do cząsteczki DNA dwuniciowy i jego rozdzielone na fragmenty tych sekwencji zlokalizowanie miejsc zwanych miejscami restrykcyjnymi. Ilość wytwarzany Fragmenty restrykcyjne DNA zależy od częstotliwości występowania miejsc restrykcyjnych i fragmentów o wielkości: - rodzaj rozmieszczenia tych miejscach wzdłuż długości pierwotnej cząsteczki DNA. Im częściej miejsca restrykcyjne są zlokalizowane, tym krótsze fragmenty DNA po ograniczeniu. Obecnie znanych jest ponad 500 różnych rodzajów enzymów restrykcyjnych pochodzenia bakteryjnego, a każdy z tych enzymów rozpoznaje swoistą sekwencję nukleotydów. W przyszłości miejsca restrykcyjne mogą być wykorzystywane jako markery genetyczne dla DNA. Otrzymane fragmenty restrykcyjne DNA mogą być klasyfikowane pod względem długości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, a więc można określić ich masy cząsteczkowej. Zwykle do wykrycia DNA w żelu wykorzystywanego przez specyficzne barwienie bromkiem etydyny (zazwyczaj) i wyświetlania żel pod światło ultrafioletowe. Lokalizacje lokalizacji DNA mają czerwony kolor. Jednakże osoba przetwarzania wielu ograniczeń DNA endonukleazami utworzone tak wiele fragmentów o różnej długości, które nie będą one być rozdzielone przez elektroforezę, to nie jest możliwe, aby zidentyfikować wzrokowo jego fragmentów DNA do electrophoregram (produkowanego jednolitego zabarwienia na całej długości żelu). Dlatego do identyfikacji pożądanych fragmentów DNA w takim żelu stosuje się metodę hybrydyzacji ze znakowanymi sondami DNA.
Dowolny jednoniciowy segment DNA lub RNA jest zdolny do wiązania (hybrydyzacji) z łańcuchem komplementarnym, a guanina jest zawsze związana z cytozyną, adenina z tyminą. Jest to tworzenie dwuniciowej cząsteczki. Jeśli jednoniciowa kopia sklonowanego genu jest wyznakowana radioaktywnym znacznikiem, uzyskana zostanie sonda. Sonda jest w stanie znaleźć komplementarny segment DNA, który jest następnie łatwo identyfikowany za pomocą radiografii. Radioaktywna sonda dodana do leku o rozciągniętych chromosomach umożliwia zlokalizowanie genu na określonym chromosomie: pewne próbki DNA można zidentyfikować za pomocą sondy DNA w Southern blotting. Hybrydyzacja występuje, jeśli część testowa DNA zawiera normalny gen. W przypadku, gdy występuje nieprawidłowa sekwencja nukleotydów, to znaczy odpowiednie struktury chromosomowe zawierają zmutowany gen, nie nastąpi hybrydyzacja, która pozwala na określenie lokalizacji patologicznego genu.
Aby uzyskać sondy DNA, stosuje się metodę klonowania genów. Istota sposobu polega na tym, że fragment DNA odpowiadający genu lub regionu genu wstawionego do cząstki klonowania, zwykle plazmid bakteryjny (kołowym pozachromosomalny DNA obecnego w komórkach bakteryjnych i przenoszenia genów oporności na antybiotyki) i bakterii posiadające plazmid z wbudowanym genem ludzkim są mnożone. Dzięki procesom syntezy w plazmidzie możliwe jest uzyskanie miliardów kopii ludzkiego genu lub jego miejsca.
Ponadto, kopie DNA znakowane radioaktywnym znacznikiem lub fluorochromami są wykorzystywane jako sondy do wyszukiwania sekwencji komplementarnych w puli badanych cząsteczek DNA.
Obecnie istnieje wiele odmian metod wykorzystujących sondy DNA do diagnozy mutacji genowych.