Badania immunologiczne w urologii

Przepisanie immunogramu pacjentowi urologicznemu oznacza, że lekarz prowadzący podejrzewa występowanie zaburzeń w układzie odpornościowym. Nawracające infekcje bakteryjne, wirusowe, grzybicze, objawy alergiczne, choroby układowe mogą być objawami tych zaburzeń, które charakteryzują się szeregiem zespołów (zakaźnym, onkologicznym, alergicznym, autoimmunologicznym, limfoproliferacyjnym). U jednego pacjenta może występować kilka zespołów. Na przykład przewlekłe choroby zakaźne (zespół zakaźny) mogą powodować niedobór odporności, a niedobór odporności może objawiać się jako predyspozycja do chorób zakaźnych i onkologicznych (zespół onkologiczny). Predyspozycja do infekcji może występować na tle wtórnego niedoboru odporności, który rozwinął się w wyniku choroby limfoproliferacyjnej, takiej jak białaczka. Istnieją trzy główne grupy zmian patologicznych w układzie odpornościowym:

• niedobór ilościowy lub czynnościowy jednego lub drugiego ogniwa układu odpornościowego, prowadzący do rozwoju stanu niedoboru odporności;
• zaburzenie w rozpoznawaniu antygenów przez układ odpornościowy, prowadzące do rozwoju procesów autoimmunologicznych;
• nadreaktywna lub „zaburzona” odpowiedź immunologiczna, objawiająca się rozwojem chorób alergicznych.

Istnieją metody przesiewowe (testy poziomu 1) i wyjaśniające (testy poziomu 2) immunodiagnostyki. Pierwsze istnieją w celu rejestrowania zaburzeń w układzie odpornościowym, drugie - w celu ustalenia mechanizmów zaangażowanych w ich realizację w celu dalszej immunokorekcji.

Odporność komórek B

Metody przesiewowe

• Określenie względnej i bezwzględnej liczby limfocytów B przy użyciu immunofluorescencji lub cytofluorometrii przepływowej z przeciwciałami monoklonalnymi do antygenów komórek B (CD19, CD20, gdzie CD oznacza skupiska różnicowania). Normalna zawartość limfocytów B u dorosłych wynosi 8-19% całkowitej liczby leukocytów lub 190-380 komórek/μl. Wzrost zawartości limfocytów B występuje w ostrych i przewlekłych zakażeniach bakteryjnych i grzybiczych, przewlekłych chorobach wątroby, układowych chorobach tkanki łącznej, przewlekłej białaczce limfocytowej i szpiczaku.
• Oznaczanie stężenia niespecyficznych immunoglobulin (F, M, G, E) metodą prostej immunodyfuzji radialnej, nefelometrii lub turbometrii, radioimmunoanalizy lub immunoanalizy enzymatycznej (ELISA). Normy dla osób dorosłych: immunoglobulina (Ig)A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Wzrost stężenia immunoglobulin występuje w tych samych stanach patologicznych, w których występuje wzrost zawartości limfocytów B. Spadek stężenia immunoglobulin występuje we wrodzonej hipogammaglobulinemii, nowotworach układu odpornościowego, usunięciu śledziony, utracie białka, chorobach nerek lub jelit, leczeniu cytostatykami i lekami immunosupresyjnymi.

Metody wyjaśniające

• Oznaczanie krążących kompleksów immunologicznych we krwi poprzez selektywne wytrącanie w glikolu polietylenowym, a następnie badanie gęstości spektrofotometrycznej (norma 80-20 U). Wzrost krążących kompleksów immunologicznych jest typowy dla ostrych zakażeń bakteryjnych, grzybiczych, wirusowych, autoimmunologicznych, chorób kompleksów immunologicznych, choroby posurowiczej, reakcji alergicznych typu 3;
• Oznaczanie swoistych immunoglobulin we krwi w odniesieniu do antygenów bakteryjnych i wirusowych, kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) w chorobach autoimmunologicznych, wykrywanie przeciwciał przeciwplemnikowych (niepłodność autoimmunologiczna) i przeciwnerkowych (odmiedniczkowe zapalenie nerek i kłębuszkowe zapalenie nerek) metodą immunodyfuzji radialnej lub ELISA.
• Oznaczanie przeciwciał przeciwplemnikowych w plemnikach [test MAR (mieszana reakcja antyglobulinowa)], wynik prawidłowy - ujemny.
• Oznaczanie stężenia immunoglobulin w moczu w celu diagnostyki różnicowej odmiedniczkowego zapalenia nerek i kłębuszkowego zapalenia nerek (selektywność białkomoczu).
• Oznaczanie zawartości IgE w soku gruczołu krokowego w celu diagnostyki alergicznego zapalenia gruczołu krokowego metodą immunodyfuzji radialnej, czyli ELISA.
• Badanie odpowiedzi w reakcji transformacji blastycznej limfocytów B na mitogen komórek B (mitogen szkarłatki do stymulacji reakcji transformacji blastycznej limfocytów B w obecności limfocytów T), którego wartość normatywna wynosi 95-100%.

Powiązanie komórek T z odpornością

Metody przesiewowe

• Określenie względnej i bezwzględnej liczby dojrzałych limfocytów T CD3 metodą immunofluorescencyjną lub cytofluorometrią przepływową z użyciem monoklonalnych przeciwciał anty-CD3. Norma dla osób dorosłych wynosi 58-76% lub 1100-1700 komórek/μl. Spadek liczby limfocytów T jest wskaźnikiem niewydolności komórkowego ogniwa odporności. Jest to typowe dla niektórych wtórnych i pierwotnych niedoborów odporności (przewlekłe zakażenia bakteryjne i wirusowe: gruźlica, zespół nabytego niedoboru odporności, nowotwory złośliwe, przewlekła niewydolność nerek, urazy, stres, starzenie się, niedożywienie, leczenie cytostatykami, narażenie na promieniowanie jonizujące). Wzrost liczby limfocytów T występuje na tle nadaktywności immunologicznej lub w chorobach limfoproliferacyjnych. W przypadku stanu zapalnego liczba limfocytów T najpierw wzrasta, a następnie spada. Brak spadku liczby limfocytów T wskazuje na przewlekły proces zapalny.
• Ocena subpopulacji limfocytów.
  • Określenie liczby komórek pomocniczych T (przeciwciał anty-CD4). Normalnie 36-55% lub 400-1100 komórek/mcl. Wzrost liczby tych komórek występuje w chorobach autoimmunologicznych, chorobie Waldenströma, aktywacji odporności przeciwprzeszczepowej; spadek liczby komórek pomocniczych T występuje w przewlekłych zakażeniach bakteryjnych, wirusowych, pierwotniakowych, gruźlicy, zespole nabytego niedoboru odporności, nowotworach złośliwych, oparzeniach, urazach, niedożywieniu, starzeniu się, leczeniu cytostatykami, narażeniu na promieniowanie jonizujące.
  • Oznaczanie liczby supresorów T (przeciwciał anty-CD4). Zwykle 17-37% lub 300-700 komórek/μl. Wzrost liczby supresorów T występuje w tych samych warunkach, w których zmniejsza się liczba pomocniczych komórek T, a ich spadek występuje w tych samych warunkach, w których zwiększa się zawartość pomocniczych komórek T.
  • Indeks immunoregulacyjny CD4/CD8, normalnie 1,5-2,5. Nadaktywność z wartościami powyżej 2,5 (choroby alergiczne i autoimmunologiczne); hipoaktywność - poniżej 1,0 (skłonność do przewlekłych infekcji). Na początku procesu zapalnego indeks immunoregulacyjny wzrasta, a po jego ustąpieniu normalizuje się.

Metody wyjaśniające

• Oznaczanie liczby komórek NK (natural killers) - przeciwciała anty-CD16 i anty-CD56. Norma dla limfocytów CD 16 wynosi 6-26%, CD56 - 9-19%. Wzrost liczby komórek NK występuje podczas odrzucenia przeszczepu, spadek - przy infekcjach wirusowych, nowotworach, pierwotnych i wtórnych niedoborach odporności, oparzeniach, urazach i stresie, leczeniu cytostatykami i narażeniu na promieniowanie jonizujące.
• Oznaczanie liczby limfocytów T z receptorem dla interleukiny-2 (marker aktywacji) - przeciwciała anty-CD25. Norma wynosi 10-15%. Wzrost ich liczby obserwuje się w chorobach alergicznych, odrzuceniu przeszczepu, odpowiedzi na antygeny grasicy-zależne w ostrym okresie zakażenia pierwotnego, spadek - w tych samych chorobach, w których występuje spadek liczby komórek NK.
• Badanie ekspresji markera aktywacji - cząsteczki zgodności tkankowej klasy II HLA-DR. Zwiększona ekspresja występuje w procesach zapalnych, u pacjentów z zapaleniem wątroby typu C, celiakią, kiłą, ostrymi chorobami układu oddechowego.
• Ocena apoptozy limfocytów. Przybliżone pojęcie gotowości limfocytów do apoptozy można określić na podstawie ekspresji receptora Fas (CD95) na ich powierzchni i protoonkogenu bd-2 w mitochondriach. Apoptozę limfocytów ocenia się, traktując je dwoma barwnikami fluorescencyjnymi: jodkiem propidyny, który wiąże się z fragmentami DNA, oraz anektyną Y, która wiąże się z fosfatydyloseryną, która pojawia się na błonie komórkowej na początku apoptozy. Wyniki ocenia się za pomocą cytofluorometru przepływowego. Wyniki oblicza się na podstawie stosunku komórek barwionych różnymi barwnikami. Niebarwione komórki są żywe, komórki związane tylko z anektyną Y są wczesnymi objawami apoptozy, z jodkiem propidyny i anektyną Y są późnymi objawami apoptozy, barwienie tylko jodkiem propidyny wskazuje na martwicę.
• Ocena proliferacji limfocytów T in vitro.
  • Zmiany w blastogenezie komórkowej - reakcja blastycznej transformacji limfocytów. Leukocyty inkubuje się z dowolnym mitogenem pochodzenia roślinnego (lektynami). Fitohemaglutynina jest najczęściej stosowana przez 72 godziny, następnie pobiera się rozmaz, barwi i liczy liczbę blastów! Wskaźnik stymulacji to stosunek procentowej liczby transformowanych komórek w eksperymencie (hodowla z fitohemaglutyniną) do procentowej liczby transformowanych komórek w kontroli (hodowla bez fitohemaglutyniny). Reakcję blastycznej transformacji limfocytów można ocenić poprzez włączenie znacznika radioaktywnego (ZN-thymndinum) do hodowanych komórek, ponieważ synteza DNA wzrasta podczas podziału komórek. Zaburzenia odpowiedzi proliferacyjnej występują zarówno w pierwotnych, jak i wtórnych niedoborach odporności związanych z infekcjami, rakiem, niewydolnością nerek i interwencjami chirurgicznymi.
  • W tych badaniach oceniano ekspresję markerów aktywacji (CD25, receptor transferyny - CD71) i cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej klasy II HLA-DR, których praktycznie nie ma na spoczynkowych limfocytach T. Limfocyty T stymulowano fitohemaglutyniną, po 3 dniach analizowano ekspresję markerów aktywacji metodą bezpośredniej lub pośredniej reakcji immunofluorescencyjnej, cytofluorometrii przepływowej, stosując przeciwciała monoklonalne do izolowanych receptorów.
  • Pomiar ilości mediatorów syntetyzowanych przez aktywowane limfocyty T [interleukina (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon itp.] przy użyciu radioimmunologicznego testu lub ELISA. Szczególnie istotna jest ocena stężenia γ-interferonu i IL-4 jako markerów Th1 i Th2 w supernatancie aktywowanych kultur i wewnątrz komórki. Jeśli to możliwe, przydatne jest określenie ekspresji genu dla odpowiadającej cytokiny na podstawie poziomu kwasu rybonukleinowego macierzy w komórce produkującej i intensywności ekspresji receptorów dla odpowiadających cytokin.
    
• Reakcja hamowania migracji limfocytów. Uczulone limfocyty T w reakcji z antygenem wydzielają limfokiny, w tym czynniki hamujące migrację limfocytów. Zjawisko hamowania obserwuje się, gdy do hodowli komórkowej wprowadzane są mitogeny. Ocena stopnia hamowania pozwala nam ocenić zdolność limfocytów do wydzielania cytokin. Zwykle częstość migracji, w zależności od konkretnego mitogenu, wynosi 20-80%.
• Ocena cytotoksyczności komórek NK. Określa się zdolność komórek NK do zabijania komórek docelowych linii erytromieloidalnej K-562. Jeśli ocenia się cytotoksyczność zależną od przeciwciał, stosuje się komórki docelowe pokryte przeciwciałami IgG. Komórki docelowe znakuje się 3H-urydyną i inkubuje z komórkami efektorowymi. Śmierć komórek docelowych ocenia się poprzez uwolnienie znacznika radioaktywnego do roztworu. W nowotworach złośliwych obserwuje się spadek cytotoksyczności. W niektórych przypadkach, gdy konieczne jest przewidzenie skuteczności leczenia interleukinami, cytotoksyczność komórek NK ocenia się podczas inkubacji z niektórymi cytokinami.

Badanie funkcji fagocytów

Metody przesiewowe

Badanie intensywności absorpcji komórek drobnoustrojów przez fagocyty (fagocytoza cząstek lateksu, hodowla testowa gronkowców, E. coli lub drobnoustrojów wyizolowanych od pacjenta). Poprzez wirowanie krwi heparynizowanej izoluje się zawiesinę leukocytów, dodaje się surowicę grupy krwi IV w celu opsonizacji (opsoniny to białka, które wzmacniają fagocytozę). Zawiesinę drobnoustrojów rozcieńcza się, miesza z leukocytami i inkubuje przez 120 minut, pobierając próbki do analizy 30,90,120 minut po rozpoczęciu inkubacji. Z zebranej zawiesiny leukocytów wykonuje się rozmazy. Określa się następujące wskaźniki fagocytozy:

• indeks fagocytarny – odsetek komórek, które weszły w fazę fagocytozy w ciągu 30 min. i 120 min. inkubacji; standardowa wartość indeksu fagocytarnego (30) wynosi 94%, indeksu fagocytarnego (120) – 92%;
• liczba fagocytarna – średnia liczba bakterii znajdujących się wewnątrz komórki; normatywną wartością liczby fagocytarnej (30) jest 11%, a standardową wartością liczby fagocytarnej (120) jest 9,8%;
• współczynnik liczby fagocytów – stosunek liczby fagocytów (30) do liczby fagocytów (120); zwykle 1,16;
• Wskaźnik bakteriobójczy neutrofili – stosunek liczby drobnoustrojów zabitych wewnątrz fagocytów do całkowitej liczby wchłoniętych drobnoustrojów; zwykle wynosi 66%.

Metody wyjaśniające

• Badanie zdolności bakteriobójczej fagocytów w teście z nitrobłękitem tetrazolowym (NBT) - test NBT. Do leukocytów dodaje się żółty barwnik nitrobłękit tetrazolowy. Gdy neutrofil wchłonie barwnik, następuje proces redukcji pod wpływem wolnych rodników tlenowych, czego efektem jest niebieskie zabarwienie. Reakcję przeprowadza się w 96-dołkowej płytce płaskodennej. Do pierwszych trzech dołków z mieszaniną NBT i leukocytów dodaje się roztwór Hanksa (spontaniczny NBT), a do drugiego dodaje się cząsteczki lateksu; mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37 C przez 25 min. Wyniki odczytuje się przy 540 nm na czytniku i wyraża w dowolnych jednostkach. Oblicza się współczynnik stymulacji (K _st ), równy stosunkowi gęstości optycznej w dołkach stymulowanych do średniej gęstości optycznej w dołkach bez stymulacji. U osób zdrowych NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. Kst = _1,78 ±0,36.
• Badanie cząsteczek adhezyjnych. Cytofluorometria przepływowa jest stosowana do określania ekspresji antygenów powierzchniowych CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Niedobory odporności z upośledzoną adhezją objawiają się nawracającymi infekcjami, powolnym gojeniem się ran i brakiem ropy w ogniskach zakażenia.

Badanie układu dopełniacza

Metody przesiewowe

Oznaczanie aktywności hemolitycznej dopełniacza jest badaniem klasycznej ścieżki aktywacji dopełniacza. Do erytrocytów baranich pokrytych przeciwciałami dodaje się różne rozcieńczenia surowicy od osoby chorej i zdrowej. Jednostką aktywności hemolitycznej jest odwrotność rozcieńczenia surowicy, przy którym 50% erytrocytów ulega zniszczeniu. Stopień hemolizy szacuje się fotometrycznie poprzez uwolnienie hemoglobiny do roztworu. Spadek aktywności hemolitycznej dopełniacza obserwuje się w toczniu rumieniowatym układowym z uszkodzeniem nerek, ostrym kłębuszkowym zapaleniu nerek, mieszanych niedoborach odporności, miastenii, wirusowym zapaleniu wątroby, chłoniakach, wzrost - w żółtaczce obturacyjnej, zapaleniu tarczycy Hashimoto, reumatyzmie, reumatoidalnym zapaleniu stawów, guzkowym zapaleniu okołotętniczym. zapaleniu skórno-mięśniowym, zawale mięśnia sercowego, wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego, zespole Reitera, dnie moczanowej.

Metody wyjaśniające

• Oznaczanie składników dopełniacza. Oznaczanie ilościowe wykonuje się metodą immunodyfuzji radialnej i nefelometrii.
  Badanie nie jest informacyjne, jeśli nie zmienią się właściwości antygenowe składników dopełniacza.
• Ustalono, że składnik Clq dopełniacza wzmacnia fagocytozę i pośredniczy w cytotoksyczności komórkowej. Jego spadek występuje w chorobach kompleksów immunologicznych, toczniu rumieniowatym układowym, infekcjach ropnych i guzach.
• Składnik C3 bierze udział w aktywacji klasycznych i alternatywnych szlaków dopełniacza. Spadek jego stężenia jest związany z przewlekłymi zakażeniami bakteryjnymi i grzybiczymi, obecnością krążących lub tkankowych kompleksów immunologicznych.
• Składnik C4 bierze udział w aktywacji klasycznej ścieżki. Spadek jego stężenia jest związany z przedłużoną aktywacją dopełniacza przez kompleksy immunologiczne i spadkiem stężenia inhibitora C1, który kontroluje aktywację klasycznej ścieżki dopełniacza. Niedobór C4 występuje w toczniu rumieniowatym układowym, wzrost C4 występuje w chorobie nerek, odrzuceniu przeszczepu, ostrym zapaleniu i chorobach przewodu pokarmowego.
• C5a to niewielki fragment cząsteczki C5, który oddziela się od niej w wyniku aktywacji układu dopełniacza. Jego stężenie wzrasta w stanach zapalnych, sepsie, chorobach atopowych i alergicznych.
• Inhibitor Cl jest czynnikiem wielofunkcyjnym. Kontroluje aktywację składnika dopełniacza C1, hamuje aktywność kalikreiny, plazminy i aktywowanego czynnika Hagemana, proteaz Cls i Or. Niedobór inhibitora C1 prowadzi do obrzęku naczynioruchowego.
• badania funkcjonalne dopełniacza. Surowicę testową dodaje się do standardowej surowicy pozbawionej jakiegokolwiek składnika dopełniacza i określa się aktywność hemolityczną dopełniacza. Jeśli aktywność hemolityczna nie zostanie przywrócona do normy, aktywność tego składnika dopełniacza w surowicy testowej uważa się za zmniejszoną.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]