Rola enzymów i cytokin w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów

W ostatnich latach wiele badań skupiło się na identyfikacji proteaz odpowiedzialnych za degradację ECM chrząstki stawowej w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Według współczesnych idei ważną rolę w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów odgrywają metaloproteinazy macierzy (MMP). Pacjenci z chorobą zwyrodnieniową stawów mają zwiększony poziom trzech przedstawicieli MMP - kolagenazy, stromelizyny i żelatynazy. Kolagenaza jest odpowiedzialna za degradację natywnego kolagenu, stromelizyny - kolagenu typu IV, proteoglikanów i laminin, żelatynazy do degradacji żelatyny, kolagenu IV, typy Vh XI, elastyny. Ponadto obecność innego enzymu - agrekanaza, która ma właściwości MMP i jest odpowiedzialna za proteolizę chrzęstnych agregatów proteoglikanów.

Chrząstki stawowej człowieka kolagenazy wyróżnić trzy typy poziomie, który jest podwyższony u pacjentów z zapaleniem kości i stawów - kolagenazy-1 (MMP-1), kolagenazy-2 (MMP-8), kolagenazy-3 (MMP-13). Współistnienie trzech różnych typów kolagenazy w chrząstce stawowej wskazuje, że każdy z nich odgrywa swoją własną, specyficzną rolę. Rzeczywiście, kolagenazy-1 i -2 są zlokalizowane głównie w powierzchniowej i górnej strefy pośredniej chrząstki stawowej, podczas gdy kolagenazy-3 znajduje się w dolnej części stref pośrednich i głębokości. Ponadto, wyniki badań immunohistochemicznych pokazują, że w trakcie progresji choroby zwyrodnieniowej stawów poziomie kolagenazy-3 osiąga plateau lub nawet spada, podczas gdy poziom kolagenazy-1 jest stopniowo zwiększana. Istnieją dowody, że w przypadku choroby zwyrodnieniowej stawów kolagenaza-1 jest głównie zaangażowana w proces zapalny w chrząstce stawowej, podczas gdy kolagenaza-3 bierze udział w przebudowie tkanki. Kartagina-3, ulegająca ekspresji w chrząstce pacjentów z OA, bardziej intensywnie degraduje kolagen typu II niż kolagenaza-1.

Przedstawicieli drugiej grupy metaloproteaz stromelizinovu Human zidentyfikowany jako trzy - stromelizyny-1 (MMP-3), stromelizyny-2 (MMP-10) i stromelizyny-3 (MMP-11). Dziś wiadomo, że tylko stromelizyna-1 bierze udział w patologicznym procesie w chorobie zwyrodnieniowej stawów. W błonie maziowej pacjentów z chorobą zwyrodnieniową nie wykryto stromelizyny-2, ale wykryto ją w bardzo małej ilości w fibroblastach maziówkowych pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów. Stromelysin-3 występuje również w błonie maziowej pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów w pobliżu fibroblastów, szczególnie w strefach zwłóknienia.

W grupie żelatynowej tylko dwie zostały zidentyfikowane w ludzkiej tkance chrząstki: żelatynaza 92 kD (żelatynaza B lub MMP-9) i żelatyna w 72 kD (żelatynaza A lub MMP-2); u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową kości określa się wzrost poziomu żelatyny z 92 kDa.

Nie tak dawno temu zidentyfikowano inną grupę MMP, które są zlokalizowane na powierzchni błon komórkowych i nazywane są typem membrany MMP (MMP-MT). Do tej grupy należą cztery enzymy - MMP-MT1-MMP-MT-4. Ekspresja MMP-MT znajduje się w ludzkiej chrząstce stawowej. Chociaż MMP-MT-1 ma właściwości kolagenazy, zarówno MMP-MT-1, jak i MMP-MT-2 są zdolne do aktywacji żelatynazy-72 kD i kolagenazy-3. Rola tej grupy MMP w patogenezie OA wymaga udoskonalenia.

Proteinaza jest wydzielana w formie zymogenu, który jest aktywowany przez inne proteinazy lub związki organiczne rtęci. Katalityczna aktywność MMP zależy od obecności cynku w aktywnej strefie enzymu.

Aktywność biologiczna MMP jest kontrolowana przez specyficzne TIMP. Dotychczas zidentyfikowano trzy typy TIMP, które można znaleźć w ludzkich tkankach stawowych, TIMP-1-TIMP-3. Czwarty typ TIMP został zidentyfikowany i sklonowany, ale nie został jeszcze wykryty w ludzkich tkankach stawowych. Te cząsteczki wiążą się swoiście z aktywnym miejscem MMP, chociaż niektóre z nich są zdolne do wiązania aktywnego centrum pro-żelatynazy o 72 kD (TIMP-2, -3, -4) i żelatydazy 92 kD (TIMP-1 i -3). Dane wskazują, że przy OA w chrząstce stawowej występuje brak równowagi między MMP i TIMP, co powoduje względny niedobór inhibitorów, co może częściowo wynikać ze zwiększenia poziomu aktywnej MMP w tkance. TIMP-1 i -2 znajdują się w chrząstce stawowej, są syntetyzowane przez chondrocyty. W przypadku zapalenia kości i stawów w błonie maziowej i płynie maziowym wykryto tylko pierwszy typ TIMP. TIMP-3 wykrywany jest wyłącznie w ECM. TIMP-4 ma prawie identyczną sekwencję aminokwasową z TIMP-2 i-ZINA około 38% -STIMP-1 o prawie 50%. W innych komórkach docelowych TIMP-4 jest odpowiedzialny za modulowanie aktywacji progestagenaz 72 kD na powierzchni komórki, co wskazuje na ważną rolę jako swoisty dla tkanki regulator przebudowy ECM.

Kolejnym mechanizmem kontrolującym aktywność biologiczną MMP jest ich aktywacja fizjologiczna. Uważa się, że enzymy z rodziny proteaz serynowych i cysteinowych, takie jak AP / plazmina i katepsyna B, odpowiednio, są fizjologicznymi aktywatorami MMP. W chrząstce stawowej pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów wykryto podwyższony poziom urokinazy (UAP) i plazminy.

Pomimo faktu, że w tkankach stawowych znajduje się kilka rodzajów katepsyn, katepsyna-B jest uważana za najbardziej prawdopodobny aktywator MMP w chrząstce. W tkankach stawu ludzkiego wykryto fizjologiczne inhibitory proteaz serynowych i cysteinowych. Aktywność inhibitora AP-1 (IAP-1), a także proteaz cysteinowych jest zmniejszona u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Podobnie jak w przypadku MMP / TIMP, brak równowagi pomiędzy proteazą serynową i cysteinową oraz ich inhibitorami może tłumaczyć zwiększoną aktywność MMP w chrząstce stawowej pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Ponadto, MMP mogą się nawzajem aktywować. Na przykład stromelizyna-1 aktywuje kolagenazę-1, kolagenazę-3 i żelatyna-zę 92 kD; Kolagenaza-3 aktywuje żelatynę o mocy 92 kD; MMP-MT aktywuje kolagenazę-3, a żelatynaza-72 kD nasila tę aktywację; MMP-MT aktywuje również żelatynę 72 kD. Cytokiny można podzielić na trzy grupy - destrukcyjne (prozapalne), regulacyjne (w tym przeciwzapalne) i anaboliczne (czynniki wzrostu).

Rodzaje cytokin (według van den Berg WB et al)

Niszczący	Interleukina-1 TNF-a Czynnik hamujący białaczkę Interleukina-17
Regulacyjny	Interlekin-4 Interleukina-10 Interleukin-13 Inhibitory enzymów
Anaboliczny	Mulina-podobne czynniki wzrostu TGF-b Białka morfogenetyczne kości Białka morfogenetyczne pochodzące z chrząstki

Destruktywne cytokiny, w szczególności IL-1, indukują wzrost uwalniania proteaz i hamują syntezę proteoglikanów i kolagenu przez chondrocyty. Cytokin regulacyjnych, w szczególności IL-4 i -10, hamują produkcję antagonisty receptora IL-1, do zwiększania produkcji IL-1 (IL-1 RA) oraz zmniejszenie poziomu i aktywności syntazy NO w chondrocytów. Tak więc, IL-4 jest antagonistą IL-1 na trzy sposoby: 1) zmniejsza wytwarzanie i zapobiega jego skutków, 2) zwiększa wytwarzanie podstawowe „scavenger” IL-1 Pa i 3) zmniejsza wytwarzanie podstawowej dodatkowy „posłańca» NO. Ponadto IL-4 zmniejsza degradację enzymatyczną. W warunkach in vivo optymalny efekt terapeutyczny uzyskuje się w kombinacji z IL-4 i IL-10. Czynników anabolicznych, takich kakTFR-P, a poziom IGF-1, produkt nie wpływają na wytwarzanie lub działanie IL-1, ale pokazujący przeciwnym aktywności, na przykład, pobudzają syntezę proteoglikanu i kolagenu, hamują aktywność proteazy i TGF (3 hamuje również wydzielanie enzymów i stymuluje ich inhibitory.

Prozapalne cytokiny są odpowiedzialne za zwiększoną syntezę i ekspresję MMP w tkankach stawowych. Są syntetyzowane w błonie maziowej, a następnie rozpraszają się w chrząstce stawowej przez płyn maziowy. Prozapalne cytokiny aktywują chondrocyty, które z kolei są również zdolne do wytwarzania prozapalnych cytokin. W stawach dotkniętych chorobą zwyrodnieniową rolę efektora stanu zapalnego odgrywają głównie komórki błony maziowej. Jest to zapalenie błony maziowej typu makrofagów, które wydzielają proteazy i mediatory stanu zapalnego. Wśród nich, w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów, IL-f, TNF-α, IL-6, białaczkowy czynnik hamujący (LIF) i IL-17 są zaangażowane w największym stopniu.

Biologicznie aktywne substancje, które stymulują degradację chrząstki stawowej w chorobie zwyrodnieniowej stawów

• Interleukina-1
• Interlekin-3
• Interlekin-4
• TNF-a
• Czynniki stymulujące wzrost kolonii: makrofagi (monocytowe) i granulocytowo-makrofagowe
• Substancja P
• PGE ₂
• Aktywatory plazminogenu (tkanki i typy urokinazy) i plazminy
• Metaloproteazy (kolagenazy, ellastazy, stromelizyny)
• Katepsyna A i B
• kryminał
• Bakteryjne lipopolisacharydy
• Fosfolipaza Ag

Dane literaturowe wskazują, że IL-ip i, być może, TNF-α, są głównymi mediatorami niszczenia tkanek stawowych w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Jednak wciąż nie wiadomo, czy działają one niezależnie od siebie, czy istnieje funkcjonalna hierarchia między nimi. W modelach zapalenia kości i stawów u zwierząt wykazano, że IL-1 blokada skutecznie uniemożliwia niszczenie chrząstki stawowej, podczas gdy blokowanie TNF-a prowadzi do osłabienia zapalnych w tkankach stawów. W błonie maziowej, płynie maziowym i chrząstce pacjentów wykryto podwyższone stężenia obu cytokin. Chondrocyty są zdolne do zwiększania syntezy nie tylko proteazy (MMP a głównie AP), ale również mniejsze, takie jak kolageny typu I i III, jak również zmniejszenie syntezy kolagenu typu II i IX oraz proteoglikanów. Cytokiny te stymulują aktywnych związków tlenu i mediatory zapalne, takie jak PGE ₂. Wynikiem takich makrocząsteczkowych zmian w chrząstce stawowej z chorobą zwyrodnieniową jest nieskuteczność procesów naprawczych, co prowadzi do dalszej degradacji chrząstki.

Wyżej wymienione prozapalne cytokiny modulują procesy hamowania / aktywacji MMP w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Na przykład, brak równowagi pomiędzy poziomami TIMP-1 i MMP chrząstki w chorobie zwyrodnieniowej stawów może odbywać się za pośrednictwem IL-ip, ponieważ badania in vitro wykazały, że wzrost stężenia IL-1 beta zmniejsza stężenie TIMP-1 i MMP zwiększona synteza przez chondrocyty. Synteza AP jest także modulowana przez IL-1beta. Stymulację in vitro chondrocyty chrząstki stawowej z IL-1 vyzyvet zależny od dawki wzrost syntezy i AP ostry spadek syntezy PAI-1. Zdolność IL-1 do zmniejszenia syntezy PAI-1 i stymuluje syntezę AP potężny mechanizm do wytwarzania pobudzenia plazminy i MMP. Ponadto plazmin jest nie tylko enzymem aktywującym inne enzymy, lecz także bierze udział w procesie degradacji chrząstki poprzez bezpośrednią proteolizę.

IL-ip jest syntetyzowana w postaci nieaktywnego prekursora masie 31 kDa (pre-IL-ip), Azat po odcięciu peptydu sygnałowego, który przekształca się do aktywnej cytokiny z masy 17,5 kDa. W tkankach stawów, w tym w błonie maziowej i płynie maziowym pacjentów z chrząstki, IL-Ip wykryciu w postaci aktywnej, w badaniach in vivo wykazały zdolność błony maziowej w choroby zwyrodnieniowej wydzielania tej cytokiny. Niektóre proteazy serynowe są zdolne do przekształcania pre-IL-ip w jej bioaktywną postać. U ssaków te właściwości występują tylko w jednej proteazy, która należy do rodziny enzymów cysteiny aspartatspetsificheskih zwany IL-1p konwertującego angiotensynę (IKF lub kaspaza-1). Ten enzym jest zdolny do swoistej konwersji pre-IL-ip w biologicznie czynną "dojrzałą" IL-ip o masie 17,5 kD. IKF jest proenzymem o masie cząsteczkowej 45 kD (p45), która jest umiejscowiona w błonie komórkowej. Po proteolitycznym rozszczepieniu proenzymu p45 tworzy się dwie podjednostki, znane jako p10 i p20, które charakteryzują się aktywnością enzymatyczną.

TNF-a jest również syntetyzowany jako prekursor związany z błoną o masie 26 kD; przez rozszczepienie proteolityczne jest uwalniane z komórki jako aktywna postać rozpuszczalna o masie 17 kD. Cięcie proteolityczne prowadzi się przez enzym konwertujący TNF-α (TNF-KF), który należy do rodziny adamalysin. AR Amin i współautorzy (1997) stwierdzili zwiększoną ekspresję mRNA TNF-CF w chrząstce stawowej pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.

Biologiczna aktywacja chondrocytów i synowitocytów IL-1 i TNF-a odbywa się poprzez wiązanie się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek - IL-R i TNF-R. Dla każdej cytokiny zidentyfikowano dwa typy receptorów: IL-IP typów I i II oraz TNF-P1 (p55) i II (p75). Do transmisji sygnałów w komórkach tkanek stawowych odpowiadają IL-1PI i p55. IL-1P typu I ma nieco wyższe powinowactwo do IL-1 beta niż do IL-1a; IL-1P typu II - wręcz przeciwnie, ma większe powinowactwo do IL-1a niż do IL-ip. Pozostaje niejasne, czy IL-IP II typu II może pośredniczyć w sygnałach IL-1, czy służy jedynie do konkurencyjnego hamowania wiązania IL-1 z typem IL-1PI. W chondroitach i fibroblastach maziówkowych u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów stwierdza się dużą liczbę IL-1PI i p55, co z kolei wyjaśnia wysoką wrażliwość tych komórek na stymulację odpowiednimi cytokinami. Proces ten prowadzi zarówno do zwiększenia sekrecji enzymów proteolitycznych, jak i do zniszczenia chrząstki stawowej.

Nie wyklucza się udziału IL-6 w patologicznym procesie choroby zwyrodnieniowej stawów. To założenie opiera się na następujących obserwacjach:

• IL-6 zwiększa liczbę komórek zapalnych w błonie maziowej,
• IL-6 stymuluje proliferację chondrocytów,
• IL-6 nasila działanie IL-1 w zwiększaniu syntezy MMP i hamowaniu syntezy proteoglikanów.

Jednakże, IL-6 jest w stanie indukować produkcję TIMP, ale nie ma wpływu na wytwarzanie MMP się zatem, że ta cytokina jest zaangażowany w proces ograniczania proteolitycznej degradacji chrząstki stawowej, która przeprowadzana jest za pomocą mechanizmu zwrotnego.

Innym przedstawicielem rodziny IL-6 jest LIF - cytokiną, która jest wytwarzana przez chondrocyty uzyskanych od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów, w odpowiedzi na stymulację cytokin prozapalnych IL-ip i TNF-a. LIF stymuluje resorpcję proteoglikanów chrząstki, a także syntezę produkcji MMP i NO. Rola tej cytokiny w chorobie zwyrodnieniowej stawów nie jest w pełni zrozumiała.

IL-17 to homodimer 20-30 kD o działaniu podobnym do IL-1, ale znacznie mniej wyraźny. IL-17 stymuluje syntezę i izolację szeregu prozapalnych cytokin, w tym IL-ip, TNF-α, IL-6 i MMP w komórkach docelowych, na przykład w ludzkich makrofagach. Ponadto, IL-17 stymuluje wytwarzanie NO z chondrocytami. Podobnie jak w przypadku LIF, rola IL-17 w patogenezie OA była w niewielkim stopniu badana.

Nieorganiczne wolne rodniki NO odgrywają ważną rolę w degradacji chrząstki stawowej z OA. Chondrocyty uzyskiwane od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów wytwarzają więcej NO tak samo spontanicznie, jak i po stymulacji cytokinami prozapalnymi w porównaniu z normalnymi komórkami. Wysoką zawartość NO można znaleźć w płynie maziowym i surowicy pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów - wynik zwiększonej ekspresji i syntezy indukowanej syntazy NO (hNOC), enzymu odpowiedzialnego za produkcję NO. Ostatnio sklonowano DNA swoistego dla chondrocytów hNOC, oznaczono sekwencję aminokwasową enzymu. Sekwencja aminokwasów wskazuje 50% identyczności i 70% podobieństwa do hNOC swoistych dla śródbłonka i tkanki nerwowej.

NO hamuje syntezę makrocząsteczek ECM chrząstki stawowej i stymuluje syntezę MMP. Ponadto zwiększeniu produkcji NO towarzyszy spadek syntezy antagonisty IL-IP (IL-1RA) przez chondrocyty. Zatem wzrost poziomu IL-1 i zmniejszenie ilości RA IL-1 prowadzi do hiperstymulacji NO chondrocytów, co z kolei prowadzi do zwiększonej degradacji macierzy chrząstki. Istnieją doniesienia o działaniu terapeutycznym in vivo selektywnego inhibitora hNOC na postęp eksperymentalnego zapalenia kości i stawów.

Naturalne inhibitory cytokin mogą bezpośrednio hamować wiązanie cytokin z receptorami błon komórkowych, zmniejszając ich aktywność prozapalną. Naturalne inhibitory cytokin można podzielić na trzy klasy zgodnie z ich sposobem działania.

Pierwsza klasa inhibitorów obejmuje antagonistów receptorów, które zapobiegają wiązaniu ligandu z jego receptorem przez rywalizację o miejsce wiązania. Do tej pory taki inhibitor stwierdzono tylko dla IL-1, wyżej wymienionego konkurencyjnego inhibitora układu IL-1 / ILIP IL-1 PA. IL-1 RA blokuje wiele z tych efektów, obserwowane są w tkankach stawów z zapaleniem kości i stawów, w tym w syntezie prostaglandyn przez komórki błony maziowej, produkcję kolagenazy przez chondrocyty i degradacja chrząstki w rząd.

IL-1PA wykrywa się w różnych postaciach - jednej rozpuszczalnej (rIL-1PA) i dwóch międzykomórkowych (μIL-lPAI i μIL-1APAP). Powinowactwo rozpuszczalnej formy IL-1RA jest pięciokrotnie większe niż w formach międzykomórkowych. Pomimo intensywnych poszukiwań naukowych funkcja tego ostatniego pozostaje nieznana. Eksperimety in vitro wykazano, że zahamowanie aktywności IL-1 beta wymaganego stężenia IL-1 Pa 10-100 razy przekraczających granicę w warunkach in vivo wymaga tysiąckrotnie wzrost stężenia IL-1 Pa. Fakt ten może częściowo wyjaśnić względny niedobór IL-1 RA i nadmiaru IL-1 w błonie maziowej pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.

Druga klasa naturalnych inhibitorów cytokin reprezentowana jest przez rozpuszczalne receptory cytokin. Przykładem takich inhibitorów u ludzi związanych z patogenezą zwyrodnienia stawów jest pIL-1P i pp55. Rozpuszczalne receptory cytokinowe są skróconymi postaciami normalnych receptorów, wiążących się z cytokinami, które zakłócają ich wiązanie z receptorami komórkowymi związanymi z błoną, działając przez mechanizm konkurencyjnego antagonizmu.

Głównym prekursorem rozpuszczalnych receptorów jest IL-1PP związany z błoną. Powinowactwo rIL-IP względem IL-1 i IL-1 PA jest różne. Tak więc, pIL-1PH ma większe powinowactwo do IL-1p niż do PA IL-1, a pIL-1PI wykazuje większe powinowactwo do IL-1RA niż do IL-ip.

W przypadku TNF występują również dwa typy rozpuszczalnych receptorów - pp55 i pp75, podobnie jak rozpuszczalne receptory IL-1, które powstają wskutek "odchwaszczania" (dumpingu). In vivo oba receptory znajdują się w tkankach dotkniętych stawów. Omówiono rolę rozpuszczalnych receptorów TNF w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów. Sugeruje się, że w niskich stężeniach stabilizują one trójwymiarową strukturę TNF i wydłużają okres półtrwania bioaktywnej cytokiny, podczas gdy wysokie stężenia pp55 i pp75 mogą zmniejszać aktywność TNF poprzez konkurencyjny antagonizm. Najwyraźniej pp75 może działać jako nośnik TNF, ułatwiając jego wiązanie z receptorem związanym z błoną.

Trzecią klasę naturalnych inhibitorów cytokin reprezentuje grupa cytokin przeciwzapalnych, które obejmują TGF-beta, IL-4, IL-10 i IL-13. Cytokiny przeciwzapalne zmniejszają produkcję prozapalnych, a także niektórych proteaz, stymulują wytwarzanie IL-1RA i TIMP.